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Methodenartikel

Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

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DOI:

10.3791/61884

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27. Oktober 2020

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1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine effiziente Kollagenase-Verdauungsmethode für die Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktions-SVF-Zellen aus menschlichem viszeralem Fett in einem einzigen Prozess, einschließlich einer Methodik zur Gewinnung hochwertiger RNA aus Adipozyten und einer Phänotypisierung von SVF-Makrophagen durch Färbung mehrerer membrangebundener Marker für die Analyse durch Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Viszerales Fettgewebe (VAT) ist ein aktives Stoffwechselorgan, das hauptsächlich aus reifen Adipozyten und stromalen Gefäßfraktionszellen (SVF) besteht, die verschiedene bioaktive Moleküle freisetzen, die Stoffwechsel-, Hormon- und Immunprozesse steuern. Derzeit ist unklar, wie diese Prozesse im Fettgewebe reguliert werden. Daher ist die Entwicklung von Methoden zur Bewertung des Beitrags jeder Zellpopulation zur Pathophysiologie des Fettgewebes von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierungsschritte und enthält die notwendigen Richtlinien zur Fehlerbehebung für die effiziente Isolierung lebensfähiger reifer Adipozyten und SVF aus humanen VAT-Biopsien in einem einzigen Prozess unter Verwendung einer enzymatischen Kollagenase-Verdautechnik. Darüber hinaus ist das Protokoll auch für die Identifizierung von Makrophagen-Untergruppen und die Isolierung reifer Adipozyten-RNA für Genexpressionsstudien optimiert, was die Durchführung von Studien zur Analyse der Interaktion zwischen diesen Zellpopulationen ermöglicht. Kurz gesagt, VAT-Biopsien werden gewaschen, mechanisch zerkleinert und verdaut, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Nach der Zentrifugation werden reife Adipozyten durch Flotation aus dem SVF-Pellet isoliert. Das RNA-Extraktionsprotokoll gewährleistet eine hohe Ausbeute an Gesamt-RNA (einschließlich miRNAs) aus Adipozyten für nachgeschaltete Expressionsassays. Gleichzeitig werden SVF-Zellen verwendet, um Makrophagen-Untergruppen (pro- und antiinflammatorischer Phänotyp) durch Durchflusszytometrie-Analyse zu charakterisieren.

Einleitung

Weißes Fettgewebe besteht nicht nur aus Fettzellen oder Adipozyten, sondern auch aus einer fettfreien Zellfraktion, die als stromale vaskuläre Fraktion (SVF) bekannt ist und eine heterogene Zellpopulation enthält, die aus Makrophagen, anderen Immunzellen als regulatorische T-Zellen (Tregs) und Eosinophilen, Präadipozyten und Fibroblasten besteht, die von Gefäß- und Bindegewebe umgeben sind 1,2. Fettgewebe (AT) gilt heute als Organ, das physiologische Prozesse im Zusammenhang mit Stoffwechsel und Entzündung durch Adipokine, Zytokine und microRNAs reguliert, die von verschiedenen Zellen produziert und in das Gewebe freigesetzt werden, mit autokrinen, parakrinen und endokrinen Effekten 3,4. Beim Menschen umfasst weißes Fettgewebe das subkutane Fettgewebe (SAT) und das viszerale Fettgewebe (VAT) mit wichtigen anatomischen, molekularen, zellulären und physiologischen Unterschieden zwischen ihnen 2,5. SAT macht bis zu 80 % der menschlichen AT aus, während sich VAT in der Bauchhöhle befindet, hauptsächlich im Mesenterium und Omentum, und metabolisch aktiver ist6. Darüber hinaus ist VAT ein endokrines Organ, das Mediatoren absondert, die einen erheblichen Einfluss auf das Körpergewicht, die Insulinsensitivität, den Fettstoffwechsel und Entzündungen haben. Folglich führt die MwSt.-Akkumulation zu abdominaler Adipositas und Adipositas-bedingten Krankheiten wie Typ-2-Diabetes, metabolischem Syndrom, Bluthochdruck und kardiovaskulärem Erkrankungsrisiko, was einen besseren Prädiktor für die Adipositas-assoziierte Mortalität darstellt 6,7,8,9.

