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Methodenartikel

Profilierung des menschlichen Rezeptor-Liganden-Repertoires an natürlichen Killerzellen

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DOI:

10.3791/61912

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19. November 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Program in Immunology, Stanford University School of Medicine, 3Chan-Zuckerberg BioHub

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier entwerfen wir zwei komplementäre Massenzytometrie-Panels (CyTOF) und optimieren ein CyTOF-Färbeprotokoll mit dem Ziel, das Repertoire an natürlichen Killerzellrezeptoren und Liganden im Rahmen von Virusinfektionen zu profilieren.

Zusammenfassung

Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) gehören zu den ersten Helfern bei Virusinfektionen. Die Fähigkeit von NK-Zellen, viral infizierte Zellen schnell zu erkennen und abzutöten, wird durch ihre Expression von keimbahnkodierten inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren reguliert. Die Bindung dieser Rezeptoren durch ihre verwandten Liganden an die Zielzellen bestimmt, ob die interzelluläre Interaktion zur Abtötung von NK-Zellen führt. Dieses Protokoll beschreibt das Design und die Optimierung von zwei komplementären Massenzytometrie-Panels (CyTOF). Ein Panel wurde entwickelt, um NK-Zellen basierend auf der Rezeptorexpression zu phänotypisieren. Das andere Panel war darauf ausgelegt, die Expression bekannter Liganden für NK-Zellrezeptoren auf mehreren Immunzell-Untergruppen zu untersuchen. Zusammen ermöglichen diese beiden Panels die Profilierung des humanen NK-Zellrezeptor-Liganden-Repertoires. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll auch den Prozess, mit dem wir Proben für CyTOF färben. Dieser Prozess wurde für eine verbesserte Reproduzierbarkeit und Standardisierung optimiert. Ein Vorteil von CyTOF ist seine Fähigkeit, über 40 Marker in jedem Panel mit minimaler Signalüberlappung zu messen, was es den Forschern ermöglicht, die Breite des Rezeptor-Liganden-Repertoires der NK-Zellen zu erfassen. Das Palladium-Barcoding reduziert auch die Variation zwischen den Proben sowie den Verbrauch von Reagenzien, wodurch es einfacher wird, Proben mit jedem Panel parallel zu färben. Zu den Einschränkungen dieses Protokolls gehören der relativ geringe Durchsatz von CyTOF und die Unfähigkeit, Zellen nach der Analyse zu gewinnen. Diese Panels wurden für die Analyse klinischer Proben von Patienten entwickelt, die an akuten und chronischen Virusinfektionen leiden, einschließlich Dengue-Virus, humanem Immundefizienzvirus (HIV) und Influenza. Sie können jedoch in jeder Umgebung eingesetzt werden, um das Rezeptor-Liganden-Repertoire der menschlichen NK-Zellen zu untersuchen. Wichtig ist, dass diese Methoden auf breiter Basis auf das Design und die Ausführung zukünftiger CyTOF-Panels angewendet werden können.

Einleitung

Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind angeborene Immunzellen, deren Hauptaufgabe darin besteht, bösartige, infizierte oder anderweitig gestresste Zellen anzugreifen und abzutöten. Durch ihre Sekretion von Zytokinen wie IFNγ und TNFα sowie ihre zytotoxische Aktivität können NK-Zellen auch die adaptive Immunantwort auf Krankheitserreger und Malignome beeinflussen. Die NK-Antwort wird zum Teil durch die kombinatorische Signalübertragung von keimbahnkodierten inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren vermittelt, die eine Vielzahl von Liganden binden, die auf potenziellen Zielzellen exprimiert werden. Mehrere NK-Zellrezeptoren haben mehr als einen Liganden, wobei regelmäßig neue Rezeptor-Liganden-Paare identifiziert werden.

Ein besonderes Interesse besteht an der Untersuchung von NK-Zellen im Zusammenhang mit Virusinfektionen, bei denen ihre Fähigkeit, schnell auf gestresste Zellen zu reagieren, die Virusausbreitung begrenzen oder die Entwicklung von NK-Zell-Evasionsstrategien fördern kann. Dieses Interesse an der NK-Zellbiologie erstreckt sich auch auf den Bereich der Krebsimmuntherapie, wo Forscher die Rolle von NK-Zellen bei der Immunüberwachung von Tumoren und in der Tumormikroumgebung untersuchen1. Die Fähigkeit, Interaktionen zwischen NK-Zellen und Zielzellen zu profilieren, wird jedoch durch die Tatsache erschwert, dass menschliche NK-Zellen über 30 Rezeptoren exprimieren können, die wiederum mit über 30 bekannten Liganden interagieren können2. Der gleichzeitige Nachweis mehrerer NK-Zellrezeptoren und ihrer verwandten Liganden ist daher notwendig, um die Komplexität der Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zu erfassen, die die NK-Funktion steuern. Daher haben wir uns der Massenzytometrie (CyTOF) zugewandt, die den gleichzeitigen Nachweis von über 40 Markern auf Einzelzellebene ermöglicht. Unser Ziel war es, zwei CyTOF-Panels zu erstellen, um das Rezeptor-Liganden-Repertoire der NK-Zellen zu profilieren. Wir wollten auch ein Protokoll für die effektive Verarbeitung und Färbung klinischer Proben entwickeln. Klinische Proben am Menschen liefern eine Fülle von Informationen darüber, wie der Körper auf eine Virusinfektion reagiert. Aus diesem Grund haben wir dieses Protokoll entwickelt, um die Expression von NK-Zellrezeptoren und ihren verwandten Liganden parallel zu untersuchen, um eine bessere Standardisierung, eine verbesserte Rückgewinnung, einen geringeren Reagenzienverbrauch und begrenzte Batch-Effekte zu erzielen.

