Optimierung des Wachstums von Endothiapepsin-Kristallen für serielle Kristallographie-Experimente

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Artikels ist es, dem Betrachter ein solides Verständnis dafür zu vermitteln, wie sein kleinvolumiges Dampfdiffusionsprotokoll für die Züchtung großer, einzelner Proteinkristalle in eine großvolumige Batch-Mikrokristallisationsmethode für die serielle Kristallographie umgewandelt werden kann.

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird ein Protokoll vorgestellt, das die Herstellung großer Volumina (> 100 μl) mikrokristalliner Schlämme erleichtert, die für serielle Kristallographie-Experimente sowohl an Synchrotrons als auch an XFELs geeignet sind. Die Methode basiert auf dem Verständnis des Phasendiagramms von Proteinkristallen und wie dieses Wissen genutzt werden kann. Die Methode gliedert sich in drei Phasen: (1) Optimierung der Kristallmorphologie, (2) Übergang zum Batch und (3) Skalierung. In Stufe 1 geht es darum, gut gebeugte Einkristalle zu finden, die hoffentlich, aber nicht notwendigerweise, in einer würfelartigen Morphologie vorliegen. In Stufe 2 wird die Bedingung der Stufe 1 durch die Kristallwachstumszeit optimiert. Mit dieser Strategie können Kristalle, die durch Dampfdiffusion gezüchtet wurden, in Batch-Kristalle umgewandelt werden. Sobald das Kristallwachstum innerhalb von ca. 24 h erfolgen kann, kann ein Morphogramm des Protein-Fällmittel-Gemisches aufgetragen und als Grundlage für eine Skalierungsstrategie verwendet werden (Stufe 3). Wenn Kristalle in Batches gezüchtet werden können, kann versucht werden, sie zu skalieren, und die Kristallgröße und -konzentration kann optimiert werden, wenn das Volumen erhöht wird. Endothiapepsin wurde als Demonstrationsprotein für dieses Protokoll verwendet. Einige der vorgelegten Entscheidungen sind spezifisch für Endothiapepsin. Es ist jedoch zu hoffen, dass die Art und Weise, wie sie angewendet wurden, zu einer Denkweise über dieses Verfahren anregen wird, die andere an ihre eigenen Projekte anpassen können.

Einleitung

Die makromolekulare Kristallographie bei Raumtemperatur (RT) ist in der Strukturbiologie wieder beliebt. Die Entwicklung von Röntgen-Freie-Elektronen-Laser-Lichtquellen (XFEL) hat die Entwicklung von RT-Probentransportansätzen 1,2,3,4 vorangetrieben, und diese Methoden wurden nun auf die Synchrotrons 5,6,7,8 angewendet. RT-Methoden eröffnen nicht nur die Möglichkeit von experimentellen Pump-Probe-Lösungen 9,10,11,12, sondern es gibt auch immer mehr Hinweise darauf, dass sie alternative Konformationszustände innerhalb der Proteine 13,14,15,16,17 fördern.

Der Hauptgrund, warum Kryomethoden in den späten 1990er Jahren gegenüber RT-Ansätzen an Bedeutung gewannen, war jedoch die Verlangsamung der Strahlenschäden durch Kristalltemperaturen unter dem Gefrierpunkt¹⁸. Kryo-Methoden¹⁹ ermöglichten die Erfassung eines vollständigen Datensatzes aus einem einzelnen Proteinkristall. Moderne RT-Methoden an XFELs und Synchrotrons lösten das Problem der Schädigung durch einkristalline Strahlung durch die Entwicklung schneller (> 100 Hz) Kristalltransportstrategien 1,2,3,4. Diese Methoden ermöglichen die Sammlung eines vollständigen Datensatzes aus Tausenden von einzeln belichteten Kristallen. Diese RT-Verabreichungsansätze erfordern daher die Herstellung großer Mengen von Lösungen, die homogene Mikrokristalle enthalten (> 100 μl < 50 μm Kristalle). Da Kryo-Methoden jedoch in der Regel nur Einkristalle benötigen, sind Methoden zur Herstellung solcher mikrokristallinen Schlämme derzeit in Proteinkristallographie-Labors nicht allgegenwärtig.

In der Literatur gibt es Beispiele, wie Teile des Mikrokristallisationsoptimierungsverfahrens für serielle Kristallographieproben durchgeführt werden können. Hierbei ist zwischen membranartigen und löslichen Proteinen zu unterscheiden. Protokolle zur Optimierung des Wachstums von Mikromembranproteinkristallen, die in Monoolein (oder einem anderen Lipid) gezüchtet wurden, für die lipidkubische Phase (LCP) wurden gut beschrieben 20,21,22. Es fehlen jedoch Methoden zur Mikrokristallisation löslicher Proteine, einschließlich Membranproteinen, die unter Nicht-LCP-Bedingungen gezüchtet wurden. Frühere Studien konzentrierten sich auf bestimmte Teile des Prozesses, wie z. B. das Mikrokristall-Screening 23,24, die Verbesserung der Keimbildung²⁴ und die Skalierung mit freier Grenzflächendiffusion ²⁵, jedoch nicht auf eine vollständige Methode.

Kürzlich wurde jedoch ein Verfahren²⁶ beschrieben, das versucht, ein vollständiges Protokoll anzubieten. Wie viele Aspekte der Proteinkristallographie ist sie nicht neu. Viele der vorgeschlagenen Ideen wurden bereits von Rayment (2002)²⁷ beschrieben. Die Methode soll Kristallographen zeigen, wie sie die Umwandlung von einem einzelnen, durch Dampfdiffusion gezüchteten Kristall in eine Batch-Methode durchführen können, um Tausende von Mikrokristallen zu züchten. Die Methode konzentriert sich auf die Dampfdiffusion als gemeinsamen Ausgangspunkt, da 95 % aller Ablagerungen in der Proteindatenbank (PDB) von Kristallen stammen, die in Dampfdiffusionsplatten gezüchtet wurden²⁶. Die Dampfdiffusion ist jedoch nicht die ideale Methode für die Mikrokristallisation²⁶, daher wird eine Methode beschrieben, um die Dampfdiffusion in die Batch-Kristallisation umzuwandeln. Sobald Kristalle in Batches gezüchtet werden können, wird die Skalierung auf größere Volumina praktikabler. Angesichts der Unwägbarkeiten der Proteinkristallisation betonen die Autoren, dass diese Methode nicht ausfallsicher ist. Das Protokoll soll aber zumindest einen Einblick in den "Kristallisationsraum" eines Proteins geben.

Diese Methode stützt sich auf das Phasendiagramm der Proteinkristallisation und darauf, wie das Verständnis dieses Diagramms als Leitfaden für die Optimierung der Mikrokristallisation dienen kann. Ein Proteinphasendiagramm wird üblicherweise als x/y-Diagramm mit Fällmittel- und Proteinkonzentrationen auf der x- bzw. y-Achse dargestellt (Abbildung 1A). Vom Reinwasserpunkt (untere linke Ecke - Abbildung 1A) steigt die Konzentration von Protein und Fällungsmittel an, bis die Löslichkeitslinie erreicht ist. Die Löslichkeitslinie markiert den Punkt der Übersättigung (violette Linie - Abbildung 1A). Wenn ein Protein übersättigt ist, wird die Lösung thermodynamisch instabil und beginnt sich in zwei Phasen zu trennen: "proteinreich" und eine stabile gesättigte Lösung. Diese Trennung kann überall jenseits der Löslichkeitsgrenze stattfinden und ihre Kinetik hängt von den Eigenschaften des Proteins und den Bestandteilen der Lösung ab.

Wenn die Protein- und Fällmittelkonzentrationen zu hoch sind, zersetzt sich das Protein instabil aus der Lösung und führt zu amorphem Niederschlag (rosa Bereich - Abbildung 1A). Es kann jedoch zu einer geordneten Phasentrennung im Nukleationsbereich kommen [siehe Garcia-Ruiz (2003)²⁸ für eine detaillierte Beschreibung] und Kristallnukleanten neigen zur Bildung (grüner Bereich - Abbildung 1A). Durch Keimbildung und Wachstum wird das Protein aus der Lösung entfernt und der Tropfen in die metastabile Region verschoben, wo das Wachstum fortgesetzt werden kann, bis die Löslichkeitslinie erreicht ist [siehe McPherson und Kuznetsov (2014)²⁹ für eine detaillierte Diskussion]. Das Diagramm ist für die überwiegende Mehrheit der Kristallisationsbedingungen eine grobe Vereinfachung³⁰. Unabhängig davon ist das Diagramm jedoch für Mikrokristallographen von großem Nutzen, da die Abbildung des Diagramms die Bestimmung der Löslichkeitslinie und der Kinetik der Keimbildung ermöglicht.

Bei der Erzeugung von Mikrokristallen sind die beiden Faktoren, die während der Kristallisation optimiert werden müssen, die Anzahl der Kristalle (X_n) und ihre mittlere, längste Abmessung (X_s). X n ist proportional zur Anzahl der Nukleationsereignisse (_n ) (Gl. 1).

     Gl. 1

X s ist proportional zur Konzentration des freien Proteins oberhalb der Löslichkeitslinie (P_s) dividiert durch X_n (Gl. 2).

     Gl. 2

In einer perfekten Situation würde jedes Nukleationsereignis einen möglichen Kristall ergeben und jeder dieser Kristalle hätte den gleichen Zugang zu dem verfügbaren Protein in Lösung. Abbildung 2 ist eine grafische Darstellung eines Idealszenarios der Beziehung zwischen X_n und X_s. In der Praxis besteht die Hauptkontrolle, die ein Kristallograph über X_n und X_s hat, in der Beeinflussung des Umfangs der Keimbildung oder in der Zugabe von Impfkristallen. Der Mikrokristallograph muss beurteilen, wie X_n so erhöht werden kann, dass sowohl eine geeignete Kristallkonzentration als auch eine geeignete Kristallgröße erzeugt werden können.

Die meisten Kristallisationstechniken erfordern eine "Übergangszeit" (Abbildung 1B). Zum Beispiel ändern sich in einem Dampfdiffusionsexperiment beim Mischen der Protein- und Fällmittellösungen die Konzentrationen beider, wenn sich der Tropfen mit der Well-Lösung ausgleicht. Es ist zu hoffen, dass diese Veränderungen den Tropfen allmählich in die Nukleationszone überführen, in der die Neigung zur Kristallisation zunimmt. Wenn Kristalle zu keimen und zu wachsen beginnen, beginnt die Menge des Proteins in Lösung zu sinken, was die Wahrscheinlichkeit einer weiteren Keimbildung verringert. Das endgültige Ausmaß der Nukleation ist protein- und bedingungsspezifisch und hängt auch von der Eindringtiefe in die Nukleationszone ab. Angesichts der begrenzten Durchdringung der Nukleationszone von Methoden, die einen Übergangsschritt erfordern, wird der Grad der Keimbildung letztendlich auf die Keimbildungsrate an der Grenze zwischen metastabiler und nukleatorischer Region begrenzt sein.

