Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um Oligonukleotide wie small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs) oder anti-micro-RNA (anti-miR) in reife Adipozyten zu liefern, um die Protein- und micro-RNA-Expression zu modulieren.
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Methodenartikel
Ein Adipozyten-Zellkulturmodell zur Untersuchung des Einflusses der Protein- und Mikro-RNA-Modulation auf die Adipozytenfunktion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Veränderung der Adipozytenfunktion trägt zur Pathogenese von Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes und Insulinresistenz bei. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, den molekularen Mechanismus der Adipozytendysfunktion besser zu verstehen, um neue Therapien gegen Adipositas-bedingte Krankheiten zu entwickeln. Die Modulation der Expression von Proteinen und Mikro-RNAs in Adipozyten bleibt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Differenzierung muriner Fibroblasten in reife Adipozyten und zur Modulation der Expression von Proteinen und Mikro-RNAs in reifen Adipozyten durch Reverse-Transfektion unter Verwendung von small-interfering RNA (siRNA) und micro-RNA mimicking (miR mimic) Oligonukleotiden. Dieses Reverse-Transfektionsprotokoll beinhaltet die Inkubation des Transfektionsreagenz und der Oligonukleotide, um einen Komplex in der Zellkulturplatte zu bilden, zu dem die reifen Adipozyten hinzugefügt werden. Die Adipozyten dürfen sich dann in Gegenwart des Oligonukleotid-/Transfektionsreagenzienkomplexes wieder an der adhärenten Plattenoberfläche befestigen. Funktionelle Analysen wie die Untersuchung der Insulinsignalisierung, Glukoseaufnahme, Lipogenese und Lipolyse können an den transfizierten 3T3-L1 reifen Adipozyten durchgeführt werden, um den Einfluss von Protein- oder Mikro-RNA-Manipulation auf die Adipozytenfunktion zu untersuchen.
Einleitung
Fettleibigkeit gilt als Hauptrisikofaktor für zahlreiche Stoffwechselerkrankungen, darunter Insulinresistenz (IR), Typ-2-Diabetes (T2D) und Herz-Kreislauf-Erkrankungen1. Aktuelle Therapien haben es nicht geschafft, die ständig steigende Prävalenz dieser Krankheiten zu stoppen, und das Management der IR von adipösen und diabetischen Patienten bleibt ein wichtiges klinisches Problem. Fettgewebe spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Energieöostase, und seine pathologische Ausdehnung während der Fettleibigkeit trägt zur Entwicklung von IR und T2D2,3bei. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, den molekularen Mechanismus der Adipozytendysfunktion besser zu verstehen, um neue Therapien gegen Adipositas-bedingte Krankheiten zu entwickeln. Viele Forschungsstudien haben die Rolle proteinkodierender RNAs in der Adipozytenphysiologie und ihre Assoziation mit Fettleibigkeit untersucht.
In jüngerer Zeit hat die Entdeckung von nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs), insbesondere Mikro-RNAs (miRs), neue Konzepte im Zusammenhang mit dem Mechanismus der Regulation von Genexpressionsprogrammen entwickelt. Studien haben gezeigt, dass ncRNAs wichtige Regulatoren der Adipozytenfunktion sind und dass ihre Dysregulation eine wichtige Rolle bei Stoffwechselerkrankungen spielt4. Daher ist die Manipulation von Proteinen und ncRNAs in Adipozyten entscheidend, um ihre Rolle in der Adipozytenfunktion und ihre Auswirkungen auf Pathologien wie T2D zu entschlüsseln. Die Manipulation der Expression von Proteinen und ncRNAs in vivo sowie in primären Adipozyten bleibt jedoch eine große Herausforderung, was die Verwendung von In-vitro-Adipozytenmodellen begünstigt.