Unter homöostatischen Bedingungen arbeiten Adipozyten, Makrophagen und die anderen Immunzellen zusammen, um den VAT-Stoffwechsel durch die Sekretion entzündungshemmender Mediatoren aufrechtzuerhalten10. Eine übermäßige VAT-Expansion fördert jedoch die Rekrutierung von aktivierten T-Zellen, NK-Zellen und Makrophagen. Tatsächlich beträgt das Verhältnis der Makrophagen bei magerer Mehrwertsteuer 5 %, während dieses Verhältnis bei Fettleibigkeit auf bis zu 50 % ansteigt, wobei die Makrophagenpolarisation vom entzündungshemmenden zum entzündungsfördernden Phänotyp erfolgt und ein chronisch entzündliches Umfeld erzeugt10,11.

Als Folge der Adipositas-Pandemie ist eine erstaunliche Anzahl von Berichten entstanden, die sich mit verschiedenen VAT-Forschungsthemen befassen, darunter Adipozytenbiologie, Epigenetik, Entzündungen, endokrine Eigenschaften und neu entstehende Bereiche wie extrazelluläre Vesikel, unter anderem 8,10,12,13. Obwohl die VAT-Umgebung durch Crosstalk zwischen Adipozyten und den ansässigen oder ankommenden Makrophagen definiert wird, haben sich die meisten Studien nur auf eine Zellpopulation konzentriert, und es gibt nur wenige Informationen über die Interaktion dieser Zellen in VAT und ihre pathophysiologischen Konsequenzen11,14. Darüber hinaus wurden wertvolle Studien zum Adipozyten-Makrophagen-Zusammenspiel bei AT mit Zelllinien durchgeführt, denen die In-vivo-Priming-Bedingungen fehlten 11,14,15. Eine geeignete Strategie, um die Interaktion oder den besonderen Beitrag dieser Zellen bei VAT zu analysieren, erfordert die Isolierung beider Zelltypen aus derselben Fettbiopsie, um In-vitro-Assays durchzuführen, die die In-vivo-Eigenschaften, die den VAT-Stoffwechsel regulieren, so ähnlich wie möglich widerspiegeln.

Obwohl die nicht-enzymatischen Dissoziationsmethoden, die auf mechanischen Kräften zum Brechen des AT basieren, eine minimale Manipulation gewährleisten, können diese Methoden nicht verwendet werden, wenn das Ziel darin besteht, SVF-Zellen zu untersuchen, da sie im Vergleich zu enzymatischen Methoden eine geringere Effizienz bei der Zellrückgewinnung und eine geringe Zellviabilität aufweisen und ein größeres Gewebevolumen benötigt wird16,17. Der enzymatische Verdau mit Kollagenase ist eine schonende Methode, die einen adäquaten Verdau von Kollagen und extrazellulären Matrixproteinen von Fasergeweben wie WAT18 ermöglicht und häufig angewendet wird, wenn Trypsin unwirksam oder schädlich ist19. Das Protokoll enthält grundlegende Richtlinien zur Fehlerbehebung für die effiziente Isolierung lebensfähiger reifer Adipozyten und SVF-Zellen aus humanen VAT-Biopsien in einem einzigen Prozess unter Verwendung einer enzymatischen Kollagenase-Verdautechnik, die Informationen liefert, um eine hohe Ausbeute (Menge, Reinheit und Integrität) der Gesamt-RNA aus reifen Adipozyten, einschließlich microRNAs, für nachgelagerte Expressionsanwendungen zu gewährleisten. Gleichzeitig wird das Protokoll optimiert, um Makrophagen-Untergruppen aus SVF-Zellen durch die Färbung mehrerer membrangebundener Marker für die weitere Analyse durch Durchflusszytometrie20 zu identifizieren.

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom IRB des Instituto Nacional de Perinatologia genehmigt (212250-3210-21002-06-15). Die Teilnahme war freiwillig, und alle eingeschriebenen Frauen unterschrieben die Einwilligungserklärung.