Mehrere Durchflusszytometrie-Panels, die zur Charakterisierung des Phänotyps menschlicher NK-Zellen entwickelt wurden, wurden zuvor veröffentlicht 3,4,5,6,7,8. Die meisten dieser Panels sind in ihrer Fähigkeit, die Breite des Rezeptor-Liganden-Repertoires zu erfassen, begrenzt und ermöglichen nur die Detektion einer begrenzten Auswahl an Markern. Darüber hinaus sind diese Panels durch die Signalüberlappung zwischen Fluorochromen begrenzt. CyTOF verwendet Antikörper, die an Metallisotope konjugiert sind, die durch Flugzeit-Massenspektrometrie ausgelesen werden, wodurch das Spillover zwischen den Kanälen drastisch reduziert wird.

Wie wir haben sich auch andere Forscher an CyTOF gewandt, um die NK-Zellen 9,10,11,12,13,14 zu untersuchen, wenn auch im Allgemeinen mit weniger NK-Zellmarkern, was die Tiefe der Phänotypisierung verringert. Obwohl die allgemeinen Färbeprotokolle, die von diesen Gruppen verwendet werden, unseren ähneln, gibt es einige wesentliche Unterschiede. Andere Protokolle beinhalten keine Isolierung von NK-Zellen vor der Färbung, obwohl die Forscher nur an dieser Untergruppe interessiert sind13,14. Angesichts der Tatsache, dass NK-Zellen nur 5-20% der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) ausmachen, bedeutet die Färbung ganzer PBMCs anstelle von isolierten NK-Zellen, dass die meisten der gesammelten Ereignisse keine NK-Zellen sind. Dies reduziert die Menge der Daten, die für die interessierende Teilmenge generiert werden, und führt zu einer ineffizienten Nutzung der Maschinenzeit. Während viele dieser Panels die Expression von NK-Zellrezeptoren wie Killer-Ig-ähnlichen Rezeptoren (KIRs), NKG2A/C/D und die natürlichen Zytotoxizitätsrezeptoren (NKp30, NKp44 und NKp46) abfragen, wird die Expression dieser Marker aufgrund des Fehlens von Daten zur Expression ihrer jeweiligen Liganden nicht in einen breiteren Kontext gestellt. Folglich sind diese bisher veröffentlichten Methoden zur Untersuchung von NK-Zellen mittels CyTOF zwar für eine breite NK-Zell-Phänotypisierung ausreichend, können aber isoliert betrachtet kein umfassendes Bild der NK-Zellaktivität liefern. Dies bringt uns zum Hauptvorteil der hier beschriebenen Methoden, nämlich dass es bis zu diesem Zeitpunkt keine veröffentlichten Durchflusszytometrie- oder CyTOF-Panels gibt, die sich auf die Erforschung der Expression von Liganden für NK-Zellrezeptoren konzentrieren. Wichtig ist, dass unser Ligandenpanel über mehrere offene Kanäle verfügt, die die Zugabe von Markern ermöglichen, die den individuellen Anforderungen jedes Experiments entsprechen.

In Anbetracht der Tatsache, dass eine der Haupteinschränkungen von CyTOF die Unfähigkeit ist, die Probe nach der Analyse zurückzugewinnen, ist diese Methode möglicherweise nicht für Forscher geeignet, die über begrenzte Proben verfügen, mit denen sie an der Durchführung zusätzlicher Experimente interessiert sind. Darüber hinaus bedeutet der geringe Durchsatz von CyTOF, dass die generierten Daten von schlechter Qualität sind, wenn die Ausgangsanzahl der Zellen gering ist. Abgesehen von diesen beiden Einschränkungen wird diese Methode in jeder Umgebung gut funktionieren, um Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zwischen NK-Zellen und Zielzellen zu untersuchen.

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Protokoll

Anonymisierte PBMCs für gesunde Erwachsene wurden aus Kammern des Leukoreduktionssystems gewonnen, die vom Stanford Blood Center erworben wurden. PBMCs von anonymisierten gesunden pädiatrischen Spendern und pädiatrischen akuten Dengue-Patienten wurden vom Gorgas Memorial Institute of Health Studies in Panama City, Panama, und Krankenhäusern des Gesundheitsministeriums, dem Sozialversicherungssystem in Panama City und Vororten bezogen. Das Dengue-Studienprotokoll wurde vom IRB des Hospital del Niño (CBIHN-M-0634) genehmigt und dann von den Ausschüssen von ICGES, CSS, Santo Tomas Hospital und Stanford University genehmigt. PBMCs von HIV-infizierten Patienten, die eine antiretrovirale Behandlung erhielten, wurden aus der ACTG-Studie A5321 gewonnen.