Da es für einen Mikrokristallographen wichtig ist, das Niveau der Keimbildung zu verbessern, ist es wichtig, zu einer Batch-Kristallisationsmethode überzugehen. Batch kann die gesamte Nukleationsregion besser nutzen (Abbildung 1C). Bei der Batch-Methode geht es darum, Protein und Fällungsmittel so miteinander zu vermischen, dass eine übersättigte Lösung entsteht, ohne dass die Komponentenkonzentrationen geändert werden müssen. Die Keimbildung sollte sofort nach dem Mischen möglich sein. Batch-Methoden ermöglichen es daher, theoretisch die gesamte Nukleationszone zu erreichen. Jede Erhöhung der Nukleationskinetik über die Grenze zwischen Metastabilität und Nukleation hinaus kann dann genutzt werden.

Wenn das Basalniveau der Kristallnukleation nicht ausreicht, um ein großes X_n zu erzeugen, können Microseeding-Methoden verwendet werden. Beim Microseeding werden vorgezüchtete Kristalle aufgebrochen, um eine Aufschlämmung aus kristallinen Fragmenten zu erzeugen, die als Gerüst für frisches Kristallwachstum dienen können^31,32. Microseeding wird häufig in der seriellen kristallographischen Probenvorbereitung eingesetzt, um X_n zu erhöhen, ohne dass die Kristallnukleation erhöht werden muss (Abbildung 1C).

Der Übergang von der Dampfdiffusion zum Batch kann in einem Phasendiagramm visualisiert werden, indem der experimentelle Ausgangspunkt entweder von den nicht übersättigten oder metastabilen Regionen in die Nukleationszone verschoben wird. Dies kann erreicht werden, indem die Protein- und/oder Fällmittelkonzentrationen und/oder das Verhältnis der beiden innerhalb des Tropfens erhöht werden (Abbildung 1D) und beobachtet wird, unter welchen Bedingungen Kristalle schnell auftreten (< 24 h)²⁶. Eine vollständige Dampfdiffusionstropfenäquilibrierung kann Tage oder Wochen dauern³³. Durch die Suche nach Bedingungen, die schnell auftretende Kristalle zeigen, können daher Chargenbedingungen gefunden werden, ohne auf alternative Kristallisations-Screening-Formate wie Mikrobatch^34,35,36,37 umsteigen zu müssen.

Sobald die Nukleationszone gefunden wurde, wurde eine Chargenbedingung gefunden und ein Morphogramm - hier ein grobes Phasendiagramm - kann erstellt werden. Das Morphogramm ist von großem Nutzen, wenn Sie überlegen, ob Sie ein Seeded-Batch- oder Straight-Batch-Protokoll verwenden möchten. Durch die Darstellung des_Xn in Abhängigkeit von der Protein- und Fällmittelkonzentration kann eine Beurteilung der Nukleationskinetik vorgenommen werden²⁶. Wenn X n in der gesamten Nukleationsregion niedrig bleibt, kann es erforderlich sein, X_n groß genug zu machen, um das Kristallwachstum zu begrenzen. Diese Bewertung ist der erste Schritt im Prozess der Skalierung auf größere Volumina (> 100 μl).

Diese Methode wurde so konzipiert, dass sie in den meisten Kristallisationslaboratorien unter Verwendung von Standard-Dampfdiffusionskristallisationsgeräten durchgeführt werden kann. Es wurden auch viele Studien durchgeführt, die Techniken beschreiben, die viele Teile dieses Prozesses erleichtern, falls die Ausrüstung verfügbar ist. Dazu gehören unter anderem die dynamische Lichtstreuung (DLS)25,27, die nichtlineare Bildgebung 20,24,25, die Pulverbeugung 20,24,27 und die Elektronenmikroskopie 26 [siehe Cheng et al. (²⁰²⁰)⁴⁰ für eine schöne Übersicht].

Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine visuelle Demonstration der Methode zum Übergang von der Dampfdiffusionskristallisation mit kleinem Volumen (< 500 nL) zur großvolumigen (> 100 μL) Batch-Kristallisation zu liefern. Endothiapepsin aus Cryphonectria parasitica wurde als Beispielsystem verwendet, um diese Translation zu demonstrieren. Die Art des Experiments und die Probenabgabemethode, für die die Mikrokristalle benötigt werden, beeinflussen den idealen_X-s-Ausgang ²⁶. Für Mischexperimente, die eine Zeitauflösung⁴¹ von Millisekunden oder gasdynamische virtuelle Düsen⁴² erfordern, kann ein abschließendes X_s von < 5 μm wünschenswert sein. In diesem Fall bestand das Ziel darin, Proteinkristalle herzustellen, die sich auf etwa 1,5 Å beugen, für ein photonenaktiviertes Pump-Probe-Experiment und unter Verwendung eines Fixed-Target-Delivery-Ansatzes.

Um die Probenanforderungen eines solchen seriellen Kristallographie-Experiments mit Endothiapepsin zu veranschaulichen, zeigt Tabelle 1 die experimentellen Parameter eines hypothetischen Experiments. Die Probeninformationen basieren auf dem unten beschriebenen Protokoll. Angesichts einiger konservativer Schätzungen der Trefferquoten und der Anforderungen an die Datenerhebung ist 50 mg die geschätzte Gesamtprobe des Probenverbrauchs für das gesamte Experiment.

Abbildung 3 zeigt ein Flussdiagramm des gesamten Optimierungsprozesses von der anfänglichen Dampfdiffusionskristallisation mit kleinem Volumen bis hin zur großen Charge. Bei den meisten seriellen Kristallographieprojekten beginnt dieses Protokoll bei Schritt 2: "Übergang zum Batch", da das Zielprotein bereits kristallisiert ist. Schritt 1 wurde jedoch der Vollständigkeit halber aufgenommen und um die Leser an seine Bedeutung zu erinnern. Einen Zustand zu finden, der zu einem gut beugenden, einen, großen Kristall führt, ist der beste Ausgangspunkt für die Mikrokristalloptimierung. In Schritt 2 kann dieser Zustand dann von der Dampfdiffusion bis zur Charge optimiert und ein Morphogramm der Nukleations- und metastabilen Regionen aufgetragen werden. Sobald dies geschehen ist, kann die Skalierung der Chargenbedingung auf größere Volumina in Schritt 3 durchgeführt werden. Am Ende des Flussdiagramms hat ein Kristallograph ein wiederholbares, großvolumiges (> 100 μl) Mikrokristallisations-Batch-Protokoll für Endothiapepsin erstellt. Diese Methode kann dann auf das jeweilige Protein angewendet werden.

Protokoll

HINWEIS: Alle 96-Well-Sitting-Drop-Kristallisationsexperimente wurden entweder mit 2- oder 3-Tropfen-Platten durchgeführt. Ein Liquid-Handling-Roboter und ein Kristallisations-Imager/Hotel wurden eingesetzt, um die Vorbereitung und Überwachung aller 96-Well-Screens zu erleichtern. Alle Reagenzienkonzentrationen für Kristallisationsexperimente werden vor dem Mischen in ihren Ausgangskonzentrationen angegeben.

1. Optimierung der Kristallmorphologie

HINWEIS: Schritte 1.1.1. und 1.1.6. Beschreiben Sie, wie Endothiapepsin-Kristallisationsbedingungen gefunden wurden und wie diese Bedingungen optimiert wurden, um eine einzige Bedingung zu finden, die einzelne, gut beugende Kristalle ergab.

1. Sparse-Matrix-Optimierung
   1. Bereiten Sie frische Endothiapepsin-Lösung vor.
      HINWEIS: Endothiapepsin muss, wenn es als Superan 600 bezogen wird, aus seiner Lagerlösung in einen Puffer überführt und konzentriert werden.
      1. Bereiten Sie 3 l 0,1 M Na-Acetat pH 4,6 bei 4 °C vor.
      2. Schneiden Sie 20 cm Dialyseschlauch ab und waschen Sie ihn kurz im Puffer. Verschließen Sie ein Ende des Schlauchs mit einem Clip, geben Sie 50 ml der Endothiapepsin-Lösung in den Schlauch und verschließen Sie dann das andere Ende.
      3. Lassen Sie die Lösung mindestens 4 h (oder über Nacht) bei 4 °C in 1 l Naacetatpuffer dialysieren. Aufgrund der Bestandteile des Speicherpuffers beträgt die Lösung im Dialysebeutel nun ca. 100 ml.
      4. Füllen Sie den Dialysebeutel mit dem Endothiapepsin in einen frischen Liter von 4 °C, 0,1 M Na Acetat pH 4,6. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, so dass der ursprüngliche Puffer um das 2000-fache gegen das Na-Acetat verdünnt wurde.
      5. Das Endothiapepsin liegt nun bei etwa 10 mg/ml. Konzentrat auf 100 mg/ml mit einem 10 kDa Zentrifugalkonzentrator und einer Zentrifuge.
      6. Die Endothiapepsin-Lösung wird in flüssigem Stickstoff in 50 μl Aliquoten kurz gekühlt und bei -80 °C gelagert.
   2. Bereiten Sie ein PACT Premier 96-Well-Sparse-Matrix-Sieb vor.
      1. Geben Sie mit einem Liquid-Handling-Roboter 100 nL 70 mg/ml Endothiapepsin und 100 nL Well-Lösung in ein einziges Sub-Well pro Well. Mischen Sie das Protein und die Well-Lösung 3 Mal unter Zugabe des Kristallisationspuffers.
      2. Versiegeln Sie die Platte und lassen Sie sie 28 Tage bei 20 °C stehen, wobei Sie in der ersten Woche jeden Tag und danach 4 Wochen lang jede Woche Bilder aufnehmen.
   3. Analyse mit dünnbesetzter Matrix
      1. Identifizieren Sie Treffer, die einzelne Endothiapepsin-Kristalle produzieren. Aus dem PACT-Screening gingen hervor, dass Bedingungen, die MgCl₂ enthielten, eher als Einzellinge als als Nadelcluster wuchsen.
   4. Sparse-Matrix-Optimierung
      1. Aus den in Schritt 1.1.3.1 identifizierten MgCl_2-haltigen Bedingungen wird ein 96-Well-Sieb erstellt, das die verschiedenen Well-Komponenten nach dem Zufallsprinzip kombiniert und variiert.
      2. Geben Sie mit einem Liquid-Handling-Roboter 100 nL 70 mg/ml Endothiapepsin und 100 nL Well-Lösung in ein einziges Sub-Well pro Well. Mischen Sie das Protein und die Well-Lösung 3 Mal unter Zugabe des Kristallisationspuffers.
      3. Versiegeln Sie die Platte und lassen Sie sie 28 Tage bei 20 °C stehen, wobei Sie in der ersten Woche jeden Tag und danach 4 Wochen lang jede Woche Bilder aufnehmen.
   5. Analyse der Optimierung
      1. Ordnen Sie mit einer geeigneten Tabellenkalkulationssoftware die Kristallisationsbedingungen, die zu Kristallen führen, basierend auf der Kristallqualität und dem Ausscheidungsgrad, keine Kristalle (0) bis ideal (5) bzw. niedrig (0) bis hoch (5). In Bezug auf die Kristallqualität sind die allgemeinen Kriterien Einkristalle mit einer kastenförmigen Morphologie.
      2. Führen Sie eine Pearson-Korrelationsanalyse zwischen dem Inhalt der Kristallisationsbedingungen und der Kristallmenge und dem Ausfällungsgrad durch.
      3. Stellen Sie diese Daten als Heatmap dar. Suchen Sie nach Komponenten und Bedingungen, die mit den bevorzugten Ergebnissen korreliert wurden.
   6. Beugungsanalyse.
      1. Bestätigen Sie, dass die Kristalle, die unter den in Schritt 1.1.5 identifizierten Bedingungen gezüchtet wurden, für die serielle Kristallographie geeignet sind, indem Sie ein Röntgenbeugungsexperiment durchführen.
      2. Laden Sie eine Probe der Endothiapepsin-Kristalle aus jeder der identifizierten Bedingungen auf Träger, die eine Datenerfassung bei 100 oder 293 K ermöglichen, und führen Sie ein Röntgenbeugungsexperiment durch. Wenn Sie unter Kryo arbeiten, verwenden Sie 25% Ethylenglykol als Kryoschutzmittel.
      3. Verarbeiten Sie diese Daten über eine geeignete Software-Suite. Endothiapepsin-Kristalle sollten über 1,5 Å diffrakieren. Prüfen Sie, ob Zwillinge vorhanden sind, da Zwillingskristalle die serielle kristallographische Datenverarbeitung erheblich erschweren können.
      4. Wenn es sich bei den Kristallen um Einzelkristalle handelt, die auf 1,5 Å gebeugt werden, fahren Sie mit Schritt 2 fort. Wenn dies nicht der Fall ist, kehren Sie zu Schritt 1.1.2 zurück und probieren Sie weitere Raster mit geringer Matrix aus, um vielversprechende Bedingungen zu identifizieren. Nach den Analysen, die in den Schritten 1.1.5. und 1.1.6. sollte eine Kristallisationsbedingung von 25 % (w/v) PEG 6.000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 und 0,15 M_MgCl2 als näherungsweises Ideal gefunden worden sein.

