Fäkale (Mikro-) RNA-Isolierung

Extrazelluläre RNA wird als ein bedeutender Faktor erkannt, der viele biologische Prozesse vermittelt¹. Extrazelluläre RNA im Kot wurde erstmals 2008 als Marker für Darmkrebs und aktive Colitis ulcerosa² berichtet und kürzlich als normaler Bestandteil des Darmlumens und -kots nachgewiesen und vermittelt die Wirt-Mikroben-Kommunikation ^3,4,5. Der Zweck dieses RNA-Isolationsprotokolls ist es, qualitativ hochwertige extrazelluläre RNA aus Stuhlproben von Tieren und Menschen zu extrahieren. Das Protokoll wurde von einem kommerziellen miRNA Isolation Kit adaptiert. Die gewonnene RNA wird für nachgeschaltete Analysen wie RNA-Sequenzierung, RT-PCR und Micro-Array verwendet. Das Protokoll enthält mehrere wichtige und nützliche Tipps, um die Menge und Qualität der RNA im Kot von Tieren und Menschen zu maximieren. Der Grund für die Entwicklung und Optimierung dieser Methode der RNA-Isolierung (einschließlich microRNA) besteht darin, die mikrobielle RNA im Kot zu verringern, die Variablen in den Forschungsstudien zu begrenzen und die RNA-Zusammensetzung im Darm zu analysieren, ohne verschiedene Störfaktoren und Kontaminationsquellen zu berücksichtigen. Bemerkenswert ist, dass diese RNA-Isolierung die Freisetzung von RNA aus lebenden Zellen und lebenden Mikroben (zelluläre RNA) minimiert. Es konzentriert sich auf extrazelluläre RNAs, die von Darmzellen freigesetzt oder über die Nahrung aufgenommen wurden. Grundsätzlich ist diese Methode nicht für Studien geeignet, bei denen das mikrobielle Transkriptom untersucht wird.

Alle hier beschriebenen Methoden mit Versuchstieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Brigham and Women's Hospital der Harvard Medical School genehmigt.

Alle hier beschriebenen Methoden mit Humanforschungssubjekten entsprechen den Richtlinien des Partners Human Research Committee.

1. Entnahme von Kotproben

1. Autoklav oder Vorbereitung eines sterilen und nukleasefreien 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens mit Schraubverschluss für jedes Tier in einem Versuch.
   1. Stellen Sie für menschliche Probanden eine geeignete, nukleasefreie und sterile Stuhlprobenentnahmevorrichtung für jeden Probanden bereit.
2. Sammeln Sie 25-100 mg (ca. 1-4 Kotpellets für Mauskotproben) Stuhlproben von jedem Tier in einer sterilen Umgebung.
   HINWEIS: Zwei oder mehr fäkale Pellets (~ 50 mg oder schwerer) werden bevorzugt, um RNA von höchster Reinheit zu erhalten.
   1. Verwenden Sie alle notwendigen persönlichen Schutzausrüstungen (PSA) und Materialien, zum Beispiel: ein Paar Laborhandschuhe, ein Desinfektionsspray und ein steriles Papiertuch, um den Arbeitsbereich zu sterilisieren, in dem das Tierversuchsobjekt platziert wird, um eine Kontamination der Fäkalienprobe zu vermeiden.
      1. Weisen Sie bei Menschen jede Forschungsperson / jeden Sammler an, 100-200 mg Stuhlproben in einer möglichst sterilen Umgebung zu sammeln. Verwenden Sie den standardmäßigen sterilen Betrieb und vermeiden Sie die Kontamination der Stuhlprobe.
3. Sammeln Sie Stuhlproben von jedem Tier direkt in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss, ohne andere Oberflächen zu berühren, um eine Kontamination zu vermeiden.
   1. Weisen Sie jeden Probanden an, direkt in ein geeignetes Entnahmegerät (z. B. ein steriles Stuhlprobenentnahmeset) zu defäkieren, um eine Kontamination zu vermeiden.
      HINWEIS: Weisen Sie das Subjekt an, eine Kontamination durch Toilettenoberflächen, Wasser, Urin oder andere nicht sterile Oberflächen / Gegenstände zu vermeiden.
4. Fäkalproben, die in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt wurden, sofort bei -80 °C einfrieren oder in einen Eimer Trockeneis geben, um die bessere Menge und Qualität der RNA zu erhalten, bevor der Kot wie in den folgenden Schritten beschrieben resuspendiert wird.
   1. Bei menschlichen Stuhlproben aliquot jede frische Probe von 200 mg in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen geben und bei -80 °C einfrieren, bevor der Kot wie unten beschrieben resuspendiert wird.
      1. Für die Lagerung von Stuhlproben, die sich nicht in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen befinden, werden jeweils 100-200 mg gefrorene Proben gewogen und in separate 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen überführt, bevor der Kot wie unten beschrieben resuspendiert wird.
         HINWEIS: Vermeiden Sie bei menschlichen Stuhlproben die Entnahme von mehr als 200 mg Stuhlproben zur RNA-Isolierung, da dies in den folgenden Schritten zu Schwierigkeiten führen kann. Bei einer überladenen Probe in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen sind die wässrige Phase, die organische Phase und die Interphase möglicherweise nicht eindeutig gebildet und getrennt. Die Prozedur kann hier pausiert werden.