1. Entnahme von viszeralem Fettgewebe

  1. Erhalten Sie VAT-Biopsien durch partielle Omentektomie während eines Kaiserschnitts von gesunden erwachsenen Frauen mit Einlingsschwangerschaften ohne Wehen.
  2. Identifizieren Sie nach dem Uterusverschluss und der Blutstillung das Omentum major und verlängern Sie es auf einer feuchten Kompresse. Der exponierte AT ist die Mehrwertsteuer.
  3. Suchen Sie das größte Blutgefäß und verfolgen Sie eine imaginäre Linie von 7 x 5 cm bis zur großen Omentumbasis.
  4. Identifizieren Sie eine avaskuläre Zone und bohren Sie mit einer Kelly-Pinzette die Außenseite von VAT.
  5. Verwenden Sie eine Ochsner-Pinzette, um die proximale und distale Seite in der Zone zu klemmen, in der VAT gebohrt wurde, und verwenden Sie eine Metzenbaum-Schere, um das Gewebe zu schneiden.
  6. Binden Sie das Omentum mit schwarzer Seide Nummer 1 zusammen.
  7. Entfernen Sie die Ochsner-Pinzette und beurteilen Sie die Blutstillung.
  8. Legen Sie die VAT-Biopsie in einen sterilen Behälter und transportieren Sie sie sofort ins Labor.

2. Enzymatische Verdauung von viszeralem Fettgewebe und Isolierung von reifen Adipozyten und stromalen Gefäßfraktionszellen

  1. Wiegen Sie die Mehrwertsteuerbiopsie und spülen Sie sie mit 1x PBS pH 7,4.
  2. Schneiden Sie 4 g MwSt. ab und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Schere in einer Sezierschale in kleine Stücke.
  3. Übertragen Sie die zerkleinerte Mehrwertsteuer in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 20 ml PBS hinzu und schütteln Sie es vorsichtig, um den Überschuss an roten Blutkörperchen zu entfernen.
  4. Verwerfen Sie PBS und wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
  5. Übertragen Sie die Mehrwertsteuer auf ein neues steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 25 ml Aufschlusslösung hinzu (0,25 % Kollagenase Typ II, 5 mM Glukose, 1,5 % Albumin in PBS).
  6. 60 min bei 37 °C in einem Orbitalschüttler bei 125 U/min inkubieren.
  7. Filtern Sie das verdaute Gewebe durch drei Schichten Gaze in ein neues steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
  8. Bei 200 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  9. Es werden zwei Phasen erhalten, eine obere Phase, die reifen Adipozyten entspricht, während SFV-Zellen im Pellet verbleiben. Übertragen Sie die reifen Adipozyten vorsichtig mit einer Transferpipette in ein neues steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
  10. 20 ml kaltes PBS hinzufügen, leicht schütteln und bei 200 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  11. Verwerfen Sie PBS und wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
  12. Verwenden Sie eine Transferpipette, um die reifen Adipozyten vorsichtig in ein 1,5 ml DNase-RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen.
  13. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 1 min bei 4 °C und entfernen Sie das überschüssige PBS mit einer P200-Mikropipette. Wiederholen Sie diesen Schritt bei Bedarf.
  14. Übertragen Sie vorsichtig 300 μl reife Adipozytensuspension in ein 1,5 ml DNase-RNase-freies Mikrozentrifugenröhrchen. Reife Adipozyten bis zur RNA-Extraktion bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Adipozyten bilden kein Pellet.
  15. Nach der Trennung der Adipozyten (Schritt 2.9) wird der größte Teil der Aufschlusslösung mit einer Transferpipette abgesaugt, wobei das SVF-Pellet am Boden des Röhrchens verbleibt.
  16. Übertragen Sie das Pellet mit SVF-Zellen mit einer Transferpipette in ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
  17. Waschen Sie das Zellpellet vorsichtig und resuspendieren Sie es in 20 ml kaltem 1x PBS durch Auf- und Abpipettieren.
  18. Bei 800 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand durch Dekantieren schnell verwerfen.
  19. Führen Sie eine zweite Wäsche durch, indem Sie die Schritte 2.17 und 2.18 wiederholen.
  20. Geben Sie 5 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen, der auf Raumtemperatur (RT) äquilibriert ist, zum SVF-Pellet und suspendieren Sie es durch wiederholtes Pipettieren. Nicht wirbeln.
  21. 5 min bei RT inkubieren und 5 min bei 800 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Transferpipette und entsorgen Sie ihn ordnungsgemäß.
  22. Um den Lysepuffer zu neutralisieren, fügen Sie 10 ml kaltes 1x PBS hinzu und mischen Sie vorsichtig, bis das Zellpellet disaggregiert ist.
  23. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 800 x g , um SVF-Pellet zu erhalten und PBS zu verwerfen. Ein weißes Kügelchen sollte am Boden des Rohrs sichtbar sein.
  24. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml 1x PBS bei RT durch wiederholtes Pipettieren und filtrieren Sie durch drei Schichten Gaze in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen. Anschließend werden diese Zellen für die Charakterisierung von Makrophagen-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie verwendet.