Murine 3T3-L1 Fibroblasten unterscheiden sich leicht in reife, funktionelle und insulin-responsive Adipozyten, die eine gut charakterisierte Zelllinie sind, die zur Untersuchung der Adipozytenfunktion verwendet wird (z. B. Insulinsignalisierung, Glukoseaufnahme, Lipolyse und Adipokinsekretion)5,6,7,8,9,10. Diese Eigenschaften machen 3T3-L1-Adipozyten zu einem attraktiven Modell, um die Expression von proteinkodierenden und nc-RNAs zu modulieren, um ihre Rolle in der Adipozytenfunktion und ihre potenzielle Rolle bei Adipositas-bedingten Krankheiten zu entschlüsseln. Während 3T3-L1-Fibroblasten mit handelsüblichen Reagenzien leicht zu transfizieren sind, sind differenzierte 3T3-L1-Adipozyten leider eine der am schwierigsten zu transfizierenden Zelllinien. Aus diesem Grund haben sich zahlreiche Studien zur Manipulation der Genexpression in 3T3-L1-Zellen auf die Adipozytendifferenzierung und nicht auf die Adipozytenfunktion konzentriert.
Lange Zeit war die einzige effiziente Technik, um Adipozyten zu transfizieren, die Elektroporation5, die mühsam und teuer ist und Zellschäden verursachen kann. Dieser Artikel berichtet über eine Reverse-Transfektionstechnik mit einem gängigen Transfektionsreagenz, das die praktische Zeit für die Transfektion verkürzt, keinen Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit hat und viel kostengünstiger ist als die Elektroporation. Dieses Protokoll eignet sich perfekt für die Transfektion von siRNA und anderen Oligonukleotiden wie Micro-RNA-Mimics (miR-Mimics) und Anti-MiRs. Das Prinzip des Reverse-Transfektionsprotokolls besteht darin, das Transfektionsreagenz und die Oligonukleotide zu einem Komplex in der Zellkulturplatte zu inkubieren und dann die reifen Adipozyten in die Vertiefungen zu säen. Dann befestigen sich die Adipozyten wieder an der adhärenten Plattenoberfläche in Gegenwart des Oligonukleotid/Transfektionsreagenzkomplexes. Diese einfache, effiziente und kostengünstige Methodik ermöglicht die Untersuchung der Rolle proteinkodierender RNAs und miRs bei der Adipozytenfunktion und ihrer potenziellen Rolle bei Adipositas-bedingten Erkrankungen.
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Protokoll
HINWEIS: Verwenden Sie sterile Techniken, um alle Schritte des Protokolls in einer laminaren Flusszellenkulturhaube auszuführen. Siehe Materialtabelle für Details zu allen Reagenzien und Geräten.
1. Differenzierung von murinen 3T3-L1 Fibroblasten in Adipozyten
- Züchten Sie die 3T3-L1-Fibroblasten in 100-mm-Schalen in Kulturmedium DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% neugeborenes Kälberserum und 1% Penicillin und Streptomycin (Abbildung 1A). Stellen Sie das Geschirr in einen Gewebekultur-Inkubator(7% CO 2 und 37 °C).
- Wechseln Sie zwei Tage nach dem Zusammenfluss das Kulturmedium und ersetzen Sie es durch DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% fetales Kälberserum (FCS) und 1% Penicillin und Streptomycin, ergänzt mit 0,25 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), 0,25 μM Dexamethason, 5 μg/ml Insulin und 10 μM Rosiglitazon.
HINWEIS: Es dauert 5 Tage, um die Konfluenz zu erreichen, wenn die Zellen mit 300.000 Zellen pro 100-mm-Schale ausgesät werden. - Zwei Tage später ersetzen Sie das Kulturmedium durch DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% FCS und 1% Penicillin und Streptomycin, ergänzt mit 5 μg/ml Insulin und 10 μM Rosiglitazon und inkubieren Sie 2 Tage lang. Dann füttern Sie die Zellen alle 2 Tage mit DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% FCS und 1% Penicillin und Streptomycin (Abbildung 1B).
- Transfizieren Sie die 3T3-L1-Adipozyten 7-8 Tage nach Beginn des Differenzierungsprotokolls.
HINWEIS: Es ist wichtig, vor der Transfektion ein hohes Differenzierungsniveau (>80%) zu erreichen, um die Proliferation der verbleibenden Fibroblasten nach der Transfektion zu vermeiden, was zu einer gemischten Zellpopulation führen würde, die die Ergebnisse verzerren könnte.