2. Übergang zum Batch

1. Morphogramm-Experiment
   1. Erstelle einen Mikrokristall-Samenvorrat.
      HINWEIS: Bei der Herstellung von Samenvorräten empfiehlt es sich, die Samen aus Kristallen herzustellen, die speziell für diese Aufgabe gezüchtet wurden. Dies trägt wesentlich zur Reproduzierbarkeit bei. Andere Ideen, die in den Schritten 2.1.1.1 bis 2.1.1.11 vorgestellt werden, bestehen darin, immer die Kristalle zu verwenden, die aus einer Standardanzahl von Vertiefungen - hier 5 - gezüchtet wurden, und die Vorräte zu aliquotieren, sobald sie hergestellt wurden, um Gefrier-Tau-Zyklen zu negieren.
      1. Bereiten Sie eine 96-Well-Kristallisationsplatte mit Vertiefungen vor, die den Kristallisationspuffer enthalten: 25 % (w/v) PEG 6.000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 und 0,15 M MgCl₂.
      2. Geben Sie mit einem Liquid-Handling-Roboter 200 nL aufgetautes 70 mg/ml Endothiapepsin und 200 nL Well-Lösung in eine einzige Untervertiefung pro Well. Mischen Sie das Protein und die Well-Lösung 3 Mal unter Zugabe des Kristallisationspuffers.
      3. Verschließen Sie die Platte und lassen Sie sie 24 Stunden einwirken.
      4. Füllen Sie ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 250 μl Kristallisationspuffer und 10-15 1-mm-Glasperlen. Lassen Sie das Zentrifugenröhrchen 5-10 Minuten auf Eis abkühlen.
      5. Wählen Sie 5 Vertiefungen mit Kristallen aus, öffnen Sie die Vertiefungen mit einem Skalpell und zerdrücken Sie die Kristalle in den Vertiefungen mit einer Pipettenspitze.
      6. 1 μl Puffer aus dem eisgekühlten Zentrifugenröhrchen absaugen und zur Homogenisierung der zerkleinerten Kristallaufschlämmung verwenden. Sobald sie homogen ist, saugen Sie die gesamte Aufschlämmung ab und sammeln Sie sie im gekühlten Zentrifugenröhrchen.
      7. Wiederholen Sie Schritt 2.1.2.6 für jede der 5 Teilbohrungen.
      8. Das Zentrifugenröhrchen mit dem Puffer, den gepoolten Schlämmen und den Perlen 30 s lang bei 1000 U/min aufwirbeln.
      9. Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen für 30 s wieder auf Eis.
      10. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2.8 und 2.1.2.9 noch zweimal.
      11. Das Saatgut ist nun fertig und kann in 10 μL Chargen aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden.
   2. Führen Sie ein Morphogramm-Experiment durch.
      1. Bereiten Sie ein 2-Tropfen-Rastersieb mit 96 Wells vor. Variieren Sie die Konzentration von PEG 6.000 von 5 bis 40 % (w/v) entlang der Plattensäulen, wobei der Puffer und das Salz bei 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 bzw. 0,15 M MgCl₂ gehalten werden.
      2. Bereiten Sie eine sequenzielle Verdünnung von Endothiapepsin in 0,1 M Na Acetat pH 4,6 von 100 bis 12,5 mg/ml über 8 Schritte vor. Für jede Reihe der Platte wird eine andere Konzentration von Endothiapepsin verwendet.
      3. Geben Sie mit einem Liquid-Handling-Roboter 150 nL Endothiapepsin in die beiden Unterwellen 1 und 2 ab. Geben Sie in Sub-Well 1 150 nL der Well-Lösung ab. In Sub-Well 2 werden 50 nL aufgetautes Saatgut und 100 nL Well-Lösung mehrfach aspiriert und dann beides in die Proteinlösung gegeben. Mischen Sie die Lösungen 3 Mal nach Zugabe des Kristallisationspuffers.
      4. Verschließen Sie die Platte und lassen Sie sie bei 20 °C alle 0, 3, 6, 12, 18, 24 Stunden fotografieren, dann in der ersten Woche jeden Tag und in den nächsten vier Wochen jede Woche. Wenn eine automatische Bildgebung nicht möglich ist, machen Sie sich keine Gedanken über die stündliche Bildgebung an Tag 1.
2. Morphogramm-Analyse
   1. Betrachten Sie die Bilder, die nach 24 Stunden aufgenommen wurden, schätzen Sie die Anzahl der Kristalle, die in jeder Vertiefung vorhanden sind, und halten Sie diese Schätzungen in dem bereitgestellten Arbeitsblatt "Morphogrammgenerator" fest. Diese Schätzungen müssen nicht genau sein; Das einzelne Zählen von Tausenden von Mikrokristallen, falls vorhanden, ist weder praktikabel noch notwendig. Versuchen Sie grundsätzlich, sicherzustellen, dass die Schätzungen über die gesamte Platte konsistent sind.
      HINWEIS: Die 24-Stunden-Regel basiert auf den Beobachtungen von Beale et al . (2019)²⁶. Es kann Tage oder Wochen dauern, bis die Kristallisationsbedingungen der Dampfdiffusion ausgeglichen sind. Kristalle, die schnell erscheinen, sind eher durch einen Batch-Prozess gewachsen als durch das allmähliche Gleichgewicht der Tropfenkomponenten. Das 24-Stunden-Kriterium ist daher etwas willkürlich, und eine genaue Cut-off-Zeit zwischen einem Batch- und einem Dampfdiffusionsexperiment hängt von der spezifischen Mischung der Bedingung ab [siehe Beale et al. (2019) ²⁶ für alle Einzelheiten].
   2. Geben Sie die Ausgangskonzentrationen von Endothiapepsin und PEG 6.000 in die dafür vorgesehenen Felder ein.
   3. Das Arbeitsblatt stellt die Ergebnisse automatisch im traditionellen Phasendiagrammformat mit Fällungsmittel- und Proteinkonzentration auf der x - bzw. y-Achse dar. Well-Bedingungen, die nur Kristalle in ihren gesäten Tropfen hervorbringen, zeigen den metastabilen Bereich des Diagramms (transparent blau) an, während Bedingungen, die Kristalle sowohl in den gesäten als auch in den nicht entkernten Tropfen aufweisen, die Nukleationszone (durchgehend grün) anzeigen.
      HINWEIS: Idealerweise sollte der größte Teil der Nukleationszone im Diagramm vorhanden sein (d. h. es gibt einige klare Vertiefungen am unteren Rand des Diagramms und ein Teil des Niederschlags sollte bei hohen Protein- und Fällungsmittelkonzentrationen sichtbar sein). Wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie vielleicht das Experiment, erhöhen Sie jedoch die Protein- und/oder Fällmittelkonzentration (wenn möglich).
   4. Wenn Kristalle in weniger als 24 Stunden erschienen sind, fahren Sie mit Schritt 2.3.1 fort. Wenn nicht, fahren Sie mit Schritt 2.4 fort und fahren Sie mit der Optimierung in Richtung Batch fort.
3. Kristall-Analyse
   1. Wie am Ende von Schritt 1 erwähnt, stellen Sie vor dem nächsten Schritt sicher, dass diese Kristalle die gewünschte Morphologie und Beugungsqualität aufweisen. Sind die Kristalle in Bezug auf die Morphologie beobachtbar nicht verdoppelt und bilden sich eher als Einzellinge als nadelkugel- oder fächerartige Strukturen? In Bezug auf die Beugung sammeln Sie, wenn möglich, Beugungsdaten von den Kristallen. Wenn diese Kristalle nicht gebeugt werden, ist es unwahrscheinlich, dass die Kristalle, die in einem größeren Volumen gewachsen sind, sich beugen.
   2. Laden Sie eine Probe der Endothiapepsin-Kristalle aus dem Morphogramm-Experiment auf Träger, die eine Datenerfassung bei 100 oder 293 K ermöglichen, und führen Sie ein Röntgenbeugungsexperiment durch. Wenn Sie unter Kryo arbeiten, verwenden Sie 25% Ethylenglykol als Kryoschutzmittel.
   3. Verarbeiten Sie diese Daten über eine geeignete Software-Suite. Endothiapepsin-Kristalle sollten über 1,5 Å diffrakieren. Beobachten Sie über die Kristallprobe hinweg die Zellgröße, die Gesamtzahl der Beobachtungen und die Mosaizität. Diese Messungen geben Aufschluss über die Homogenität der Beugungskristalle.
   4. Wenn die Kristallmorphologie und die Beugungsqualität ausreichend sind, fahren Sie mit Schritt 3 fort.
4. Optimieren Sie die Kristallwachstumszeit.
   ANMERKUNG: Die Morphogrammanalyse (Schritt 2.2) gibt Aufschluss über den Kristallisationsbeginn (d. h. den Bereich des Phasendiagramms, in dem sich der Tropfen befindet, als das Fällungsmittel und die Proteinlösung gemischt wurden). Liegt der Abfall im metastabilen Bereich oder unterhalb der Löslichkeitsgrenze? Die Batch-Kristallisation beginnt in der Nukleationszone (Abbildung 1C). Das Ziel dieses Schritts ist es, diesen Ausgangspunkt entweder von unterhalb der Löslichkeitslinie oder des metastabilen Bereichs in die Nukleationszone zu verschieben (Abbildung 1D). Wenn der seeded-drop aus Schritt 2.2. Kristalle schnell ergeben haben, ist dies ein Hinweis darauf, dass sich die Tropfenmischung bereits im metastabilen Bereich befindet, wenn nicht, dann ist es wahrscheinlich, dass der Tropfen nicht übersättigt ist.
   1. Optimierung der Kristallwachstumszeit.
      1. Bereiten Sie mit demselben Sieb wie in Schritt 2.1.3 ein 96-Well-Dampfdiffusionskristallisationsexperiment in einer 3-Tropfen-Platte vor.
      2. Erhöhen Sie die Ausgangsproteinkonzentration von Endothiapepsin auf der y-Achse (d. h. konzentrieren Sie das Protein weiter, vielleicht 120 mg/ml für Endothiapepsin).
      3. Führen Sie eine serielle Verdünnung wie in Schritt 2.1.3.2 durch, so dass jede Reihe der Platte eine sequenziell niedrigere Proteinkonzentration enthält.
      4. Verwenden Sie unterschiedliche Tropfenverhältnisse in jedem der drei Tropfen auf der Platte: 1:1, 1:2 und 2:1, Protein:Fällungsmittel.
      5. Betrachten oder fotografieren Sie die Platte am ersten Tag um 0, 3, 6, 12, 18, 24 Uhr und dann jeden Tag in der ersten Woche und jede Woche für die nächsten vier. Wenn eine automatische Bildgebung nicht möglich ist, machen Sie sich keine Gedanken über die stündliche Bildgebung an Tag 1.
      6. Identifizieren Sie Tropfen, die die am schnellsten erscheinenden Kristalle produzieren, und machen Sie diese zum Ausgangspunkt wiederholter Optimierungen, bis das Kristallwachstum innerhalb von 24 Stunden erfolgt.
      7. Wenn ein schnell auftretender Kristallzustand identifiziert wurde, kehren Sie zu Schritt 2.1 zurück, um das Morphogramm als Auftakt für den Beginn der Skalierung neu zu zeichnen.