1. Antikörpermarkierung, Panelvorbereitung und Lagerung

  1. Antikörpermarkierung mit Metallisotopen
    HINWEIS: Um die interexperimentelle Standardisierung der Färbung zu erhöhen, wird empfohlen, mehrere Konjugationen für jeden Antikörper durchzuführen und die Produkte dann zu einem einzigen Mastermix für die Langzeitlagerung zu kombinieren, wie unten beschrieben.
    1. Bestimmen Sie die Konzentration jedes Antikörpers, indem Sie die Extinktion bei 280 nm vor der Konjugation messen. Die für dieses Protokoll verwendeten Antikörper sind im Handel erhältlich und wurden von den in der Materialtabelle aufgeführten Anbietern gekauft.
    2. Markieren Sie Antikörper mit Metallisotopen mit kommerziell erhältlichen Antikörpermarkierungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für jede Reaktion werden 100 μg Antikörper verwendet.
    3. Bestimmen Sie die Endkonzentration des wiedergewonnenen Antikörpers, indem Sie die Extinktion bei 280 nm messen. Antikörper kurzfristig bei 4 °C lagern.
  2. Antikörper-Titrationen
    HINWEIS: Die CyTOF-Technologie reagiert sehr empfindlich auf potenziell kontaminierende Signale von Umweltmetallen. Daher sollten alle verwendeten Puffer/Reagenzien mit Reinstwasser zubereitet und in Kunststoff- oder Glasbehältern gelagert werden, die noch nie mit Seife gewaschen wurden.
    1. Bereiten Sie Zentrifugenröhrchen für jeden Spender vor, die 9 ml warmes, vollständiges RPMI (RPMI 1640, 10 % FBS, 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin) und 20 μl Benzonase pro Durchstechflasche PBMCs enthalten, die aufgetaut werden sollen. Tauen Sie die PBMCs in einem Wasserbad auf und geben Sie sie in die Röhrchen.
      HINWEIS: Benzonase verringert die Viskosität und den Hintergrund von freier DNA aus lysierten Zellen.
    2. Bei 300 x g bei Raumtemperatur 5 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie die PBMCs in 5 mL des vollständigen RPMI-Mediums und der Zählung.
    3. Für jede Panel-Titration werden 2-4 Millionen PBMCs/Well in 6 Wells einer 96-Well-Platte mit rundem Boden abgefüllt (eine Wells für jeden Titer und eine für ungefärbte). Die Platte bei 600 x g bei Raumtemperatur 3 min zentrifugieren. Schnippen Sie mit der Platte, um den Überstand zu entfernen. Suspendieren Sie jede Vertiefung in 200 μl CyPBS.
    4. Führen Sie die Cisplatin-Viabilitätsfärbung wie unten beschrieben durch.
      HINWEIS: Cisplatin wird verwendet, um lebende von toten Zellen in der Massenzytometrie zu unterscheiden.
      1. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl 25 μM Cisplatin-Stamm. 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      2. Quende die Cisplatin-Reaktion, indem du 100 μl FBS in jede Vertiefung gibst und mischst. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
        HINWEIS: Alle nachfolgenden Zentrifugenschritte bei 4 °C durchführen.
      3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 μL CyFACS (1x PBS ohne Schwermetallverunreinigungen in Reinstwasser mit 0,1 % BSA, 0,05 % Natriumazid). Zentrifugieren und schnippen Sie die Platte jedes Mal.
    5. Titrieren Sie das Oberflächen-Antikörperpanel wie unten beschrieben.
      HINWEIS: Für das NK-Oberflächenpanel und das Ligandenpanel sollten separate Mastermixe erstellt werden.
      1. Stellen Sie mit CyFACS einen Mastermix aller Oberflächenantikörper in einer Konzentration von 10 μg/ml her. Streben Sie ein Endvolumen von 150 μl an. Führen Sie serielle 1:2-Verdünnungen mit CyFACS durch, um die folgenden Konzentrationen zu erhalten: 10, 5, 2,5, 1,25 und 0,625 μg/ml.
      2. Filtern Sie Antikörpercocktails vor der Färbung 3 Minuten lang durch eine Zentrifugalfiltereinheit (0,1 μm Porengröße) bei 10.600 x g .
      3. Resuspendieren Sie die plattierten Zellen in 50 μL des Oberflächen-Antikörper-Cocktails am jeweiligen Titer. Resuspendieren Sie die ungefärbte Vertiefung in CyFACS. 30 min bei 4 °C inkubieren.
      4. Waschzellen mit 150 μL CyFACS. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
      5. Waschzellen mit 200 μl CyFACS. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
    6. Führen Sie die Fixierung der Zellen durch, indem Sie jede Vertiefung in 100 μl 2 % Paraformaldehyd (PFA) in CyPBS resuspendieren. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur im Dunkeln für 20 min. Waschzellen mit 100 μl CyFACS. Bei 700 x g 5 min zentrifugieren.
      ACHTUNG: PFA steht im Verdacht, genetische Defekte sowie Krebs zu verursachen. Darüber hinaus ist es schädlich, wenn es mit den Augen oder der Haut in Berührung kommt oder eingeatmet wird. Achten Sie bei sachgemäßer Handhabung auf eine gute Belüftung, öffnen Sie den Behälter vorsichtig und verhindern Sie die Bildung von Aerosolen.