3. RNA-Extraktion aus reifen Adipozyten

  1. Bereiten Sie einen sauberen Bereich mit RNase-Dekontaminationsspray vor, um einen RNA-Abbau zu vermeiden. Verwenden Sie einen Satz Pipetten, die für RNA-Verfahren reserviert sind. Alle verwendeten Röhrchen und Spitzen sollten RNase-frei sein.
  2. Die reife Adipozytensuspension (Abschnitt 2.14) wird bei 4 °C aufgetaut, wenn sie bei -80 °C gelagert wurde.
    Anmerkungen: Vermeiden Sie mehrere Gefrier-Tau-Zyklen.
  3. Lysieren Sie die Zellen durch Zugabe von 1.000 μl Reagenz auf Säure-Guanidinium-Phenol-Basis und mischen Sie sie gründlich mit einer P1000-Mikropipette, um sie zu homogenisieren.
  4. 5 Minuten bei RT inkubieren, um die Dissoziation von Nukleoproteinkomplexen zu fördern.
  5. Zelllysat 5 min bei 12.000 x g bei RT zentrifugieren. Es werden drei Phasen erhalten: eine obere Phase (gelb) für Adipozytenlipide, eine mittlere Phase (rosa) für Nukleinsäuren und ein Pellet (Zelltrümmer).
  6. Entfernen Sie vorsichtig die Lipidschicht mit einer P200-Mikropipette.
  7. Übertragen Sie die mittlere Phase in ein neues 2-ml-Röhrchen, um Lipidreste und Pellets zu vermeiden (ca. 700 μl).

4. Aufreinigung von Gesamt-RNA, einschließlich microRNAs

HINWEIS: Eine säulenbasierte Gesamt-RNA-Aufreinigungsmethode wird verwendet, um qualitativ hochwertige Gesamt-RNA zu erhalten.

  1. Geben Sie der Probe aus Abschnitt 3.7 ein gleiches Volumen Ethanol (95 % bis 100 %), ca. 700 μl, und mischen Sie das Röhrchen 10 s lang von Hand.
  2. 700 μl des Gemisches werden in eine Säule gegeben, die in ein Sammelröhrchen eingesetzt wird, zentrifugiert und der Durchfluss verworfen.
  3. Laden Sie die Spalte neu und wiederholen Sie Schritt 4.2.
  4. Übertragen Sie die Säule in ein neues Sammelröhrchen.
  5. 400 μl Pre-Wash-Puffer in die Säule geben und zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie diesen Schritt.
  6. 700 μl Waschpuffer in die Säule geben und 2 Minuten zentrifugieren.
  7. Übertragen Sie die Säule vorsichtig in ein nukleasefreies Röhrchen.
  8. Geben Sie 50 μl nukleasefreies Wasser direkt in die Säulenmatrix und eluieren Sie die RNA durch Zentrifugation. Bereiten Sie Aliquots von 10 μl mit 200 μl Mikrofugenröhrchen vor.
  9. Legen Sie die Aliquote sofort auf Eis und verwenden Sie eines davon, um die RNA-Konzentration und -Reinheit zu bestimmen.
  10. Bereiten Sie ein Aliquot von 5 μl Gesamt-RNA vor, das auf 100 ng/μl eingestellt ist, um die RNA-Integrität und die microRNA-Konzentration zu messen.
  11. Bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.