3. Skalierung

1. Routen zur Rangskalierung. In dieser Phase ist es nicht notwendig, sich für eine einzige Skalierungsroute zu entscheiden, sondern nur die Optionen zu identifizieren und zu bewerten, damit sie der Reihe nach erkundet werden können. Wenn das Volumen der Chargenmischung während des Skalierungsvorgangs erhöht wird, treten Änderungen in der Keimbildungsrate und im Bereich der Kristallgrößen auf. Diese können jedoch durch eine sorgfältige Anpassung der Komponentenkonzentrationen überwunden werden, wenn das skalierte Volumen erhöht wird.
   ANMERKUNG: In den Schritten 3.1.1 und 3.1.2 wird beschrieben, wie anhand des Morphogramms zu erkennen ist, ob ein Chargen- oder ein Seeded-Batch-Protokoll besser geeignet ist.
   1. Straight-Batch-Protokoll
      1. Ist das X_n in der Nukleationszone proportional zur Protein- und/oder Fällmittelkonzentration? D.h. steigt X_n in Abhängigkeit von der Fällmittel- und/oder Proteinkonzentration an? -Ja? Fahren Sie mit Schritt 3.1.1.2 fort. Nein? Fahren Sie mit Schritt 3.1.2 fort. 
      2. Suchen Sie nach Bedingungen, die Kristalle der erforderlichen Größe ergeben, und fahren Sie mit Schritt 3.2 fort.
   2. Seeded-Batch-Protokoll
      1. Ist das X_n flach über der Nukleationszone? D.h. X_n steigt weder in Abhängigkeit von der Fällungsmittel- noch von der Proteinkonzentration an.
      2. Suchen Sie nach gesäten Bedingungen, die Kristalle der erforderlichen Größe ergeben, und fahren Sie mit Schritt 3.2 fort. Wenn alle Kristalle zu groß sind, fahren Sie mit Schritt 3.1.2.3 fort.
      3. Wiederholen Sie das Morphogramm-Experiment (Schritt 2.1), aber erhöhen Sie diesmal die Konzentration des Saatguts, das in den gesäten Vertiefungen verwendet wird. Der Samenvorrat kann erhöht werden, indem mehr Kristalle bei der Herstellung verwendet werden. Verwenden Sie z. B. anstelle von 5 Vertiefungen in Schritt 2.1.1.5 10 Vertiefungen.
      4. Sehen Sie sich die Platte in den ersten 0, 3, 6, 12, 18, 24 Stunden an oder bilden Sie sie ab.
      5. Das X_n sollte in den Seeded-Drops zugenommen und das X_s abgenommen haben. Wiederholen Sie diesen Zyklus, wenn kleinere Kristalle benötigt werden, und befolgen Sie dann ein Seeded-Batch-Protokoll.
2. Schrittweise Skalierung
   1. Skalierung in 96-Well-Platten. Aus dem Endothiapepsin-Morphogramm wurde zunächst eine Straight-Batch-Methode mit den Kristallisationsbedingungen 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ und 30 % (w/v) PEG 6.000 für die Skalierung ausgewählt. 100 mg/ml Endothiapepsin mit dem Kristallisationspuffer im Verhältnis 1:1 vermischt.
      1. Bereiten Sie 2-3 Vertiefungen in einer 2-Vertiefung 96-Vertiefungs-Sitztropfenplatte mit 100 μl 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ und 30 % (w/v) PEG 6.000 vor.
      2. Mit frisch aufgetauter 100 mg/ml Endothiapepsin-Lösung 0,5 μl Protein und 0,5 μl Fällungsmittel pro Vertiefung dosieren, verschließen und bei 20 °C lagern.
      3. Sehen Sie sich die Platte in den ersten 0, 3, 6, 12, 18, 24 Stunden an oder bilden Sie sie ab. Beachten Sie alle Änderungen im Bereich von X_s und X_n.
      4. Wenn Änderungen aufgetreten sind, wiederholen Sie die Schritte 3.2.1.1 bis 3.2.1.2, erhöhen oder verringern Sie jedoch die Protein-, Fällungsmittel- und/oder Samenkonzentration, um alle Änderungen im Bereich von X_s und X_n wiederherzustellen.
      5. Wenn der Bereich von X_s und X_n akzeptabel ist, fahren Sie mit Schritt 3.2.2 fort.
   2. Skalierung in 24-Well-Hanging-Drop-Platten
      1. Bereiten Sie eine einzelne Vertiefung einer 24-Vertiefungsplatte vor, indem Sie die Ränder der Vertiefung mit Vakuumfett einfetten.
      2. Bereiten Sie 0,5 ml 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ und 30 % (w/v) PEG 6.000 vor und füllen Sie die gefettete Mulde.
      3. Mit frisch aufgetauter Endothiapepsin-Lösung 1 μl Protein auf die Oberfläche eines Glasdeckglases pipettieren. 1 μl Kristallisationspuffer auf den Proteintropfen pipettieren und mit der Pipette mischen.
      4. Betrachten oder fotografieren Sie die Platte in den ersten 0, 3, 6, 12, 24 Stunden. Beachten Sie alle Änderungen im Bereich von X_s und X_n.
      5. Wenn Änderungen aufgetreten sind, wiederholen Sie die Schritte 3.2.2.1 bis 3.2.2.4, erhöhen oder verringern Sie jedoch die Protein-, Fällungsmittel- und/oder Samenkonzentration, um alle Änderungen im Bereich von X_s und X_n wiederherzustellen.
      6. Wenn der Bereich von X_s und X_n akzeptabel ist, fahren Sie mit Schritt 3.2.2.7 fort.
      7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.2.1 bis 3.2.2.5 und erhöhen Sie das Gesamtvolumen des Experiments schrittweise auf 10 μl.
      8. Sobald ein Volumen von 10 μl oder mehr erreicht ist, fahren Sie mit den Zentrifugenröhrchen in Schritt 3.2.3 fort.
   3. Scaling in Zentrifugenröhrchen
      ANMERKUNG: Die Verfeinerung der Endothiapepsin-Chargenbedingung erfolgte hauptsächlich zum Zeitpunkt von 200 μl Volumen (siehe Ergebnisse, Skalierung). Der Prozess begann mit einer Kristallisationsbedingung von 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,15 M_MgCl2 und 30 % (w/v) PEG 6.000. Die PEG-Konzentration änderte sich jedoch schließlich auf 40 % (w/v). Seeds waren auch erforderlich, um das X_n zu kontrollieren, und um zu verhindern, dass Kristalle zu groß werden, musste das Kristallwachstum gelöscht werden. In den Schritten 3.2.3.1 bis 3.2.3.7 wird der Prozess der Zustandsoptimierung detailliert beschrieben. Schritt 3.2.4. Beschreiben Sie das endgültige Chargenprotokoll.
      1. Bereiten Sie 1 ml Kristallisationspuffer vor: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ und 30 % (w/v) PEG 6.000.
      2. Mit frisch aufgetautem 100 mg/ml Endothiapepsin 25 μl Protein in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen geben.
      3. Mischen Sie den Kristallisationspuffer gründlich mit der Proteinlösung im Verhältnis 1:1 mit einer Pipettenspitze. Legen Sie das Röhrchen in einen Revolver/Rotator mit hohem Rühren bei 20 °C.
      4. Nehmen Sie normale (5, 10, 30, 60 min, 2, 5, 10, 24 h) 2,5 μl Aliquots und betrachten Sie sie in einem Hämozytometer. Zeichnen Sie den X-n- und den_X-s-Bereich auf.
      5. Wenn Änderungen aufgetreten sind, wiederholen Sie die Schritte 3.2.3.1. zu 3.2.3.4. Erhöhen oder verringern Sie jedoch die Protein-, Fällungsmittel- und/oder Samenkonzentration, um Änderungen im Bereich von X_s und X_n wiederherzustellen
      6. Wenn der Bereich von Xs und Xn akzeptabel ist, fahren Sie mit Schritt 3.2.3.7 fort.
      7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.2.1 bis 3.2.2.5 und erhöhen Sie das Gesamtvolumen des Experiments nach Bedarf schrittweise auf 200 μl oder mehr.
   4. Endgültiges Seeded-Batch-Protokoll
      1. Bereiten Sie Saatgut vor.
         1. Bereiten Sie 2 ml Kristallisationspuffer vor: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ und 40 % (w/v) PEG 6.000.
         2. Mit frisch aufgetautem 100 mg/ml Endothiapepsin 100 μl Protein in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen geben.
         3. Mischen Sie den Kristallisationspuffer gründlich mit der Proteinlösung im Verhältnis 1:1 mit einer Pipettenspitze. Legen Sie das Röhrchen 24 h lang in einen Revolver/Rotator mit hohem Rühren bei 20 °C, damit 50 μm Kristalle wachsen können.
         4. Fügen Sie 10-15 1 mm Glasperlen zu der 50 μm Kristallaufschlämmung hinzu.
         5. Das Zentrifugenröhrchen mit der Aufschlämmung und den Perlen 30 s lang bei 1000 U/min mit 1000 U/min vordrehen.
         6. Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen für 30 s wieder auf Eis.
         7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.4.1.5 und 3.2.4.1.6 noch 10 Mal.
         8. Das sind jetzt 200 μL eines 1x Saatguts. Verdünnen Sie das Saatgut 10x durch Zugabe von 1,8 ml Kristallisationspuffer. Aliquotieren Sie den 10-fachen Saatgut in 50 μL Chargen und lagern Sie ihn bei -20 °C.
      2. Seeded-Batch-Protokoll.
         1. Kristallisationspuffer vorbereiten: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ und 40 % (w/v) PEG 6.000.
         2. In einem Zentrifugenröhrchen 100 μl Kristallisationspuffer mit den 50 μl frisch aufgetautem 10x Saatgut mischen.
         3. Mit frisch aufgetautem 100 mg/ml Endothiapepsin 150 μl Protein in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen geben.
         4. Mischen Sie das Kristallisationspuffer-Seed-Gemisch gründlich mit der Endothiapepsin-Lösung mit einer Pipettenspitze und legen Sie das Röhrchen in einen Revolver/Rotator mit hohem Rühren bei 20 °C.
         5. Überwachen Sie die Kristallisation, indem Sie regelmäßig 2,5 μl Aliquots einnehmen und die Kristalle in einem Hämozytometer betrachten. Zeichnen Sie den X-n- und den_X-s-Bereich auf.
         6. Nach ca. 80 min, wenn die Kristalle ein X_s von 15 μm erreicht haben, wird die Reaktion durch Zugabe von 150 μl 0,05 M Na Acetat pH 4,6, 0,05 M Tris-HCl pH 7,0, 0,075 M_MgCl2 und 20 % (w/v) PEG 6.000 (eine Lösung bestehend aus Endothiapepsin-Puffer und Kristallisationspuffer, gemischt 1:1) abgelöscht.
         7. Lagern Sie die Kristalle bei 20 °C.
      3. Hat das Protokoll einen akzeptablen Kristallgrößenbereich und eine akzeptable Anzahl für das beabsichtigte Experiment ergeben? Ja - FERTIG- Nein - zurück zu Schritt 3.1. und versuchen Sie es mit einer alternativen Skalierungsoption. Zum Beispiel kann ein anderes Protein-Fällmittel-Verhältnis möglich sein oder die Zugabe von Samen, wenn dies zuvor nicht geschehen ist. Wenn diese alle erschöpft sind, kann es notwendig sein, in Schritt 1 eine neue Bedingung zu finden.