      HINWEIS: Alle nachfolgenden Zentrifugendrehungen werden bei 700 x g für 5 min bei 4 °C durchgeführt.
    7. Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie in 200 μl 1x Permeabilisierungspuffer (Perm-Puffer), verdünnt in Reinstwasser, resuspendieren. Zentrifugieren und die Platte schnippen. Waschen Sie die Zellen mit 200 μl Perm-Puffer. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
      HINWEIS: Eine Inkubation im Perm-Puffer ist nicht erforderlich.
    8. Intrazelluläre Antikörper-Panel-Titration
      1. Stellen Sie einen Mastermix aller intrazellulären Antikörper in einer Konzentration von 10 μg/ml mit Perm-Puffer her. Streben Sie ein Endvolumen von 150 μl an. Führen Sie serielle 1:2-Verdünnungen mit Perm-Puffer durch, um die folgenden Konzentrationen zu erhalten: 10, 5, 2,5, 1,25 und 0,625 μg/ml.
      2. Filtern Sie Antikörpercocktails vor der Färbung 3 Minuten lang durch eine Zentrifugalfiltereinheit (0,1 μm Porengröße) bei 10.600 x g .
      3. Resuspendieren Sie die plattierten Zellen in 50 μL des intrazellulären Antikörpercocktails am jeweiligen Titer. Suspendieren Sie die ungefärbte Vertiefung in Perm Buffer. Bei 4 °C 45 min inkubieren.
        HINWEIS: Wenn ein intrazelluläres Panel nicht titriert werden soll, resuspendieren Sie die Vertiefungen in 50 μl des Perm-Puffers.
      4. Waschen Sie die Zellen mit 150 μl Perm-Puffer. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
      5. Waschen Sie die Zellen mit 200 μl Perm-Puffer. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
      6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 μl CyFACS. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
    9. Färbung von DNA-Interkalatoren
      HINWEIS: Der Interkalator bindet an zelluläre Nukleinsäuren und wird zur Identifizierung kernhaltiger Zellen in der Massenzytometrie verwendet.
      1. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Interkalator, verdünnt 1:10.000 in CyPBS und 2 % PFA. Die Platte über Nacht bei 4 °C inkubieren.
      2. Lagern Sie die Platten bei Bedarf bis zu einer Woche bei 4 °C und mit Paraffinfolie bedeckt.
        HINWEIS: Alle nachfolgenden Zentrifugenschritte bei 700 x g für 5 min bei 4 °C durchführen.
      3. Bevor Sie die Proben auf CyTOF laufen lassen, entfernen Sie den Paraffinfilm von der Platte und zentrifugieren Sie bei 700 x g für 5 min bei 4 °C. Schnippen Sie den Teller. Waschen Sie die Zellen einmal mit 200 μl CyFACS. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
      4. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 200 μl Reinstwasser. Zentrifugieren und die Platte schnippen. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Reinstwasser. Unmittelbar vor der Entnahme der Probe wird die Konzentration auf ca. 6 x 105 Zellen/ml in Normalisierungskügelchen eingestellt, die auf eine 1-fache Konzentration in Reinstwasser verdünnt werden.
    10. Führen Sie die Beispiele auf CyTOF aus.
    11. Analysieren Sie die Daten und wählen Sie geeignete Titer für jeden Antikörper, indem Sie den niedrigsten Antikörpertiter auswählen, der auf der Grundlage der visuellen Beurteilung zu der höchsten Signalintensität und der besten Trennung zwischen positiven und negativen Populationen führt.
      HINWEIS: Die Titrationen für die NK- und Liganden-Panels sind in Abbildung 1 bzw. Abbildung 2 dargestellt. Wenn keine klare Unterscheidung zwischen positiven und negativen Populationen identifiziert wird, können Titer an mehreren Zelltypen oder an Zelllinien bestimmt werden, um sowohl positive als auch negative Zellpopulationen identifizieren zu können.
    12. Lagerung des Antikörper-Panels
      1. Titrierte Antikörper zu einem Mastermix kombinieren und durch eine sterile 0,1-μm-Spritzenfiltereinheit filtrieren. Separate Mastermixe sollten für das NK-Oberflächenpanel, das intrazelluläre NK-Panel und das Ligandenpanel hergestellt werden.
      2. Für die langfristige Lagerung der Paneele ist eine der beiden akzeptablen Optionen zu beachten:
      3. Senden Sie den Mastermix zur Lyophilisierung an ein Drittunternehmen. Diese Methode wird für das NK-Panel verwendet. Antikörper, die nicht im eigenen Haus konjugiert sind, können nicht lyophilisiert werden, da Antikörperstabilisator vorhanden ist, der den Lyophilisationsprozess stört. Diese Antikörper werden dem Panel am Tag der Färbung zugesetzt.
      4. Verwenden Sie eine Repeater-Pipette, um 50 μl Aliquots von jedem Mastermix herzustellen und lagern Sie sie bei -80 °C.