2. Zubereitung von Waschlösungen

1. Fügen Sie 21 ml 100%iges Ethanol der American Chemical Society (ACS) zu der Waschlösung 1 hinzu, die im miRNA-Isolierkit enthalten ist (siehe Materialtabelle), um das Endvolumen von 30 ml zu erreichen, wie auf der Flasche angegeben. Wirbeln, bis sich alles in der Flasche auflöst.
2. Fügen Sie 40 ml ACS-Ethanol der Qualität 100% in die bereitgestellte Waschlösung 2/3 hinzu, um das Endvolumen von 50 ml zu erreichen, wie auf der Flasche angegeben. Wirbel für 5 s oder bis die endgültige Mischung gut gemischt ist.

3. Vorbereitung von Geräten und Materialien

1. Besprühen Sie den Arbeitsbereich und die Ausrüstung, z. B. den Labortisch, den Arbeitsbereich im chemischen Abzug und die Mikrozentrifugenröhrchengestelle, mit einer Ribonuklease (RNase) Dekontaminationslösung (z. B. handelsübliche RNase-Dekontaminationslösung). Um eine Kontamination zu vermeiden, tragen Sie die RNase-Dekontaminationslösung auf die Oberflächen auf, wo und wann immer dies für notwendig erachtet wird.
2. Ziehen Sie einen sauberen Laborkittel an, setzen Sie eine Gesichtsmaske auf und tragen Sie geeignete Laborhandschuhe, um die RNA in den Kotproben vor Nukleasen auf der menschlichen Haut zu schützen. Sprühen Sie Handschuhe mit einer RNase-Dekontaminationslösung und wechseln Sie die Handschuhe häufig, um eine Kontamination zu vermeiden.
3. Bereiten Sie einen Eimer Trockeneis für fäkale Proben vor, die bei -80 °C gelagert werden, um ein Auftauen vor der Resuspension von Kot zu verhindern, und einen Eimer Eis für Materialien, zum Beispiel: Säure-Phenol: Chloroform, um die Haltbarkeit zu verlängern.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Materialien, einschließlich der im Protokoll verwendeten Medien, steril sind, ohne dass Nukleasen kontaminiert werden.

4. Fäkalien Resuspension

1. Resuspendieren Sie 25-100 mg Stuhlproben in 600 μL steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco.
   VORSICHT: Fäkalproben sollten sofort verarbeitet werden, wenn sie ab -80 °C aufgetaut werden, ohne auch nur teilweise aufzutauen, um die Freisetzung von RNasen und zellulärer RNA zu minimieren, da Eiskristalle sowohl innere als auch äußere Zellkompartimente reißen, wenn Zellen in der Probe auftauen.
   1. Fügen Sie 600 μL 1x DPBS in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss mit Kotproben bei Raumtemperatur (RT) hinzu.
   2. Inkubieren Sie die Mischung von Stuhlproben, die in 600 μL 1x DPBS in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen getaucht sind, das für 30 min bei RT verschlossen ist.
   3. Resuspendieren Sie die Mischung durch Maischen mit 1 ml Pipettenspitze und Wirbelbohrung mit dem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Um die Menge und Qualität der RNA zu optimieren und zu erhöhen, resuspendieren Sie die Mischung mit einem Homogenisator mit der Einstellung für einen Zyklus bei S4000 (oder 4000 U/min) und 45 s.

5. Organische Extraktion

VORSICHT: Verwenden Sie den gefährlichen chemischen Abzug für die folgenden Schritte bis Schritt 6 unter Verwendung von Säurephenol: Chloroform und ACS Klasse 100% Ethanol aufgrund ihrer Toxizität und Entflammbarkeit. Wechseln Sie die PSA nach Bedarf und befolgen Sie die entsprechenden Standardvorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Gefahrgut.