Ergebnisse

Optimierung der Kristallmorphologie
Schritt 1, die Optimierung der Kristallmorphologie, wurde aufgenommen, um den Leser an seine Bedeutung zu erinnern. Es könnte möglich sein, perfekte Mikrokristalle aus Nadelkugeln mit schlechter Beugung herzustellen; Die Autoren schlagen jedoch vor, dass es besser ist, die beiden separat zu optimieren. Finden Sie zunächst Bedingungen, die zu gut gebeugten Einkristallen durch Dampfdiffusion führen, und wandeln Sie diese Bedingungen dann in eine Charge um, anstatt zu versuchen, die beiden Schritte miteinander zu kombinieren. In diesem Stadium ist es nicht notwendig, hochnukleierende Bedingungen zu entdecken. Morphologie und Beugungsqualität sind die Hauptziele.

Bevor mit der Mikrokristallisation von Endothiapepsin begonnen wurde, wurde eine Analyse der Kristallisationsbedingungen der abgeschiedenen Struktur aus der PDB durchgeführt. Kristallisationsbedingungen und ungefähre Protokolle konnten für 47 der 48 Ablagerungen von Entthothiapepsin erhalten werden. Diese basierten im Großen und Ganzen auf der ersten Kristallisation von Endothiapepsin, die von Moews und Bunn (1970)⁴⁶ durchgeführt wurde. Angesichts der Ähnlichkeiten dieser Bedingungen und ihres "klassischen" Ursprungs wurde ein 96-Well-Dampfdiffusionssieb mit dünner Matrix durchgeführt, um eine größere Vielfalt an Kristallisationsbedingungen zu untersuchen. Endothiapepsin wurde auf 70 mg/ml konzentriert, und ein PACT-Sparse-Matrix-Screening⁴⁷ wurde in einer 96-Well-Sitting-Drop-Platte bei 20 °C durchgeführt, wobei 100 nL Protein mit 100 nL Well-Lösung gemischt wurden. Jede Bedingung aus diesem Experiment nach 36 h führte zu Kristallen. Eine Analyse der Kristallmorphologie deutete jedoch darauf hin, dass sich einige Bedingungen für die Optimierung der Mikrokristallisation als besser erweisen könnten.

Abbildung 4A zeigt einen Abfall des PACT-Bildschirms, der im Großen und Ganzen repräsentativ für die im Großteil der Platte beobachteten war. Auf den ersten Blick mag es verlockend sein zu denken, dass es sich lohnen könnte, diese Kristalle für die Mikrokristallisation weiter zu optimieren. Die Kristalle sind groß und es scheint eine signifikante Keimbildung zu geben. Die gesamte Kristallmorphologie ist jedoch nicht ideal. Erstens handelt es sich bei den Kristallen nicht um beobachtbare Einzelkristalle, da es den Anschein hat, dass mehrere Kristalle aus einzelnen Nukleationspunkten wachsen. Zweitens ist die Kristallgröße stark asymmetrisch, wobei das Wachstum hauptsächlich entlang einer einzigen Achse stattfindet. Solche Kristalle richten sich theoretisch eher bevorzugt aus, wenn sie an den Röntgenstrahl abgegeben werden. Beide Eigenschaften stellen Probleme bei der Erfassung und Verarbeitung von seriellen kristallographischen Daten dar.

Abbildung 4B zeigt jedoch Endothiapepsin-Kristalle, die in Gegenwart von MgCl₂ gezüchtet wurden. Diese Morphologie war bei allen Erkrankungen, die MgCl 2 enthielten, konsistent und deutete daher darauf hin, dass ihre Morphologie auf MgCl₂ zurückzuführen war. Die MgCl_{2-Bedingungen} erzeugten einzelne, kastenförmigere Kristalle, die ein besseres Ziel für die ultimativen Serienexperimente darstellten.

Es gab vier Bedingungen innerhalb des PACT-Screens, die MgCl₂ enthielten. Um den Einfluss der verschiedenen Komponenten dieser Bedingungen auf die Endothiapepsin-Kristallisation besser zu verstehen, wurde eine zufällige Optimierung durchgeführt. Es wurde ein Sieb erstellt, das eine zufällige Kombination der Puffer und Fällungsmittel in einer Reihe von Konzentrationen und pH-Werten enthält. Die MgCl_{2-Konzentration} wurde ebenfalls variiert und dann wurden die resultierenden Tropfen willkürlich von 0-5 (0 bedeutet keine Kristalle oder Ausfällung) in Bezug auf ihre visuelle Kristallqualität und ihren Ausfällungsgrad eingestuft.

Abbildung 5A zeigt eine Heatmap der Ergebnisse einer Pearson-Korrelationsanalyse zwischen dem Niederschlagsniveau und der Kristallqualität sowie der Bildschirmvariablen (Beispiele für die Tropfen aus diesem Experiment sind in den Abbildungen 5B, C und D dargestellt). Die Ergebnisse zeigten, dass der pH-Wert der Lösung stark mit der Niederschlagsmenge korrelierte, wobei alkalische Puffer zu mehr Niederschlag führten. Die_{MgCl2-Konzentration} korrelierte leicht mit dem Niederschlagsgrad, ebenso wie der pH-Wert und die Fällmittelkonzentration mit der Kristallqualität.

Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde die Entscheidung getroffen, die Kristalle, die in 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂, 20 % (w/v) PEG 6.000 gezüchtet wurden, in den nächsten Schritt des Protokolls zu überführen - den Übergang zur Charge. Die Morphologie der Kristalle war akzeptabel und eine Analyse der Röntgenbeugung und der Datenqualitätsmetriken dieser Kristalle deutete darauf hin, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Kristallen gab, die in Gegenwart von Mg²⁺ gewachsen waren (Abbildung 9).

Übergang zum Batch
Für viele Mikrokristallisationsoptimierungen in der seriellen Kristallographie ist Schritt 2 der Ausgangspunkt. Das interessierende Protein wurde bereits für die Kryokristallographie kristallisiert, und das Kristallisationsprotokoll muss nun transformiert werden, um Mikrokristallschlämme zu erzeugen. In diesem Protokoll wurden nur 96-Well-Dampfdiffusionsplatten verwendet, um die Umwandlung in einen Batch durchzuführen, da die Dampfdiffusion die Kristallisationsmethode ist, die von 95 % der PDB-Einträge^{verwendet wird 26}. Das Protokoll hat es vermieden, in Microbatch^34,35,37 zu wechseln^, da dieser Übergang immer noch eine ähnliche Optimierung nach sich ziehen könnte. Das soll nicht heißen, dass dieses Protokoll nur in Dampfdiffusionsplatten durchgeführt werden kann. Alle vorgestellten Schritte würden auch im Mikrobatch funktionieren, wenn dies die ursprüngliche Kristallisationsmethode wäre.

Um die Kristallisation von Endothiapepsin im gewählten Zustand beurteilen zu können, wurde ein Morphogramm - oder ein grobes Phasendiagramm - erstellt. Das Morphogramm-Experiment verfolgt einen dreifachen Zweck. Erstens ist eine Analyse des Morphogramms von großem Nutzen bei der Beurteilung von Skalierungsrouten in Schritt 3 - Skalierung. Zweitens fungiert das Morphogramm als Optimierungswerkzeug und hilft bei der Entdeckung von Dampfdiffusionsbedingungen, die Kristalle durch Charge entstehen lassen [d. h. schnell erscheinende Kristalle (< 24 h)]. Drittens, wenn die Kristalle nicht schnell erschienen sind, kann eine Analyse der gesäten Tropfen dem Kristallographen eine Vorstellung von der ungefähren Position des aktuellen Zustands im Phasendiagramm geben. Wenn z. B. die gesäten Bedingungen Kristalle ergeben, die unentkeimten jedoch nicht, liegen diese Bedingungen wahrscheinlich im metastabilen Bereich.

Das Morphogramm-Experiment mit Endothiapepsin wurde auf der Grundlage der 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂, 20% (w/v) PEG 6.000 Bedingung durchgeführt. Die Protein- und PEG-Konzentrationen variierten zwischen 100 und 12,5 mg/ml bzw. 5 bis 40 % (w/v). Die Tropfen wurden analysiert und die Ergebnisse anhand des bereitgestellten Arbeitsblatts dargestellt (Abbildung 6A).

Es war auch bereits in der Phase der Optimierung der Kristallmorphologie klar, dass das Wachstum von Endothiapepsin-Kristallen in dieser Bedingung und bei diesen Proteinkonzentrationen zu Kristallen führen würde, die in weniger als 24 Stunden gewachsen sind. Dies deutete darauf hin, dass die Kristallisation über einen Batch-Prozess und nicht über einen dampfdiffusionsgetriebenen Prozess erfolgte. Die unter diesen Bedingungen gezüchteten Kristalle waren daher für die Skalierung auf größere Volumina geeignet.

Wären nach 24 h keine Kristalle in den unangesäten Tropfen sichtbar gewesen, dann wäre es wahrscheinlich gewesen, dass die Kristallisation immer noch von einem Übergang abhängig war (Abbildung 1B) und daher nicht von einer Charge. In diesem Fall sind die Ergebnisse aus dem Morphogramm-Experiment immer noch von Interesse. Sie geben einen Hinweis auf den wahrscheinlichen Startpunkt der Kristallisation im Phasendiagramm und damit darauf, wie die anschließende Optimierung ablaufen sollte. Schauen Sie sich die gesäten Tropfen an. Die Samen ermöglichen das Kristallwachstum in der metastabilen Region, unabhängig von der Keimbildung. Wenn z.B. innerhalb von 24 h Kristalle in den entkernten Tropfen erscheinen, aber nicht in den unentkernten Tropfen, deutet dies darauf hin, dass ein Teil der metastabilen Region beobachtet werden kann. Wenn weder in den entkernten noch in den unentkernten Tropfen Kristalle beobachtet werden, bleiben alle Vertiefungen untersättigt.

