Verschiedene Kleinhirnregionen spielen eine Rolle bei unterschiedlichen Verhaltensergebnissen, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bleiben unbekannt. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, um die Kleinhirnrinde der Hemisphären, der vorderen und hinteren Regionen der Vermis und der tiefen Kleinhirnkerne reproduzierbar und schnell zu sezieren, um durch Isolierung von RNA und Tests auf Unterschiede in der Genexpression auf molekulare Unterschiede zu untersuchen.
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Methodenartikel
Zerebelläre regionale Dissektion für die molekulare Analyse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Kleinhirn spielt eine wichtige Rolle in mehreren Schlüsselfunktionen, einschließlich der Kontrolle von Bewegung, Gleichgewicht, Kognition, Belohnung und Affekt. Bildgebende Untersuchungen deuten darauf hin, dass unterschiedliche Kleinhirnregionen zu diesen verschiedenen Funktionen beitragen. Molekulare Studien, die regionale Kleinhirnunterschiede untersuchen, hinken hinterher, da sie meist an ganzen Kleinhirnextrakten durchgeführt werden, wodurch alle Unterscheidungen zwischen bestimmten Kleinhirnregionen maskiert werden. Hier beschreiben wir eine Technik, um vier verschiedene Kleinhirnregionen reproduzierbar und schnell zu sezieren: die tiefen Kleinhirnkerne (DCN), die vordere und hintere vermale Kleinhirnrinde und die Kleinhirnrinde der Hemisphären. Die Sezierung dieser unterschiedlichen Regionen ermöglicht die Erforschung molekularer Mechanismen, die ihren einzigartigen Beiträgen zu Gleichgewicht, Bewegung, Affekt und Kognition zugrunde liegen können. Diese Technik kann auch verwendet werden, um Unterschiede in der pathologischen Anfälligkeit dieser spezifischen Regionen in verschiedenen Mauskrankheitsmodellen zu untersuchen.
Einleitung
Das Kleinhirn enthält mehr als die Hälfte der Neuronen im Gehirn und wurde historisch als motorisches Kontroll- und Gleichgewichtszentrum im Gehirn bezeichnet1. In jüngerer Zeit haben Studien gezeigt, dass das Kleinhirn eine Schlüsselrolle bei verschiedenen anderen Funktionen spielt, einschließlich Kognition, Belohnungsverarbeitung undAffekt 2,3,4,5.
Das Kleinhirn hat eine gut beschriebene Anatomie: Die Kortexregion besteht aus Granula, Purkinje und molekularen Schichten. Körnerzellen bilde....
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Protokoll
1. Einrichtung
- Sammeln Sie die notwendige Ausrüstung, einschließlich Enthauptungsschere, stumpfe Pinzette, Sezierschere, Gefäßschere, Mikrospatula, sagittale Maushirnmatrix, Rasierklingen, 200 μL Pipettenspitzen, Glassteinschale, Glasobjektträger und Eiskübel. Legen Sie die gesamte Ausrüstung auf einem saugfähigen Pad aus.
- Petrischale, Glasplatte und Gehirnmatrix auf Eis legen.
- Schneiden Sie mit einer Rasierklinge in einem senkrechten Winkel etwa 5 mm von der Spitze einer 200 μL-Pipettspitze ab. Dadurch ist die Größe der Öffnung am Ende der Spitze etwa 1 mm breit. Dies sollte ausreichen, um das DCN auszustanzen. Diese kan....
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Ergebnisse
Für diese Experimente wurden vier elf Wochen alte weibliche Wildtyp-C57/Black6-Mäuse verwendet. Eine Maus wurde verwendet, um eine vollständige Kleinhirndissektion durchzuführen, die als "Bulk-Kleinhirn" bezeichnet wird und den Vergleich der RNA-Spiegel in sezierten Regionen mit einer vollständigen Dissektion ermöglichte. Die anderen drei Mäuse wurden verwendet, um die in diesem Protokoll beschriebene Kleinhirndissektion durchzuführen. Durch den Einsatz von drei Mäusen kann sichergestellt.......
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Diskussion
Die hier beschriebene Methode ermöglicht es, die zugrunde liegende Genexpression und molekularen Mechanismen innerhalb von vier verschiedenen Kleinhirnregionen zu beurteilen – den tiefen Kleinhirnkernen (DCN), der vorderen Kleinhirnrinde der Vermis (CCaV), der hinteren Kleinhirnrinde der Vermis (CCpV) und der Kleinhirnrinde der Hemisphären (CCH). Die Fähigkeit, diese Regionen separat zu bewerten, wird unser Wissen über die Heterogenität bestimmter Kleinhirnregionen erweitern und möglicherweise ihren Beitrag zu verschiede.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Wir danken Austin Ferro und Juao-Guilherme Rosa im Cvetanovic-Labor für ihre Hilfe bei der Fehlerbehebung bei Dissektionen und bei der RNA-Extraktion und RTqPCR. Diese Forschung wird gefördert von M. Cvetanovic, R01 NS197387; HHS | Nationale Institute für Gesundheit (NIH).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1.5 Mikrozentrifugenröhrchen | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropylalkohol | VWR Life Sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipettenspitzen | GeneMate | P-1237-200 | |
| Erwachsene Maus Gehirn Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Stumpfe Pinzette | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Enthauptungsschere | |||
| Präparierschere | |||
| Ethylalkohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glasobjektträger (für die Elektrophorese) | BIORAD | ||
| Homogenisator | Kimble | 6HAZ6 | |
| Eiskübel | |||
| Insulinspritze (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA-Kit für RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Mikrospatel | |||
| Nadelnase Pinzette | |||
| Petrischale | Pyrex | ||
| Primetime Primer für Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer für Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer für Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.121096666 | |
| Einschneidige Rzor Klingen | Personna GEM | ||
| Sterile, vielseitig einsetzbare | Stößel FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagenz | Ambion von Life technologies | 15596018 | |
| Gefäßschere |
Referenzen
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the....
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Nachdrucke und Genehmigungen