1. Extrakt RNA mit 600 μL Säure-Phenol: Chloroform (das Volumen von Säure-Phenol: Chloroform erforderlich entspricht dem Anfangsvolumen von 1x DPBS in Schritt 4.1).
   1. 600 μL Säure-Phenol: Chloroform in die Suspension aus Schritt 4.1 geben.
      HINWEIS: Säure-Phenol: Chloroform aus der unteren Phase in der Flasche zurückziehen, da die obere Phase mit einem wässrigen Puffer gemischt wird. Wenn die Interphase zwischen diesen beiden Phasen gestört ist, warten Sie und ziehen Sie Säure-Phenol: Chloroform nur zurück, wenn sich die Interphase wieder etabliert, um eine Kontamination zu vermeiden.
2. Wirbeln Sie die Mischung für 60 s gründlich mischen. Alternativ, um die Menge an RNA in der Ausbeute zu optimieren und zu erhöhen, mischen Sie mit einem Homogenisator mit der Einstellung für einen Zyklus bei S4000 und 45 s.
3. Zentrifugieren Sie für 15 min bei 10.000 x g RT, um die wässrige und organische Phase mit einer Mikrozentrifuge zu trennen. Nach der Zentrifugation sollte die Interphase kompakt sein. Wenn nicht, wiederholen Sie die Zentrifugation.
   HINWEIS: Wenn die Interphase nicht so kompakt wie gewünscht sein kann, möglicherweise aufgrund eines ungleichmäßigen Verhältnisses des Anfangsvolumens zum Volumen des zugesetzten Säurephenols: Chloroform nach mehreren Zentrifugationswiederholungen, fahren Sie fort, die wässrige Phase mit größerer Sorgfalt wiederherzustellen, um eine Kontamination zu vermeiden.
4. Gewinnen Sie die wässrige Phase zurück und übertragen Sie sie in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Scharnierkappe (nicht im miRNA-Isolierungskit enthalten).
   1. Entfernen Sie die wässrige (oder obere) Phase vorsichtig, ohne die untere Phase zu stören, und geben Sie sie in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Scharnierkappe. Beachten Sie das übertragene Volumen (z. B. ~500 μL).
      HINWEIS: Wenn die Interphase kompakt ist und die obere Phase klar getrennt ist, schwimmen möglicherweise einige winzige Restpartikel auf der Oberseite der wässrigen Phase. Pipettieren Sie vorsichtig, um diese Rückstände zu vermeiden und nur sichtbar und deutlich getrennte wässrige Phase zu gewinnen, um eine qualitativ hochwertige RNA-Ausbeute zu gewährleisten, auch wenn Sie nur ein kleines Volumen der wässrigen Phase erhalten könnten.

6. Endgültige RNA-Isolierung

1. Fügen Sie 1,25 Volumen RT ACS-Ethanol der Klasse 100% in die wässrige Phase im 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu (z. B. fügen Sie 625 μL 100% Ethanol hinzu, wenn 500 μL wässrige Phase aus Schritt 5.4 gewonnen werden). Wirbel 3 s.
2. Laden Sie das wässrige Phasen-Ethanol-Gemisch durch die Filterkartusche, die im miRNA-Isolierkit enthalten ist.
   1. Legen Sie die Filterpatrone für jede Probe in eines der vom Kit gelieferten Sammelröhrchen.
      1. 600 μL des wässrigen Phasen/Ethanol-Gemisches werden pipettiert und in die Filterpatrone geladen.
         HINWEIS: Wirbeln Sie die Mischung kurz durch, um das Ethanol vor dem Pipettieren gründlich mit wässriger Phase zu mischen. Es können nicht mehr als 700 μL des wässrigen Phasen-Ethanol-Gemisches gleichzeitig geladen werden.
   2. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 90 s, um durch die Mischung zu filtern. Das Drehen mit einer höheren Geschwindigkeit kann den Filter beschädigen.
   3. Das Filtrat wird verworfen und die Schritte 6.2.1 bis 6.2.2 wiederholt, bis das gesamte Gemisch in aufeinanderfolgenden Anwendungen durch dieselbe Filtermembran filtriert ist. Bewahren Sie das gleiche Sammelrohr für die unten aufgeführten Waschschritte auf und verwenden Sie es wieder.
   4. Waschen Sie den Filter mit 700 μL miRNA Wash Solution 1.
      ACHTUNG: miRNA Wash Solution 1 enthält Guanidinthiocyanat, das Hautreizungen und schwere Augenschäden verursachen kann. Tragen Sie notwendige PSA, zum Beispiel: Handschuhe, Gesichtsschutz, Laborschutzkittel. Wechseln Sie die Handschuhe häufig nach Bedarf.
      1. 700 μL miRNA Wash Solution 1, die mit ACS-Ethanol hergestellte Arbeitslösung, in die Filterpatrone geben.
      2. Zentrifugieren Sie für 60 s, um die miRNA Wash Solution 1 durch die Filterpatrone zu filtrieren.
      3. Entsorgen Sie das Filtrat aus dem Sammelröhrchen und legen Sie dieselbe Filterpatrone in dasselbe Sammelröhrchen.
   5. Waschen Sie den Filter mit Waschlösung 2/3 einmal mit Volumina von jeweils 700 μL, 500 μL und 250 μL hintereinander.
      1. Tragen Sie 700 μL Waschlösung 2/3, die mit der ACS-Qualität 100% Ethanol hergestellte Arbeitslösung, in die Filterpatrone auf.
         1. Zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.
         2. Entsorgen Sie das Filtrat aus dem Sammelröhrchen und legen Sie dieselbe Filterpatrone in dasselbe Sammelröhrchen.
      2. Geben Sie 500 μL Waschlösung 2/3 in die Filterpatrone.
         1. Zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.
         2. Entsorgen Sie das Filtrat aus dem Sammelröhrchen und legen Sie dieselbe Filterpatrone in dasselbe Sammelröhrchen.
      3. Geben Sie 250 μL Waschlösung 2/3 in die Filterpatrone.
         1. Zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.
         2. Verwerfen Sie das Filtrat aus dem Sammelrohr.
      4. Füllen Sie die Filterpatrone in ein neues Auffangrohr und drehen Sie die Baugruppe 5 Minuten lang, um die Restflüssigkeit aus dem Filter zu entfernen.