Skalierung
Mit Blick auf das Morphogramm (Abbildung 6A) konnten eine Reihe von Beobachtungen gemacht werden. Das Ausmaß der Nukleation schien sowohl von der Protein- als auch von der Fällmittelkonzentration beeinflusst zu werden. Es gab auch eine sehr klare Abgrenzung von Tropfen, die zur Proteinausfällung führen, wobei die Tropfen entweder Nichts, Kristalle oder Niederschlag enthalten (Abbildung 6B). Die Zugabe von Samen (Abbildung 6D) erhöhte_Xn im Vergleich zu den Tropfen ohne Samen (Abbildung 6C) ebenfalls stark. Unter Berücksichtigung all dieser Ergebnisse wurde beschlossen, sowohl ein Batch- als auch ein Seeded-Batch-Protokoll auf 30 % (w/v) PEG 6.000 und 100 mg/ml Endothiapepsin zu skalieren.

Die erste Testskalierung erfolgte in hängenden 24-Well-Drop-Plates. Die Tropfenvolumina wurden sukzessive erhöht, so dass Veränderungen im Kristallisationsverhalten beobachtet werden konnten (Abbildung 7). Wie zu sehen ist, hat sowohl bei den unentkernten als auch bei den entkernten Tropfen Kristallwachstum stattgefunden. Alle unseeden Tropfen bildeten eine Reihe von Kristallgrößen, aber überwiegend große Kristalle (100-200 μm - längste Abmessung). Die gesäten Tropfen produzierten jedoch kleinere Kristalle (5 - 50 μm - längste Dimension). Diese ersten Tests deuteten darauf hin, dass Saatgut erforderlich sein würde, um X_s zu verringern, aber auch, dass diese Bedingung für größere Mengen geeignet sein sollte.

Wenn das Volumen in 200 μL erhöht wurde, wurde das Kristallisationsvolumen während des Kristallwachstums kontinuierlich gerührt. Der Hauptgrund für dieses Rühren bestand darin, sicherzustellen, dass die Kristallisationslösung homogen bleibt und sich keine wachsenden Kristalle am Boden oder an den Seiten der Röhrchen absetzen. Das Absetzen von Kristallen kann zu einer heterogenen Kristallpopulation mit sehr großen und kleinen Kristallen führen. Das Rühren der Kristallisationslösung kann auch die Keimbildung fördern^44,45.

Leider produzierten die ungesäten 30% (w/v) PEG 6.000 keine Kristalle, so dass die PEG-Konzentration auf 35% (w/v) erhöht wurde. Dieser Anstieg verbesserte die Kristallisation deutlich, mit einem endgültigen_X-n- und_X-s-Bereich von 3,6 ± 1,2 x 10^{6 Kristallen}·mL-1 bzw. 42 ± ^4,1 μm (Abbildung 8A und B - schwarz). Obwohl es sich um eine deutliche Verbesserung und eine akzeptable Kristallkonzentration handelte, waren die endgültigen Kristalle für das geplante Experiment zu groß, so dass weitere Optimierungen vorgenommen wurden. Um die Größe der endgültigen Kristalle zu reduzieren, wurden zwei Wege erforscht (Abbildung 1E): die Verringerung der Proteinkonzentration, um das endgültige Kristallwachstum zu begrenzen (Abbildung 8A und B - pink), und die Erhöhung der PEG-Konzentration, um die Nukleation zu erhöhen (Abbildung 8A und B - grün).

Die Verringerung der Proteinkonzentration reduzierte leider auch das X_n dramatisch, wodurch schließlich noch größere Kristalle entstanden. Die Erhöhung der PEG-Konzentration auf 40 % ergab einen endgültigen_X-n- und_X-s-Bereich von 3,1 ± 0,7 x 10⁶ Kristallen·mL-1 bzw. 39 ± 2,3 μm. Diese unterschieden sich nicht signifikant von den 35%, aber da die endgültige Kristallgröße reduziert wurde, wurde dieser Zustand mit den weiteren Optimierungen fortgesetzt.

Um das X_n zu erhöhen, wurden Samen hinzugefügt. Dies führte zu einer dramatischen Erhöhung des X_n (1,1 ± 1,8 x 10⁸ Kristalle·mL-1) und führte zu einem kleineren X_s (4,2 ± 4,0 μm) (Abbildung 8A und B - violett gestrichelt). Diese Kristalle, obwohl sie für einige serielle Kristallographie-Experimente sehr gut geeignet waren, wurden als zu klein erachtet, so dass die Konzentration der zugesetzten Samen geändert wurde.

Diese Abstimmung des zugesetzten Saatguts erwies sich jedoch als schwierig, diese zuverlässig zu wiederholen; Daher wurde versucht, sie abzuschrecken. Nach der Zugabe eines Saatguts wurde die Kristallgröße überwacht und sobald eine geeignete Kristallgröße (ca. 10 - 20 μm) erreicht war, wurde die Batch-Kristallisation abgeschreckt (Abbildung 8C und D). Das Abschrecken wurde in Bezug auf die Mikrokristallisation in Kupitz et al. (2014)²⁵ vorgeschlagen. Obwohl es sich vielleicht nicht um eine ideale Methode handelt, da Proteinlösung letztendlich verschwendet wird²⁶, war die Technik in dieser Situation sehr nützlich, da das Kristallwachstum schwer zu kontrollieren war. Die Idee hinter dem Abschrecken besteht darin, das Kristallisationsgemisch schnell auf einen Punkt knapp über der Löslichkeitslinie zurückzubringen (Abbildung 1F). Sobald die Lösung in die Löslichkeitslinie zurückgekehrt ist, ist die Lösung zu einer stabilen, gesättigten Lösung zurückgekehrt, und es tritt kein weiteres Kristallwachstum auf.

Der Versuch, eine Kristallisationsreaktion abzuschrecken, ist nicht ohne Risiko. Wenn eine zu große Abschrecklösung zugegeben wird, kann das Protein in Lösung so stark verdünnt werden, dass die Löslichkeitslinie überschritten wird. In diesem Fall wird die Lösung untersättigt und die Kristalle beginnen sich aufzulösen. Um dies zu verhindern, ist es möglich, die Menge der benötigten Abschrecklösung auf der Grundlage der Morphogrammergebnisse abzuschätzen. Nehmen Sie an der Stelle der Abschreckung die Konzentration der Proteinlösung. Durch den Vergleich der Proteinkonzentration an der Löslichkeitslinie und der Proteinkonzentration in Lösung kann eine Abschätzung der erforderlichen Verdünnung vorgenommen werden.

Die abgeschreckte Version des 40% (w/v) PEG 6.000, 10 x verdünnten Seed-Experiments ergab eine endgültige Kristallkonzentration und einen Größenbereich von 2,6 ± 3,1 x 10⁶ Kristallen·^mL-1 bzw. 15 ± 3,9 μm.

Während des gesamten Prozesses wurden an der PXII-Strahllinie der Synchropin-Lichtquelle Schweiz mit einem 10 x 30 μm Fokus, einer um 80% abgeschwächten Energie von 12,4 keV und unter Kryobedingungen Teströntgendaten der Endothiapepsin-Kristalle gesammelt. Die Daten wurden mit Hilfe von Zifferblättern verarbeitet und Abbildung 9 zeigt einen Vergleich von CC_1/2. Im Verlauf der Optimierung wurde keine dramatische Veränderung von CC_1/2 beobachtet.

