Fäkale (Mikro-) RNA-Isolierung

Summary

Dieses Protokoll isoliert hochwertige Gesamt-RNA aus Kotproben von Tieren und Menschen. Ein kommerzielles miRNA-Isolierkit wird mit signifikanter Adaption verwendet, um reine RNA mit optimierter Quantität und Qualität zu isolieren. Die RNA-Isolate eignen sich für die meisten nachgeschalteten RNA-Assays wie Sequenzierung, Micro-Array und RT-PCR.

Abstract

Es wird deutlich, dass RNA im Darmlumen und Kot von Tieren und Menschen existiert. Das unten beschriebene Protokoll isoliert die Gesamt-RNA einschließlich microRNAs aus Stuhlproben von Tieren und Menschen. Ziel ist es, Gesamt-RNA mit hoher Reinheit und Menge für nachgeschaltete Analysen wie RNA-Sequenzierung, RT-PCR und Micro-Array zu isolieren. Die Vorteile dieses optimierten Protokolls in der miRNA-Isolierung sind die Fähigkeit, hochgereinigte RNA-Produkte mit zusätzlichen beschriebenen Waschschritten zu isolieren, eine erhöhte Menge an RNA, die mit einer verbesserten Methode bei der Resuspension der Probe erhalten wird, und wichtige Tipps zur Dekontamination. Eine Einschränkung ist die Unfähigkeit, größere Proben von mehr als 200 mg zu verarbeiten und zu reinigen, da diese Probengrößen eine Schwierigkeit bei der klaren Bildung der Interphase verursachen würden. Folglich kann die große Probengröße die zu extrahierende wässrige Phase wie im Protokoll beschrieben mit organischen Stoffen kontaminieren, die die Qualität der am Ende isolierten RNA beeinträchtigen. Für die meisten nachgeschalteten Analysen reichen jedoch RNA-Isolate aus einer Probe von bis zu 200 mg aus.

Introduction

Extrazelluläre RNA wird als ein bedeutender Faktor erkannt, der viele biologische Prozesse vermittelt¹. Extrazelluläre RNA im Kot wurde erstmals 2008 als Marker für Darmkrebs und aktive Colitis ulcerosa² berichtet und kürzlich als normaler Bestandteil des Darmlumens und -kots nachgewiesen und vermittelt die Wirt-Mikroben-Kommunikation ^3,4,5. Der Zweck dieses RNA-Isolationsprotokolls ist es, qualitativ hochwertige extrazelluläre RNA aus Stuhlproben von Tieren und Menschen zu extrahieren. Das Protokoll wurde von einem kommerzielle....

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden mit Versuchstieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Brigham and Women's Hospital der Harvard Medical School genehmigt.

Alle hier beschriebenen Methoden mit Humanforschungssubjekten entsprechen den Richtlinien des Partners Human Research Committee.

1. Entnahme von Kotproben

1. Autoklav oder Vorbereitung eines sterilen und nukleasefreien 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens mit Schraubverschluss für jedes Tier in einem Versuch.
   1. Stellen Sie für menschliche Probanden eine geeignete, nukleasefreie und sterile Stuhlprobenentnahmevorrichtung für ....

Results

Repräsentative RNAs wurden aus 50 mg Mauskotproben (2 Mauskotpellets) bzw. 100 mg menschlichen Stuhlproben isoliert und in 50 μL nukleasefreiem Wasser eluiert. Die Spektralphotometeranalyse der Konzentration legt nahe, dass insgesamt 49 μg bzw. 16 μg RNA isoliert wurden (Tabelle 1). Die RNA-Reinheit war hoch, was durch ein A260/A280-Verhältnis von ~2,0 und ein A260/A230-Verhältnis von ~1,8 angezeigt wird (Tabelle 1). Wie berichtet³, ist die Mehrheit der RNAs im Ko.......

Discussion

Es ist wichtig, eine RNase-freie Technik zu verwenden, um eine RNase-Kontamination während der Isolierung zu verhindern⁷. Nach der Zentrifugation und der Bildung einer kompakten Interphase ist es wichtig, zu vermeiden, dass die Interphase, die untere Phase und die Partikelverunreinigung auf der Oberseite der wässrigen Phase schwimmen, wenn die wässrige Phase zurückgewonnen wird. Zusätzlich werden zwei Waschschritte mit 500 μL und 250 μL Waschlösung 2/3 hinzugefügt, um Verunreinigungen in der Filte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Säure-Phenol: Chloroform, pH 4,5 (mit IAA, 125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium	Thermo Fischer Scientific	14190-144
Handschuhe
Mikrozentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1561
Nukleasefreie Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL, 2 mL)
Nukleasefreies Wasser (nicht DEPC-behandelt)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
Pipettier- und nukleasefreie Pipettenspitzen (mit Filter)
PowerLyzer 24 Homogenisator	QIAGEN	13155
RNaseZap RNase Dekontaminationslösung	Thermo Fischer Scientific	AM9780
Vortex-Schüttler