7. Elue RNA mit 50 μL nukleasefreiem Wasser

1. Füllen Sie die Filterpatrone in ein neues Auffangrohr. Pipettieren Sie 50 μL nukleasefreies Wasser in die Mitte des Filters und verschließen Sie das Sammelrohr.
   1. Inkubieren bei RT für 10 min.
   2. Spin für 5 min bei 8.000 x g , um RNA in das neue Sammelröhrchen zurückzugewinnen.
   3. Bestimmen Sie die Konzentration und Reinheit der gewonnenen fäkalen RNA mit einem Fluorometer. Die gewonnene fäkale RNA kann bei -80 °C gelagert werden.

Repräsentative RNAs wurden aus 50 mg Mauskotproben (2 Mauskotpellets) bzw. 100 mg menschlichen Stuhlproben isoliert und in 50 μL nukleasefreiem Wasser eluiert. Die Spektralphotometeranalyse der Konzentration legt nahe, dass insgesamt 49 μg bzw. 16 μg RNA isoliert wurden (Tabelle 1). Die RNA-Reinheit war hoch, was durch ein A260/A280-Verhältnis von ~2,0 und ein A260/A230-Verhältnis von ~1,8 angezeigt wird (Tabelle 1). Wie berichtet3, ist die Mehrheit der RNAs im Kot microRNA und diese microRNAs können im Exosom existieren. In Übereinstimmung damit legt ein Chip-basierter Elektrophorese-Assay von RNA nahe, dass repräsentative RNA-Isolate aus Maus- und menschlichen Fäkalien in 18S- und 28S-rRNA-Zusammensetzungen niedrig sind oder fehlen und die Größe der RNA-Isolate in die kleine RNA-Region fällt (Abbildung 1A). Eine weitere kleine RNA-Elektrophorese mit der chipbasierten Elektrophorese zeigt, dass ein großer Teil der RNAs von microRNA-Größe ist (Abbildung 1B). Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, dass die mit einem kleinen RNA-Bioanalysator durchgeführte Quantifizierung mit der mit früheren Assays6 vergleichbar ist.

Tabelle 1: Repräsentative Nanotropfenanalyse von RNA, die mit diesem Protokoll isoliert wurde. Repräsentative RNAs wurden aus 2 Mauskotpellets oder 100 mg menschlichen Stuhlproben isoliert, die in 50 μL nukleasefreiem Wasser eluiert wurden. Die RNA-Konzentration, das Verhältnis von A260/A280 und das Verhältnis von A260/A230 wurden mit Nanotropfen gemessen.

Abbildung 1: Repräsentative chipbasierte Elektrophorese-Analysen der Größenverteilung fäkaler RNA-Isolate. (A) Repräsentative RNAs, die aus 2 Mauskotpellets (linkes Bild) und 100 mg menschlichen Stuhlproben (rechtes Bild) unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls isoliert wurden, wurden mit dem Chip-basierten Elektrophorese-Assay charakterisiert. Dieser Assay legt nahe, dass die Mehrheit der RNA-Isolate kleine RNA waren. (B) Die Isolate wurden dann für die kleine RNA-Elektrophorese mit dem chipbasierten Elektrophoresesystem unterzogen, um die Größenverteilung der Isolate zu analysieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren erklären keine relevanten oder wesentlichen finanziellen Interessen, die im Zusammenhang mit der in diesem Protokollpapier beschriebenen Forschungsmethode stehen.