2. Färbeprotokoll

  1. Tauen Sie mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) auf, wie in den Schritten 1.2.1 und 1.2.2 beschrieben. Legen Sie mindestens 1 Million PBMC für die Färbung der Ligandenplatten in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen beiseite. Halten Sie diese PBMCs während der NK-Zellisolierung auf Eis.
  2. Isolierung von NK-Zellen
    HINWEIS: Bei den folgenden Schritten zur Isolierung von NK-Zellen handelt es sich um eine modifizierte Version des Protokolls eines bestimmten Anbieters. Jedes Kit oder Protokoll, das eine magnetbasierte Negativselektion von NK-Zellen durchführt, wäre jedoch eine geeignete Alternative. Darüber hinaus ist dieser Schritt optional, da dieses Protokoll auch für die Phänotypisierung von NK-Zellen aus ganzen PBMCs geeignet ist.
    1. Die restlichen PBMCs bei 450 x g 5 min drehen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 40 μl MACS-Puffer (PBS, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA) pro 107 Zellen insgesamt.
    2. Fügen Sie 10 μl NK-Zell-Biotin-Antikörper-Cocktail pro 107 Zellen insgesamt hinzu. Gut mischen und 5 min auf Eis inkubieren.
    3. Fügen Sie 30 μl MACS-Puffer pro 107 Zellen insgesamt und 20 μl NK cell MicroBead Cocktail pro 107 Zellen hinzu. Gut mischen und 10 min auf Eis inkubieren.
    4. Bereiten Sie die Elutionssäulen vor, indem Sie mit 500 μl MACS-Puffer spülen. Geben Sie 2 ml kaltes vollständiges RPMI in 15 ml-Sammelröhrchen.
    5. Geben Sie MACS-Puffer in Röhrchen mit Zellen, um das Volumen auf 500 μl zu erhöhen. Pipettieren Sie das gesamte Volumen von 500 μl auf die vorbereitete Elutionssäule. Spülen Sie das Röhrchen mit weiteren 500 μl MACS-Puffer aus und geben Sie es in die Säule.
    6. Nachdem der Fluss gestoppt wurde, spülen Sie die Elutionssäule zweimal mit 500 μl MACS-Puffer. Nachdem der Fluss gestoppt wurde, zählen Sie NK-Zellen.
  3. Platten- und Waschzellen.
    1. Zentrifugieren Sie isolierte NK-Zellen und PBMCs bei 300 x g bei Raumtemperatur für 10 min. Resuspendieren Sie Zellen in einer Konzentration von 5 Millionen Zellen/ml in CyPBS (1x PBS ohne Schwermetallverunreinigungen in Reinstwasser). Plattenzellen in einer 96-Well-Platte mit U-Boden.
      HINWEIS: Jedes Aliquot des NK-Zellenpanels kann bis zu 3 Millionen Zellen färben. Wenn sechs einzelne NK-Zellproben vor der Färbung mit einem Barcode versehen und gepoolt werden, sollte die Gesamtzahl der NK-Zellen 3 Millionen nicht überschreiten. Das Ligandenpanel kann bis zu 6 Millionen PBMC pro Probe färben. Wenn sechs einzelne Proben vor der Färbung mit einem Barcode versehen und gepoolt werden, sollte die Gesamtzahl der PBMC insgesamt 6 Millionen nicht überschreiten.
    2. Zentrifugierte Platte bei 600 x g bei Raumtemperatur für 3 min. Schnippen Sie mit der Platte, um den Überstand zu entfernen.
      HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Zentrifugendrehungen bei 600 x g für 3 min bis Schritt 2.7 durch.
    3. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl CyPBS. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
  4. Die Färbung der Cisplatin-Lebensfähigkeit ist wie in Schritt 1.2.4 beschrieben durchzuführen.
  5. Barcoding-Färbung
    HINWEIS: Diese Panels werden in Verbindung mit einem modifizierten Zwei-von-Vier-Barcode-Verfahren auf Palladiumbasis für lebende, nicht fixierte Zellen verwendet, um Batch-Effekte zu minimieren und die Zellrückgewinnungzu maximieren 15. Dieser Schritt ist jedoch optional, da kein Barcode erforderlich ist, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten.