Abbildung 1: Ein Überblick über Übergangs- und Batch-Kristallisations- und Skalierungsmethoden, die in einem Phasendiagramm abgebildet sind. Die Zonen und Grenzen des archetypischen Phasendiagramms der Proteinkristallisation. Die Fällungsmittel- und Proteinkonzentrationen werden auf der x - bzw. y-Achse aufgetragen, wobei der Reinwasserpunkt am Ursprung liegt. Die violette Linie zeigt die Grenze der Proteinübersättigung an, und die metastabilen, Nukleations- und Niederschlagszonen sind in blau, grün bzw. rosa dargestellt. B. Ein Beispiel für die Penetrationsgrenzen der Nukleationszone einer "Übergangsphase"-Kristallisationsmethode, wie z. B. Dampfdiffusion. In diesem theoretischen Experiment beginnen die Tropfenfällungsmittel- und Proteinkonzentrationen knapp unterhalb der Löslichkeitsgrenze – noch nicht übersättigt. Während sich der Tropfen ausgleicht, steigen die Konzentrationen der Tropfenkomponenten an, so dass der Tropfen übersättigt wird und sich weiter in die Nukleationszone bewegt - oder übergeht. Nach der Kristallkeimbildung beginnt die Proteinkonzentration in Lösung zu sinken. Die Konzentration sinkt mit dem Wachstum der Kristalle weiter, bis sie schließlich an der Löslichkeitsgrenze aufhört. Die blau gestrichelte Linie markiert eine theoretische Grenze des Übergangs in die Nukleationszone. Sobald die Keimbildung beginnt, sinkt die Proteinkonzentration und verhindert ein weiteres Eindringen. C. Beispiele für Batch- und Seeded-Batch-Kristallisationsverläufe. Im Batch muss durch das Mischen von Protein und Fällungsmittel eine übersättigte Lösung innerhalb der Nukleationszone entstehen, damit es zu einem Kristallwachstum kommen kann. Bei Seeded-Batch ist es aufgrund der Zugabe von Mikrosamen nicht unbedingt notwendig, sich in der Nukleationszone zu befinden, so dass auch Standorte in der metastabilen Region erkundet werden können. D. Eine hypothetische Optimierung des in B gezeigten Kristallisationsexperiments von der Dampfdiffusion bis zur Charge. Der ursprüngliche Ausgangspunkt der Dampfdiffusion ist über den resultierenden Optimierungsvektor in die neue Startposition übergegangen; innerhalb der Nukleationszone. Der resultierende Vektor ist das Produkt zweier Optimierungen: einer Erhöhung der Protein- und Fällmittelkonzentration. E. Beispiele für Optimierungen bei der Skalierung von Batch-Bedingungen, um die endgültigen X_n und X_s anzupassen. F. Abschrecken des Kristallisationsexperiments durch Zugabe von Kristallisationspuffer. Es ist wichtig, dass durch die Abschreckung die Proteinkonzentration nicht aus dem metastabilen Bereich und damit unter den Punkt der Proteinübersättigung gebracht wird. Andernfalls lösen sich die Kristalle wieder in Lösung auf. B. und C . wurden mit Genehmigung der Autoren von Beale et al. (2019)²⁶ übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Erhöhen von X_n und Verringern von X_s. Die idealisierte Beziehung zwischen der Anzahl der Kristalle, die aus einem Kristallisationsexperiment erzeugt werden, und ihrer mittleren längsten Dimension. Um diesen Graphen zu erstellen, wurde die Kristallisation eines hypothetischen 10 kDa Modellproteins verwendet. Das Protein kristallisierte in einer Konzentration von 10 mg/ml und ergab P2₁2 1 2_{1 Kristalle} mit Abmessungenvon 49x50x51 Å. Es wurde angenommen, dass jedes Nukleationsereignis einen Kristall hervorbringt. Es wurde angenommen, dass das Kristallwachstum von allen Seiten homogen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Ein Flussdiagramm, das die Schritte zur Optimierung eines Kristalls, der in einem Dampfdiffusionsexperiment mit kleinem Volumen (<500 nL) gezüchtet wurde, in ein großvolumiges (> 100 μl) Batch-Experiment zeigt. Die Kristalloptimierung gliedert sich in drei Phasen: (1) Optimierung der Kristallmorphologie. (2) Übergang zum Batch. (3) Skalierung. In Stufe 1 ist es wichtig, geeignete Kristalle für die Mikrokristallisation zu identifizieren. Einige Proteine liegen nur in einer Einkristallmorphologie vor, unabhängig von den Kristallisationsbedingungen. Es lohnt sich jedoch, nach Bedingungen zu suchen, die einzelne, würfelartige Kristalle hervorbringen oder diesen so nahe wie möglich kommen. Einzelne, würfelartige Kristalle führen hypothetisch und anekdotisch im Allgemeinen zu besseren Ergebnissen bei seriellen Kristallographie-Experimenten. Nachdem eine Kristallmorphologie ausgewählt und die Beugung bestätigt wurde, ist es notwendig, das Kristallisationsexperiment von der Dampfdiffusion in die Charge zu überführen (Stufe 2). Hier sollen Kristalle durch ihre Nukleationszeit optimiert werden. Das Ziel ist es, Bedingungen zu finden, die schnell erscheinende Kristalle (> 24 h) ergeben, da diese Bedingungen wahrscheinlich sofort auf die Nukleationszone treffen und daher chargenweise sind. Sobald ein Zustand in der Nukleationszone gefunden wurde, kann ein Morphogramm erstellt werden. Das Morphogramm ermöglicht es, den Großteil der Nukleationszone zu kartieren und potenzielle Skalierungsrouten für Stadium 3 zu identifizieren. Das Volumen einer identifizierten Chargenbedingung kann dann entweder schrittweise oder schnell in der Größe skaliert werden, um ein endgültiges Volumen von >100 μl zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Eine Analyse der Kristallisationsbedingungen von Endothiapepsin aus einem PACT-Sparse-Matrix-Screen. A . und B. sind Fotos nach 24 h der Wells A4 bzw. C10 vom PACT-Screen . Die Kristallisationspufferkomponenten sind in der Abbildung hervorgehoben. Der SPG-Puffer besteht aus Bernsteinsäure, Natriumdihydrogenphosphat und Glycin, die in einem molaren Verhältnis von 2:7:7 gemischt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Eine Analyse der Endothiapepsin-Kristallisationsoptimierung unter den PACT MgCl_{2-Bedingungen} . A. Eine Heatmap der Ergebnisse einer Pearson-Korrelationsanalyse zwischen dem Puffer-pH-Wert, der_{MgCl2-Konzentration} und der Fällungsmittelkonzentration sowie dem Niederschlagsgrad und der Kristallqualität. Sowohl die Niederschlagsmenge als auch die Kristallqualität wurden willkürlich auf einer Skala von 0-5 (wobei 0 keine Kristalle oder Ausfällungen bedeutet) nach 24 Stunden v. Chr . bewertet.und D . zeigen Beispiele für die Kristallisation und Ausfällung in drei verschiedenen Tropfen. Der Kristallisationszustand und die Einschätzungen des Ausscheidungsgrades und der Kristallqualität werden ebenfalls dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Ein Endothiapepsin-Morphogramm bei Kristallisation in 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M_MgCl2 und PEG 6.000. Ein Morphogramm, das aus der bereitgestellten Tabelle "Phasendiagramm-Generator" erstellt wurde. Die relative Anzahl der Kristalle in jedem Tropfen wird durch die Größe der Kreise angegeben, und die Ergebnisse von Tropfen 1 (Protein und Fällungsmittel) und Tropfen 2 (Protein, Fällungsmittel und Samen) werden grün bzw. blau hervorgehoben. Die Werte der Protein- und Fällmittelkonzentrationen auf der x- bzw. y-Achse bezeichnen jeweils vorgemischte Werte und keine Endvolumina. Basierend auf den Ergebnissen wurden schwarze Linien und eine violette Linie gezeichnet, um die Grenzen der Nukleationszone bzw. der metastabilen Zone darzustellen. v. Chr. und D. zeigen einige Beispielergebnisse aus dem Experiment. Die roten und blauen Punkte, die auf A. markiert sind, zeigen die Standorte von B. und C an.bzw. D.. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Erste Skalierungsversuche mit Endothiapepsin in 24-Well-Hanging-Drop-Plates. Für alle Trails wurden die gleichen Protein- und Fällungsmittelkonzentrationen verwendet: 100 mg/ml Endothiapepsin in 0,1 M Na Acetat pH 4,6 und 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl₂ bzw. 30 % (w/v) PEG 6.000. Alle angezeigten Bilder wurden nach 24 Stunden aufgenommen und die endgültigen Tropfenvolumina sind auf jedem Bild beschriftet. Die linke Tafel (A, D und G) ist eine 1:1-Mischung aus Protein und Fällungsmittel, die mittlere Tafel (B, E und H) ist eine 1:2:3-Mischung aus Samen, Fällungsmittel und Protein und die rechte Tafel (C, F und I) sind vergrößerte Bilder der mittleren Tafel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Analyse der Endothiapepsin-Mikrokristallisation in 200-300 μL Volumen. A. und C. zeigen, wie sich X_n über die Versuchszeit verändert hat. B. und D. zeigen, wie sich X_s (längste Dimension) im Laufe der Zeit verändert hat. Die Ergebnisse der Experimente wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit getrennt. Die rot gestrichelte Linie auf C. und D. zeigt den Punkt, an dem die Abschreckung durchgeführt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 9: CC_{1/2-Ergebnisse} und Bilder von Kristallen, die in jeder Phase des Mikrokristallisationsprozesses zur Beurteilung der Beugungsqualität aufgenommen wurden. CC_1/2 aufgetragen gegen die Auflösung von Daten, die von gezüchteten Kristallen gesammelt wurden: mit und ohne Mg - Teil der Phase-1-Optimierung, in einem Volumen von 200 nL, einem Volumen von 10 μL und dem endgültigen Volumen von 300 μL. B.C. und D. zeigen die Kristalle aus dem Volumen von 200 nL, 10 μL bzw. 300 μL. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Informationen zu Proteinen
Protein	Endothiapepsin
Molekulargewicht (kDa)	33.8
Spacegroup (Raumgruppe)	P12 11
a, b, c (Å)	45.2, 73.3, 52.7
α, β, ɣ (°)	90.0, 109.2, 90.0
Parameter mit festem Ziel
Geladenes Volumen pro Chip (μL)	150
Blenden pro Chip	25,600
Erforderliche Kristallkonzentration (Kristalle/ml)	500,000
Beispielhafte Informationen
Proteinmasse, die zur Herstellung von 200 μl Probe (mg) verwendet wird	10
Längste Abmessung des Kristalls (μm)	15
Kristallkonzentration (Kristalle/ml)	2,500,000
Experimentelle Variablen
Anzahl der erforderlichen Zeitpunkte	5
Anzahl der benötigten Bilder pro Zeitpunkt	50,000
Trefferquote (integrierte Muster/Bilder gesammelt)	0.3
Erforderliche feste Ziele pro Zeitpunkt (aufgerundet)	7
Beispielhafte Anforderungen
Benötigtes Probenvolumen pro Zeitpunkt (μL)	1,050
Benötigtes Gesamtprobenvolumen für das Experiment (ml)	5.25
Benötigte Gesamtmasse des Proteins (mg)	52.5

Tabelle 1: Ein Beispiel für die Probenanforderungen für ein hypothetisches optisches Pump-Probe-Experiment, das mit festen Targets durchgeführt wird. Das Protein, das in diesem theoretischen Experiment verwendet wurde, war Endothiapepsin. Die Fixed-Target-Parameter basieren auf Experimenten, die in Ebrahim et al. (2019)⁴⁸ und Davy et al. (2019)⁴⁹ berichtet wurden. Die Stichprobeninformationen stammten aus dem Protokoll, über das in diesem Videoartikel berichtet wurde, und die experimentellen Variablen waren konservative Schätzungen, die auf gelebter Erfahrung basierten. Die folgenden Beispielanforderungen wurden unter Berücksichtigung der bisherigen Annahmen nachträglich berechnet.

Diskussion

Die vorgestellte Methode zeigt, wie die Kristallisation von Endothiapepsin von großen Kristallen (≥ 100 μm längster Dimension), die in 96-Well-Screens mit dünner Matrix gezüchtet wurden, zu Mikrokristallen, die in Zentrifugenröhrchen (300 μl Volumen) gezüchtet wurden, per Batch optimiert werden kann. Die Idee hinter dem Protokoll ist, dass die Schritte zur Optimierung von Endothiapepsin auch für andere Proteine genutzt werden könnten. Letztendlich wird das Problem der Erzeugung großer Mengen (>100 μL) von Mikrokristallen (10-20 μm) für serielle Kristallographie-Experimente an XFELs und Synchrotrons gelöst.

Das Protokoll unterteilt die Aufgabe der großvolumigen Mikrokristallisation in drei Schritte: (1) Optimierung der Kristallmorphologie, (2) Übergang zum Batch und (3) Skalierung. In Schritt 1 sollte die Bandbreite der Kristallformen, die ein Protein erzeugen kann, in Dampfdiffusionsplatten untersucht werden. Das Ziel sollten Bedingungen sein, die zu einzelnen, kastenförmigen Kristallen führen, die sich bis zur erforderlichen Auflösung beugen. In Schritt 2 können dann ausgewählte Bedingungen von Dampfdiffusion in Charge umgewandelt werden. Hier ist das Optimierungskriterium die Kristallwachstumszeit und das Finden von Bedingungen, die innerhalb von 24 h zu Proteinkristallen führen. Es kann auch ein Morphogramm erstellt werden, das dem Experimentator eine Vorstellung von der Lage der Löslichkeitslinie und der Grenzen der Nukleationszone gibt. Dieses Morphogramm ist in Schritt 3, Skalierung, von großem Nutzen. Das Morphogramm gibt Aufschluss darüber, ob die Nukleation allein X_n erhöhen und X_{s senken} kann. Mit zunehmendem Volumen des Experiments können X_n und X_s kontinuierlich als Schlüsselkriterien für den Skalierungserfolg bewertet werden.

Im Fall von Endothiapepsin wurde in Schritt 1 eine möglicherweise bisher unbekannte Kristallmorphologie für Endothiapepsin zutage gefördert. Diese Morphologie hatte die gleiche Raumgruppe wie die zuvor beschriebenen, aber, was für die serielle Kristallographie wichtig ist, eine eher kastenartige Form. Einkristalle schienen auch aus einzelnen Nukleationspunkten zu wachsen, im Gegensatz zu den Fächern, die unter anderen Bedingungen entstanden (Abbildung 4). Für die gewählte Bedingung war Schritt 2 bereits teilweise erfüllt, da das Kristallwachstum in < 24 h erfolgte. Das Morphogramm deutete darauf hin, dass sowohl ein Straight- als auch ein Seeded-Batch-Protokoll bei der Skalierung in Schritt 3 erfolgreich sein könnte. Die anfängliche Skalierung in reiner Charge schuf eine Bedingung, die Kristalle mit einem_X-n - und_X-s-Bereich von 3,6 ± 1,2 x 10^{6 Kristallen} ·^mL-1 bzw. 42 ± 4,1 μm erzeugte. Diese Kristalle waren zwar für einige serielle Kristallographie-Experimente akzeptabel, wurden aber als zu groß erachtet. Daher wurden zusätzliche Optimierungen vorgenommen. Das endgültige Protokoll erzeugte Kristalle mit einem Konzentrations- und Größenbereich von 3,1 x 10,⁶ Kristallen·^mL-1 bzw. 15 ± 3,9 μm. Das war für die geplanten Experimente mehr als ideal.