5. Bestimmung der Konzentration, Reinheit und Integrität der reifen Adipozyten-RNA; microRNA-Quantifizierungs-Assay

HINWEIS: RNA-Konzentrations- und Reinheitsbestimmungen werden mit einem UV-Vis-Spektralphotometer durchgeführt; Die RNA-Integrität und die miRNA-Quantifizierung werden mit einem RNA-Qualitätskontrollanalysator durchgeführt.

  1. Waschen Sie das Probenlesegerät mit Wasser in molekularer Qualität und wischen Sie es ab.
  2. Laden Sie 2 μl Elutionswasser (leer), ändern Sie die Einstellung auf RNA und klicken Sie auf die Schaltfläche Leer.
  3. Laden Sie 2 μl Probe und klicken Sie auf die Schaltfläche Messen .
  4. Notieren Sie nach Abschluss der Messung die Verhältnisse A260/A280 und A260/A230 sowie die RNA-Menge (ng/μl) (Abbildung 1A).
    HINWEIS: RNA mit einem OD260/OD280- und OD260/OD230-Verhältnis von etwa 2,0 gilt als rein.
  5. Messen Sie die RNA-Integritätszahl (RIN) mit einem RNA-Integritätskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 1B).
    HINWEIS: EIN RIN =10 entspricht einer intakten RNA, während ein RIN ≤ 3,0 auf eine stark abgebaute RNA hinweist. Verwenden Sie für Expressions-Microarrays oder RT-qPCR RNA mit RIN ≥ 6.0.
  6. Verwenden Sie ein kleines RNA-Kit, um die Konzentration und den Prozentsatz der microRNAs gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Um eine Überschätzung von kleinen und Mikro-RNAs zu vermeiden, verwenden Sie RNA-Proben mit RIN ≥ 6.0.

6. Anzahl und Lebensfähigkeit von stromalen vaskulären Fraktionszellen

  1. 10 μl SVF-Zellsuspension (Abschnitt 2.24) in 90 μl 0,4%ige Trypanblaulösung (Endverdünnung 1:10) verdünnen und 10 μl auf ein Standard-Hämozytometer auftragen.
  2. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen sorgfältig, mit Ausnahme der toten Zellen, in vier Quadraten an der Ecke der Zählkammer.
  3. Bestimmen Sie die in der ursprünglichen Suspension vorhandene Zellkonzentration: Zellkonzentration = Gesamtzellzahl/4 x Verdünnungsfaktor (10) x 10.000 = Zellen/ml
  4. Um die erhaltene Zellausbeute (Zellen pro Gramm Gewebe) zu berechnen, multiplizieren Sie die Zellkonzentration mit dem ursprünglichen Gesamtprobenvolumen (in ml) und dividieren Sie sie durch das Gewicht des verdauten Gewebes (in Gramm).
  5. Bewerten Sie die Zellviabilität als Prozentsatz der lebenden Zellen wie folgt: % Viabilität = (Anzahl lebensfähiger Zellen / Gesamtzahl der Zellen) x 100.