    1. Jede Vertiefung in 50 μl des jeweiligen vorgemischten Barcodes resuspendieren und 30 Minuten lang bei 4 °C inkubieren. Waschzellen mit 150 μL CyFACS. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
    2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 μl CyFACS. Zentrifugieren und die Platte schnippen. Resuspendieren Sie alle Wells in 30 μl CyFACS. Kombinieren Sie bis zu sechs Vertiefungen mit Zellen, die mit eindeutigen Barcodes gefärbt sind, in einer Vertiefung und führen Sie eine Zentrifugation und ein Flicken der Platte durch.
  6. Oberflächenflecken
    1. Die Oberflächen-NK-Panel-Lyosphäre wird in 50 μl CyFACS mit zusätzlichen Oberflächenantikörpern (anti-CD16, anti-HLA-DR, anti-LILRB1) gelöst. Tauen Sie das Ligandenpanel bei -80 °C auf und schleudern Sie das Röhrchen mit einer Mini-Zentrifuge nach unten. Spike in zusätzlichen Liganden-Panel-Oberflächenmarkern (Anti-CD16, Anti-CD19).
      HINWEIS: Jeder Antikörpercocktail, der nicht zuvor filtriert wurde (d. h. vor der Lyophilisierung oder dem Einfrieren), sollte vor der Färbung 3 Minuten lang durch eine Zentrifugalfiltereinheit (0,1 μm Porengröße) bei 10.600 x g filtriert werden.
    2. Suspendieren Sie jede Vertiefung in 50 μl des jeweiligen Panels. 30 min bei 4 °C inkubieren. Waschzellen mit 150 μL CyFACS. Zentrifugieren und die Platte schnippen. Waschen Sie die Zellen erneut mit 200 μL CyFACS. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
  7. Korrigieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.2.6 beschrieben.
    HINWEIS: Alle nachfolgenden Zentrifugendrehungen bei 700 x g für 5 min bei 4 °C durchführen.
  8. Permeabilisieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.2.7 beschrieben.
  9. Intrazelluläre Färbung
    1. Die intrazelluläre NK-Panel-Lyosphäre wird in 50 μl Perm-Puffer gelöst. Bereiten Sie auf Wunsch einen intrazellulären Antikörpercocktail für PBMC-Proben vor.
      HINWEIS: Jeder Antikörpercocktail, der nicht zuvor filtriert wurde (d. h. vor der Lyophilisierung oder dem Einfrieren), sollte vor der Färbung 3 Minuten lang durch eine Zentrifugalfiltereinheit (0,1 μm Porengröße) bei 10.600 x g filtriert werden.
    2. Resuspendieren Sie die Wells in 50 μl der jeweiligen intrazellulären Panels. Wenn kein intrazelluläres Panel in Verbindung mit dem Ligandenoberflächenpanel verwendet wird, resuspendieren Sie die PBMC-Wells in 50 μl des Perm-Puffers. Bei 4 °C 45 min inkubieren.
    3. Waschen Sie die Zellen mit 150 μl Perm-Puffer. Zentrifugieren und Platte flicken. Waschen Sie die Zellen mit 200 μl Perm-Puffer. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
    4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 μl CyFACS. Zentrifugieren und die Platte schnippen.
  10. Färbung von DNA-Interkalatoren. Die DNA-Interkalator-Färbung ist wie in Schritt 1.2.9.1 beschrieben durchzuführen. Die Platte über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: Der Interkalator bindet an zelluläre Nukleinsäuren und wird zur Identifizierung kernhaltiger Zellen in der Massenzytometrie verwendet. Die Platten können mit Paraffinfolie bedeckt bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.
  11. Bevor Sie die Proben auf CyTOF ausführen, waschen Sie die Zellen wie in den Schritten 1.2.9.3 und 1.2.9.4 beschrieben.
  12. Führen Sie Beispiele auf CyTOF aus.