Die Methode konzentriert sich auf die Umwandlung von "löslichen" Proteinkristallen, die in Dampfdiffusionsplatten gezüchtet wurden, in Batch. Der Grund für diese Fokussierung ist, dass die überwiegende Mehrheit der löslichen Proteinkristalle durch Dampfdiffusion²⁶ gezüchtet wird. Die vorgestellten Konzepte ließen sich aber auch auf lösliche Proteinkristalle anwenden, die mit anderen Methoden, wie z.B. Micro-Batch, gezüchtet wurden. Die Konzepte können auch auf Membranproteinkristalle anwendbar sein, die in LCP gezüchtet wurden. da es sich auch hier um einen Batch-Kristallisationsprozess handelt.

Ein Schlüsselaspekt des Protokolls ist der Prozess, die Bedingungen von Kristallen, die in Dampfdiffusionsplatten gezüchtet werden, so umzuwandeln, dass sie in Batches gezüchtet werden können. Für diese Transformation verwendet die Methode das von Beale et al. (2019)²⁶ vorgeschlagene Kriterium. Kristalle, die im Batch-Verfahren gezüchtet werden, bilden sich auch in Dampfdiffusionsplatten schnell (< 24 h). Dieses Kriterium ist eine Näherung, die auf der Geschwindigkeit der Dampfdiffusionstropfenäquilibrierung basiert, und gilt am ehesten für PEG-basierte Fällungsmittelbedingungen. Die Kristallisationsbedingungen enthalten jedoch eine Vielzahl von Verbindungen, die die Äquilibrierungszeit beeinflussen. Die Äquilibrierung von salzbasierten Kristallisationsbedingungen, z.B. hochkonzentriertem Ammoniumchlorid, kann in 1-2 Tagen erfolgen. Daher ist das 24-Stunden-Kriterium für salzbasierte Bedingungen möglicherweise nicht zutreffend. Salzbasierte Bedingungen können auch komplexere Phasendiagramme^26,30 aufweisen^, die möglicherweise nicht dem in diesem Protokoll vorgestellten Archetyp entsprechen. Eine Reduzierung des Zeitkriteriums für salzbasierte Bedingungen auf 12 oder 6 h kann erforderlich sein, wenn sich eine Skalierung auf größere Volumina als unmöglich erweist.

Eine weitere Einschränkung dieser Methode ist ihre scheinbare Komplexität. Das Protokoll, das befolgt wurde, um die Mikrokristallisation von Endothiapepsin zu optimieren, änderte den ursprünglichen Zustand des dünnen Matrix-Screens relativ wenig. Der erste Treffer, der im PACT-Screening beobachtet wurde, war 0,1 HEPES pH 7,0, 0,2 M_MgCl2 und 20 % (w/v) PEG 6.000. Der endgültige skalierte Kristallisationspuffer betrug 0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M_MgCl2 und 40 % (w/v) PEG 6.000. Es ist auch sehr gut möglich, dass die Änderung des Puffers von HEPES zu Tris-HCl und die_{MgCl2-Konzentration} wenig zum Erfolg des Prozesses beigetragen haben. Die Erhöhung der PEG 6.000-Konzentration war die einzige Optimierung, die ganz einfach hätte erreicht werden können.

Diese Einschätzung ist aber auch zu einfach. Es ignoriert nicht nur die Probleme, die bei der Skalierung auftreten (d. h . die Verwendung von Saatgut und das Abschrecken), sondern auch die Tatsache, dass es keine Garantie dafür gibt, dass sich auch das nächste als einfach erweisen wird, nur weil sich dieses Protein als einfach erwiesen hat. Die im Protokoll empfohlenen Schritte wurden entwickelt, weil die Optimierung der Skalierung von Proteinkristallisationsvolumina sehr proteinteuer sein kann. In den sieben gezeigten Studien zur Endothiapepsin-Skalierung wurden 100 mg Protein konsumiert. Zwar wurden einige dieser Schritte durchgeführt, um ihre Konsequenzen im Lichte dieses Protokolls aufzuzeigen. Trotzdem können 100 mg eines Proteins plus möglicherweise weitere 50 mg für Protein, das während eines Experiments verbraucht wird (Tabelle 1), eine erhebliche Investition in Zeit oder Geld sein.

Glücklicherweise ist nicht klar, ob diese Masse an benötigter Probe bei allen Proteinen allgegenwärtig ist. Endothiapepsin war gut löslich und erforderte daher eine hohe Proteinkonzentration, um eine Übersättigung zu erreichen. In anderen (derzeit in der Optimierung) kann eine Übersättigung bei 10 oder sogar 5 mg/ml erreicht werden. Solche Variablen sind proteinspezifisch und müssen berücksichtigt werden, wenn sie auftreten.

Zu den weiteren Einschränkungen der Methode gehört die Abhängigkeit von komplexen Geräten wie Liquid-Handling-Robotern für die Sieb- und Plattenerstellung und Imagern zur automatischen Belichtung von Platten bei Bedarf. Es wurden alternative Routinen angeboten, um den Bedarf an einigen dieser Geräte zu begrenzen, aber das Protokoll wird ohne sie zeitaufwändiger zu befolgen sein. Das Protokoll schlägt auch vor, die Beugung optimierter Kristalle zu testen. Für Kristallographen, die keinen regelmäßigen Zugang zu einem Synchrotron haben, könnten sich diese Tests als Herausforderung erweisen. Kontrollen bei jedem Schritt sind möglicherweise nicht erforderlich, aber diese Tests werden dringend empfohlen, sobald ein Treffer identifiziert wurde, sowie vor und nach der Skalierung. Nicht-beugende Kristalle an einem XFEL sind leider keine Seltenheit. Vor diesem Hintergrund ist es besser, bei Annahmen über die Kristallbeugung auf Nummer sicher zu gehen.

Letztendlich werden dieses Protokoll und die hier vorgestellten Ergebnisse einen Leitfaden, Ideen und ein Beispiel für diejenigen bieten, die Schwierigkeiten haben, Proben für serielle Kristallographie-Experimente herzustellen. Es bleibt zu hoffen, dass mit der Weiterentwicklung der seriellen Kristallographie der Probenbedarf der Technik so reduziert wird, dass der Bedarf an Protokollen wie diesem verringert wird. Aber auch in diesem Fall werden die hier vorgestellten Strategien für diejenigen nützlich sein, die den Kristallisationsraum ihres Proteins erforschen möchten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Swissci 96-Well 2-Tropfen-Platten	Molekulare Abmessungen	MD11-002	96-Well-2-Tropfen-Kristallisationsplatte
Swissci 96-Well 3-Tropfen-Platten	Molekulare Abmessungen	MD11-003	96-Well-3-Tropfen-Kristallisationsplatte
Mosquito LCP Liquid-Handling-Roboter	sptlabtech	Mosquito LCP	Kristallisationsroboter
ClearVue Sheets	Molekulare Abmessungen	MD6-015	96-Well-Kristallisationsplattendichtungen
Safe-Tube 1,5 mL	Eppendorf	30120086	1,5 mL Zentrifugenröhrchen
Scaple	Swan und Morton	Nr. 3 Skalp und Nr. 3 Griff	Skalp zum Schneiden von offenen Plattendichtungen
MS 3 Vortex	IKA	3319000	Vortex zum Mischen von Lösung und Herstellung von Saatgut
24-Well-XRL-Platte	Molekulare Abmessungen	MD3-11	24-Well-Hängeplatten
Röhrchenrevolver/Rotator	Thermo Fischer Scientific	88881001	Röhrchenrevolver zum Mischen der Lösung beim
Skalieren Eppendorf Research plus Pipetten	Eppendorf		Sortiment an manuellen Pipetten, 0,5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 & Mikro; L
Eppendorf Pipettenspitzen	Eppendorf		Auswahl an Spitzengrößen für manuelle Pipetten
Suparen 600	Prochem AG	Suparen 600	Endothiapepsin Lösung
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	241245-1KG	Natriumacetat
Tris	Merck	8382T014	Tris
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M2670-1kg	Magnesiumchlorid
PEG 6.000	Sigma-Aldrich	81255-1kg	PEG 6.000
Ethylenglykol	Sigma-Aldrich	324558-1L	Ethylenglykol zum Schutz der Kristalle
PACT Premier HT Sieb	Molecular Dimensions	MD1-36	PACT Premier 96-Well-Kristallsieb
DOW CORNING Hochvakuumfett	Molecular Dimensions	MD6-02	Fett zum Versiegeln von 24-Well-Platten
Hirschmann 22 x 22 mm Glaser-Abdeckfolien	Hirschmann	8000104	Abdeckfolien zum Versiegeln von 24-Well-Sitzplatten
Kristallpins	PSI	Hergestellt im eigenen Haus	Dünnschichtträger für Mikrokristalle.
1-1,3 mm SiLibeads Typ S	Faust	6239547	Glasperlen zur Herstellung von Mikro-Samenstöcken
Macbook Pro	Apple	Macbook Pro	Computer zur Datenanalyse
CCP4 Software-Suite	CCP4		Beugungsmuster Datenverarbeitungssoftware
Excel	Microsoft	Microsoft Office	Plotting-Tool für Phasendiagramm
Hausser Scientific Bright-Line-Zählkammer	Thermo Fischer Scientific	02-671-51B	Werkzeug zur Berechnung der Kristallkonzentration
PACT Premier	Molecular Dimensions	MD1-29-ECO	Kristallisationssieb mit dünner Matrix
Imager	Formulatrix	Rock Imager	Temperaturgesteuerter Kristallplatten-Speicher und Imager
Rock MakerWeb	Formulatrix	Rock MakerWeb	Erstellung von Kristallplatten und Bildspeicherung Formulator
Formulatrix		Formulator	Erstellung von 96-Well-Kristallbildschirmen Liquid-Handling-Roboter
Leica MZ16 Mikroskop	Leica	Leica MZ16	Lichtmikroskop
LAS V4.6	Leica	LAS V4.6	Software für Leica Mikroskope
Spectra/Por 3,5 kDa Dialyseschläuche	Spectrumlabs	Spectra/Por 3 Dialysemembran	3,5 kDa Dialysemembran
Verschlüsse für Dialyseschläuche	Spectrumlabs	Spectra/Por 3 Duniversal Verschlüsse	Clips zum Abdichten der Dialyseschlauchenden
Amicon 10 kDa Zentrifugalkonzentrator	Merck-Millipore	Amicon Ultra-15 10 kDa Zentrifugalkonzentrator	10 kDa Zentrifugalfilter
5810 R Schwenkschaufelzentrifuge	Eppendorf	5810 R Zentrifuge	Schwenkschaufel-Zentrifuge