7. Charakterisierung von Makrophagen-Untergruppen aus der stromalen Gefäßfraktion

  1. Insgesamt 1 x 106 SVF-Zellen/ml werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 5 min bei 4 °C in ein 5-ml-Reagenzglas aus Polypropylen mit rundem Boden für die Durchflusszytometrie und Pelletzellen überführt.
  2. Vorsichtig vortexen, um das Pellet zu lösen und die Zellen in 100 μl 1x PBS bei RT zu resuspendieren.
  3. Fügen Sie die vortitrierte optimale Konzentration jedes Fluorochrom-konjugierten monoklonalen Antikörpers hinzu, der für ein Zelloberflächenantigen spezifisch ist; vorsichtig mischen und 15 min im Dunkeln bei RT inkubieren.
  4. Fügen Sie einen Überschuss an kaltem 1x PBS (≈ 1 ml) hinzu und zentrifugieren Sie das SVF bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
  5. Überstände schnell durch Dekantieren entsorgen. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
  6. 500 μl 1x Lysinglösung zugeben und 15 min bei RT inkubieren, wobei die Röhrchen vor direktem Licht geschützt werden.
  7. Entfernen Sie die Lösung nach dem Zentrifugieren bei 400 x g für 5 min bei 4 °C und lagern Sie sie bei 2–8 °C im Dunkeln bis zur Datenerfassung.
  8. Wirbeln Sie die Zellen gründlich bei niedriger Geschwindigkeit durch, um die Aggregation vor der Aufnahme zu reduzieren.
  9. Resuspendieren Sie das SVF-Pellet in 5 ml Mantelflüssigkeit bei RT und filtrieren Sie anschließend durch drei Schichten Gaze in ein neues 5-ml-Polypropylen-Reagenzglas mit rundem Boden, bevor Sie es durchflusszytometrisch analysieren, um die Verstopfung der Zellsortierlinien zu reduzieren.
  10. Wirbeln Sie jedes Röhrchen kurz vor der Analyse ein.
  11. Erfassen Sie Daten aus den interessierenden Proben. Zählen Sie für die Flussanalyse mindestens 10.000 Ereignisse.
    HINWEIS: Wenn Sie ein Zellsortier-Durchflusszytometer verwenden, trennen Sie die Makrophagen für die Anwendung in nachfolgenden Studien.

8. Gating-Strategie

  1. Zeichnen Sie die Höhe oder Breite gegen die Fläche für die Vorwärtsstreuung (FSC), um die Singulettpopulation zu bestimmen (Abbildung 2A).
  2. Wählen Sie Zellen aus, die die Fläche für Side Scatter (SSC) gegen FSC darstellen und die Zelltrümmer verwerfen (Abbildung 2B).
  3. Identifizieren Sie aus ausgewählten Zellen die Populationen, die CD45 exprimieren, als hämatopoetische Zellen (Abbildung 2C) und CD45/CD14-doppelpositive Zellen als Makrophagen (Abbildung 2D).
  4. Erkennen Sie aus CD45+/CD14+-Makrophagen negative und positive HLA-DR-Zellen (Abbildung 2E).
    HINWEIS: Schließen Sie die Kompensationssteuerelemente für das Antikörperpanel ein und stellen Sie die spektrale Überlappung auf einem für das Panel geeigneten Mehrfarben-Durchflusszytometer ein. Wir führen eine Durchflusszytometrie-Analyse mit einem Zytometer durch, das mit drei Lasern (405 nm violetter Laser, 488 nm blauer Laser und 640 nm roter Laser) und Detektoren für die angezeigten Fluorochrome ausgestattet ist.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt eine enzymatische Methode, bei der Kollagenase-Verdau gefolgt von einer differentiellen Zentrifugation verwendet wird, um in einem einzigen Prozess lebensfähige reife Adipozyten und SVF-Zellen aus VAT-Biopsien zu isolieren, die von gesunden schwangeren Frauen nach partieller Omentektomie gewonnen wurden. In diesem Fall verwenden wir die Adipozyten für die RNA-Extraktion und die SVF für die Makrophagen-Phänotypisierung.

Das RNA-Extraktionsprotokoll ermöglichte es, RN...