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Ergebnisse

Die Antikörper wurden mit kommerziell erhältlichen Markierungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers an Metallisotope konjugiert. Antikörperklone wurden vor der Verwendung in diesem Panel durch Durchflusszytometrie und Massenzytometrie validiert. Eine erste Liste von Klonen wurde auf der Grundlage einer Überprüfung der Literatur und der Verfügbarkeit von Antikörpern ausgewählt. Die Expressionsniveaus einiger Liganden für NK-Zellrezeptoren sind auf gesunden PBMCs gering oder nicht nach...

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Diskussion

Hier beschreiben wir das Design und die Anwendung von zwei komplementären CyTOF-Panels, die darauf abzielen, das Rezeptor-Liganden-Repertoire der NK-Zellen zu profilieren. Dieses Protokoll umfasst mehrere Schritte, die für die Erlangung qualitativ hochwertiger Daten entscheidend sind. CyTOF verwendet anstelle von Fluorochromen Schwermetallionen als Markierungssonden für Antikörper19. Diese Technologie unterliegt daher potentiell kontaminierenden Signalen von Umwel...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken allen aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Blish Laboratory, die zu diesem Panel beigetragen haben. Vielen Dank an die AIDS Clinical Trials Group und das ACTG A5321 Team sowie an Dr. Sandra López-Vergès und Davis Beltrán vom Gorgas Memorial Institute for Health Studies für die Kuration der Proben. Abschließend möchte ich mich bei Michael Leipold, Holden Maecker und dem Stanford Human Immune Monitoring Center für die Nutzung ihrer Helios-Geräte bedanken. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH U19AI057229, NIH R21 AI135287, NIH R21 AI130532, NIH DP1 DA046089 und Burroughs Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Infectious Diseases #1016687 to CB, NIH Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award T32 AI007502, TL1 TR001084 und NIH/NIAID K08 AI138640 to EV, National Science Foundation Graduate Research Fellowship DGE-1656518 to JM und NIH Training Grant T32-AI-007290 (PI Olivia Martinez). Die ACTG-Studie wurde von AI-68634 (Statistical and Data Management Center), UM1-A1-26617, AI-131798 und AI-68636 (ACTG) unterstützt. CB ist Tashia and John Morgridge Faculty Scholar in Pediatric Translational Medicine vom Stanford Maternal Child Health Research Institute und Forscher des Chan Zuckerberg Biohub.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
89YSigma-Aldrich204919
102-PalladiumnitratTrace Sciences InternationalSonderauftrag
104-PalladiumnitratTrace Sciences InternationalSonderauftrag
106-PalladiumnitratTrace Sciences InternationalSonderauftrag
108-PalladiumnitratTrace Sciences InternationalSpecial Order
115InTrace Sciences InternationalSpecial Order
141PrFluidigm201141A
142NdFluidigm201142A
143NdFluidigm201143A
144NdFluidigm201144A
145NdFluidigm201145A
146NdFluidigm201146A
147SmFluidigm201147A
148NdFluidigm201148A
149SmFluidigm201149A
150NdFluidigm201150A
151EuFluidigm201151A
152SmFluidigm201152A
153EuFluidigm201153A
154SmFluidigm201154A
155GdFluidigm201155A
156GdFluidigm201156A
157GdTrace Sciences InternationalN/A
158GdFluidigm201158A
159TbFluidigm201159A
160GdFluidigm201160A
161DyFluidigm201161A
162DyFluidigm201162A
163DyFluidigm201163A
164DyFluidigm201164A
165HoFluidigm201165A
166ErFluidigm201166A
167ErFluidigm201167A
168ErFluidigm201168A
169TmFluidigm201169A
170erFluidigm201170A
171YbFluidigm201171A
172YbFluidigm201172A
173YbFluidigm201173A
174YbFluidigm201174A
175LuFluidigm201175A
176YbFluidigm201176A
209Bi anti-CD16Fluidigm3209002BKlon 3G8. Wird in einer Verdünnung von 1:50 verwendet.
697 ZellenCreative BioarrayCSC-C0217
Amicon Ultra Zentrifugalfiltereinheiten 0,5 mit Ultracel-30 Membran, 30 kDaMilliporeUFC503096
wasserfreies AcetonitrilFisher ScientificBP1165-50
Anti-2B4Biolegend329502Klon C1.7.
Anti-B7-H6R& D SystemsMAB7144Klonen 875001.
Anti-CCR2Biolegend357202Klon K036C2.
Anti-CD2Biolegend300202Klon RPA-2.10.
Anti-CD3Biolegend300402Klon UCHT1.
Anti-CD4Biolegend317402Klon OKT4.
Anti-CD4Biolegend344602Klon SK3.
Anti-CD7Biolegend343102Klon CD7-6B7.
Anti-CD8Biolegend344702Klon SK1.
Anti-CD11bBiolegend301302Klon ICRF44.
Anti-CD14Biolegend301802Klon M5E2.
Anti-CD19Biolegend302202Klon HIB19.
Anti-CD33Biolegend303402Klon WM53.
Anti-CD38Biolegend303502Klon HIT2.
Anti-CD48Biolegend336702Klon BJ40.
anti-CD56BD Pharmingen559043Klon NCAM16.2.
Anti-CD57Biolegend322302Klon HCD57.
Anti-CD62LBiolegend304802Klon DREG-56.
Anti-CD69Biolegend310902Klon FN50.
Anti-CD94Biolegend305502Klon DX22.
Anti-CD95Biolegend305602Klon DX2.
Anti-CD155Biolegend337602Klon SKII.4.
Anti-CXCR6Biolegend356002Klon K041E5.
anti-DNAM-1BD Biosciences559787Klon DX11.
Anti-DR4Biolegend307202Klon DJR1.
Anti-DR5Biolegend307302Klon DJR2-2.
anti-FAS-LBiolegend306402Klon NOK-1.
anti-FcRgMillipore06-727Polyklonaler Antikörper.
Anti-HLA-C,EMilliporeMABF233Klon DT9.
anti-HLA-Bw4Miltenyi BiotecSonderauftragKlon REA274.
anti-HLA-Bw6Miltenyi Biotec130-124-530Klon REA143.
Anti-HLA-DRBiolegend307602Klon L243.
Anti-HLA-EBiolegend342602Klon 3D12.
Anti-ICAM-1Biolegend353102Klon HA58.
Anti-Ki-67Biolegend350502Klon Ki-67.
Anti-KIR2DL1/KIR2DS5R& D SystemsMAB1844Klonen 143211.
Anti-KIR2DL3F& D SystemsMAB2014Klonen 180701.
Anti-KIR2DL5Miltenyi Biotec130-096-200Klon UP-R1.
Anti-KIR2DS4R& D SystemsMAB1847Klonen 179315.
Anti-KIR3DL1BD Biosciences555964Klon DX-9.
Anti-LFA-3Biolegend330902Klon TS2/9.
Anti-LILRB1R& D Systems292319Klonen MAB20172.
Anti-LLT-1F& Technik D SystemsAF3480Klon 402659.
Anti-MICA-R& D SystemsMAB1300-100Klon 159227.
Anti-MICB-Forschungund -Bekämpfung D SystemsMAB1599-100Klon 236511.
Anti-Nectin-1Biolegend340402Klon R1.302.
Anti-Nectin-2Biolegend337402Klon TX31.
Anti-NKG2A-Forschungund -Abwehr D SystemsMAB1059Klonen 131411.
Anti-NKG2CR& D SystemsMAB1381Klonen 134522.
Anti-NKG2DBiolegend320802Klon 1D11.
Anti-NKp30Biolegend325202Klon P30-15.
Anti-NKp44Biolegend325102Klon P44-8.
Anti-NKp46Biolegend331902Klon 9E2.
Anti-NTB-ABiolegend317202Klon NT-7.
Anti-Pan HLA Klasse IBiolegend311402Klon W6/32.
Anti-PD1Biolegend329902Klon EH12.2H7.
Anti-PerforinAbcamab47225Klon B-D48.
Anti-Siglec-7Biolegend347702Klon S7.7.
Anti-SykBiolegend644302Klon 4D10.2.
Anti-TAKTILBiolegend338402Klon NK92.39.
Anti-TIGITR& D SystemsMAB7898Klonen 741182.
Anti-ULBP-1R& D SystemsMAB1380-100Klon 170818.
Anti-ULBP-2, 5, 6R& D SystemsMAB1298-100Klon 165903.
Antikörper-StabilisatorCandor Bioscience131 050
Benzonase-NukleaseMillipore70664
Bond-Breaker TCEP-LösungThermo Fisher Scientific77720
Rinderserum-Albumin-LösungSigma-AldrichA9576
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2+2H2O)Sigma-Aldrich223506-25G
Cis-Platin(II)diamindichlorid (cisplatin)Enzo Life SciencesALX-400-040-M250Eine 100 mM Stammlösung wurde in DMSO hergestellt und in 25 & Mikro; L aliquots. Wird in einem 25 & Mikro; M Verdünnung für lebende/tote Flecken. Das Signal wird in den Kanälen 194Pt und 195Pt angezeigt.
DMSOSigma-AldrichD2650
eBioscience PermeabilisierungspufferThermo Fisher Scientific00-8333-56
EDTA (0,5 M)HoeferGR123-100Ein doppelt konzentrierter HEPES-Puffer mit EDTA wurde nach folgender Rezeptur hergestellt: 1,3 g NaCl (Thermo Fisher Scientific), 27 mg CaCl2+2H2O (Sigma-Aldrich), 23 mg MgCl22PO4 (Thermo Fisher Scientific), 4 ml 1 M HEPES (Thermo Fisher Scientific), 2 ml 0,5 M EDTA (Hoefer, Holliston, MA, USA) und 100 ml H2O. Der pH-Wert dieses doppelt konzentrierten HEPES-Puffers wurde unter Verwendung von 1 M HCl und 1 M NaOH auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt.
EQ Vier-Elemente-KalibrierkügelchenFluidigm201078
Fötales RinderserumThermo Fisher ScientificN/A
Helios MassenzytometerFluidigmN/A
HEPES (1M)Thermo Fisher Scientific15630080
HyClone Antibiotika/Antimykotische Lösung (Pen/Strep/Fungiezon)Lösung Fisher Scientific
Iridium - 191Ir/193Ir InterkalatorDVS Sciences (Fluidigm)201192BWird in einer Verdünnung von 1:10000 verwendet.
Isothiocyanobenzyl-EDTA (ITCB-EDTA)Dojindo Molecular Technologies, Inc.M030-10Verdünnt auf 1,25 mg/ml in wasserfreiem Acetonitril.
K562 ZellenAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC CCL-243
L-Glutamin (200 mM)Thermo Fisher ScientificSH30034
Magnesiumchlorid (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
Maxpar X8 Antikörper-MarkierungskitsFluidigmN/AKeine Katalognummer, da die Kits Metalle enthalten. 
Millex-VV Spritzenvorsatz-Filtereinheit, 0,1 & Mikro mMilliporeSLVV033RS
Milli-Q Advantage A10 WasseraufbereitungssystemMilliporeZ00Q0V0WW
MS SäulenMiltenyi Biotec
NALM6 ZellenAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC CRL-3273
Nanosep Zentrifugalgeräte mit Omega-Membran 3KPall CorporationOD003C35
NK Cell Isolation Kit, humanMiltenyi Biotec130-092-657
Paraformaldehyd (16%)Elektronenmikroskopie Sciences15710
PBSThermo Fisher Scientific10010023
Kaliumphosphat Monobasisch (KH2PO4)Fisher ScientificMP021954531
Qdot 655 anti-CD19Thermo FisherScientific Q10179Klon SJ25-C1. Wird in einer Verdünnung von 1:50 verwendet. Das Signal erscheint in den Kanälen 112Cd-114Cd. 
Qdot 655 anti-HLA-DRThermo Fisher ScientificQ22158Klon Tü36. Wird in einer Verdünnung von 1:200 verwendet.
Rockland PBSRockland Immunochemicals, Inc.MB-008 Wird zur Herstellung von CyPBS (10x Rockland PBS, verdünnt auf 1x in Milli-Q Wasser) und CyFACS Puffern (10x Rockland PBS, verdünnt auf 1x in Milli-Q Wasser mit 0,1 % BSA und 0,05 % Natriumazid) verwendet. Die Puffer wurden durch einen 0,22 & Mikro sterilfiltriert; M-Filter und Sotred bei 4°; C in Stericup Flaschen. 
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific21870092
Natriumazid (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Natriumchlorid (NaCl)FisherScientific S271-500
Stericup Quick Release-GP Steriles VakuumfiltrationssystemMillipore SigmaS2GPU10RE
Tuning-LösungFluidigm201072
Waschlösung Fluidigm201070
SV3007901

Referenzen

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