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Diskussion

VAT spielt eine entscheidende Rolle bei der Stoffwechselregulation und Entzündung. Das zunehmende Interesse an der Rolle von Adipozyten und Immunzellen bei der chronischen Entzündung im Zusammenhang mit Fettleibigkeit hat zur Entwicklung verschiedener Techniken zur Trennung der in AT vorhandenen SVF- und Fettzellen geführt. Die meisten Techniken erlauben es jedoch nicht, diese beiden unterschiedlichen Zellgruppen, die für Downstream-Anwendungen geeignet sind, aus derselben VAT-Biopsie in einem einzigen Verfahren zu erhal...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde vom Instituto Nacional de Perinatologia (Fördernummer: 3300-11402-01-575-17 und 212250-3210-21002-06-15) und CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (Fördernummer 2015-3-2-61661) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 mL PCR-RöhrchenAxygenPCR-02-CRNase, DNase frei und pyrogenfrei
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenAxygenMCT-150-CRNase, DNase frei und pyrogen
10 mL serologische PipettenCorningCLS4101-50EAEinzeln in Plastik verpackt
10 & Mikro; L universelle PipettenspitzeAxygenT-300-L-RRNase, DNasefrei und pyrogenfrei
10 & micro; L Universal-PipettenspitzeAxygenT-300-R-SRNase, DNase-frei und pyrogenfrei
1000 & Mikro; L universelle PipettenspitzeAxygenT-1000-B-RRNase, DNase-frei und pyrogenfrei
2,0 mL MikrozentrifugenröhrchenAxygenMCT-200-CRNase, DNasefrei und pyrogenfrei
200 & Mikro; L Universal-PipettenspitzeAxygenT-200-Y-RRNase-, DNase-frei und pyrogenfrei
2100 Bioanalysator InstrumentAgilent
G2939BA-2101 Bioanalysator PCAgilentG2953CA2100 Expert Software im PC vorinstalliert
5 ml Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem BodenCorning352003 Schnappverschluss, steril
50 mL ZentrifugenröhrchenCorningCLS430828-100EAPolipropilen, konischer Boden und steriles
Reagenz auf Säure-Guanidinium-Phenol-BasisZymo ResearchR2050-1-200TRI Reagenz oder ähnliches
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511-Agilent
Small RNAKit Agilent5067-1548-APC
/Cy7 Anti-Human-CD14-AntikörperBioLegend3256200,4 mg/106 Zellen, vorhanden auf Monozyten/Makrophagen, Klon HCD14
Baker--250 ml, unsteriles
RinderserumalbuminSigma-AldrichA3912-100GHitzeschockfraktion, pH 5,2, ≥ 96%
Chip PrimingStation Agilent5065-9951-Kollagenase
Typ IIGibco17101-015Pulver
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichG8270-100GPulver
Direct-zol RNA MiniprepZymo ResearchR2051Lieferung mit 50 mL TRI reagen
Präparierzange-Stahl, gezackte Backen und rund Enden
Sezierschale-Edelstahl
EthylalkoholSigma-AldrichE7023-500ML200  proof, für die Molekularbiologie
FACS Flow Sheath FluidBD Biosciences342003-FACS
Lysing SolutionBD Biosciences
349202-FACSAria III Flow Cytometer/Cell SorterBD Biosciences
648282-FASCDiva SoftwareBD Biosciences642868Software v6.0 vorinstalliertes
HämazytometerSigmaZ359629-1EA-
Manueller Zellzähler---
Mayo-Präparierschere-
Mikrozentrifuge-Einstellbare Temperatur
Nanotropfen-SpektralphotometerThermo ScientificND2000LAPTOP-Orbitalschüttler
-Einstellbare Temperatur und Geschwindigkeit
P10  variables Volumen  Mikropipette Thermo Scientific-Finnpipette46420401 bis 10 μ; L
P1000  variables Volumen  Mikropipette Thermo Scientific-Finnpipette4642090100 bis 1000 μm L
P2  variables Volumen  Mikropipette Thermo Scientific-Finnpipette46420100,2 bis 2 μ; L
P200  variables Volumen  Mikropipette Thermo Scientific-Finnpipette464208020 bis 200 μm L
PCR-Röhrchen-AufbewahrungsgestellAxygen
R96PCRFSP-PE/Cy5 Anti-Human-HLA-DR-AntikörperBioLegend3076080,0625 mg/106Zellen, vorhanden auf Makrophagen, Klon L243
PE/Cy7 Anti-Human-CD45-AntikörperBioLegend3040160,1 mg/106Zellen, vorhanden auf Leukozyten, Klon H130
Phosphat gepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichP3813-10PAKPulver, pH 7,4, zur Herstellung von 1 l Lösungen
Pipettensteuerung---
Lysepuffer für rote BlutkörperchenRoche11 814 389 001Für die bevorzugte Lyse von roten Blutkörperchen aus menschlichem Vollblut
Gekühlte Zentrifuge--Mit Adapter für konische 50-ml-Röhrchen
Steriler Probenbehälter---
TransferpipetteThermo Scientific-Samco204-1SSteriles
Trypan BlueGibco15250-0610,4 % Lösung
Röhrchengestelle-Für verschiedene Röhrchengrößen
Vortex Mini ShakerCientifica SENNABV101-
aus Edelstahl

Referenzen

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  2. Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
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