2. Vorbereitung von vorbeschichteten Platten
- Bereiten Sie am Tag vor oder einige Stunden vor der Transfektion eine Lösung von Kollagen Typ I bei 100 μg/ml in 30% igem Ethanol aus einer Stammlösung bei 1 mg/ml vor. Fügen Sie 250 μL Kollagen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte und 125 μL pro Well einer 24-Well-Platte hinzu und verteilen Sie die Lösung über die Oberfläche der Well.
- Lassen Sie die Platte ohne Deckel unter der Kulturhaube, bis das Kollagen trocknet. Zweimal mit dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) waschen.
HINWEIS: Vorbeschichtete Platten sind ebenfalls erhältlich.
3. Herstellung der Transfektionsmischung
HINWEIS: Die Endkonzentration von siRNA liegt zwischen 1 und 100 nM (1 bis 100 pmol siRNA pro Vertiefung einer 12-Well-Platte). Die Endkonzentration der miR-Mimik beträgt 10 nM (10 pmol/well). Bestimmen Sie die beste Konzentration jeder siRNA, miR-Mimik oder eines anderen Oligonukleotids vor Beginn des Experiments, um Off-Target-Effekte zu vermeiden. Führen Sie Transfektionsexperimente in dreifacher Ausführung durch, um die statistische Analyse der Ergebnisse zu erleichtern. Bereiten Sie alle rezienten Im Übermaße vor, um den normalen Verlust während des Pipettierens zu berücksichtigen.
- Mischen Sie durch Pipettieren (Volumen/Volumen) die siRNA (oder andere Oligonukleotide) mit einem verbesserten minimalen essentiellen Medium (Tabelle 1). 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie das Transfektionsreagenz und das verbesserte minimal essentielle Medium zur siRNA hinzu und mischen Sie es mit einer Pipett (Tabelle 1). 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (während dieser Zeit fahren Sie mit Abschnitt 4 fort). Fügen Sie die Transfektionsmischung zu jeder Vertiefung der kollagenbeschichteten Platte hinzu.
4. Herstellung der 3T3-L1-Adipozyten
- Waschen Sie die Zellen in der 100 mm Petrischale zweimal mit D-PBS. Fügen Sie 5x Trypsin zu den Zellen hinzu (1 ml pro 100-mm-Schüssel) und achten Sie darauf, die gesamte Oberfläche mit dem Trypsin zu bedecken. Warten Sie 30 s und entfernen Sie das Trypsin vorsichtig.
- Die Petrischale für 5-10 min bei 37 °C im Inkubator inkubieren. Tippen Sie auf die 100-mm-Schüssel, um die Zellen zu lösen.
- Fügen Sie 10 ml DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% FCS und 1% Penicillin und Streptomycin hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipetieren Sie das Medium vorsichtig nach oben und unten, um die Zellen zu lösen und die Zellsuspension zu homogenisieren.
- Zählen Sie die Zellen mit einer Malassez-Zählkammer oder einem automatisierten Zellzähler und stellen Sie die Konzentration der Zellen auf 6,25 x10 5 Zellen / ml Medium ein. Säen Sie 800 μL der Zellsuspension/Vertiefung einer 12-Well-Platte (5 x10 5 Zellen) oder 400 μl der Zellsuspension/Vertiefung einer 24-Well-Platte (2,5 x 105 Zellen), die die Transfektionsmischung enthält.
HINWEIS: Eine 100-mm-Petrischale aus Adipozyten ermöglicht die Herstellung einer 12-Well-Platte oder einer 24-Well-Platte. Eine 100 mm Schale enthält in der Regel 6-7 x10 6 Adipozyten, die 5 x 105 Adipozyten pro Vertiefung einer 12-Well-Platte entsprechen. - Inkubieren Sie die Platten in einem Zellkultur-Inkubator(7% CO 2 und 37 °C) und stören Sie die Zellen 24 Stunden lang nicht. Ersetzen Sie am nächsten Tag vorsichtig den Überstand durch frisches DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% FCS und 1% Penicillin und Streptomycin.
HINWEIS: Es ist auch möglich, die Zellen in kollagenvorbeschichtete 48- und 96-Well-Platten zu säen, aber beim Austausch der Medien mehr Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, um eine Ablösung der Adipozyten zu vermeiden.
5. Funktionsanalyse transfizierter 3T3-L1-Adipozyten
- Ziel der Studie ist ein Knockdown von 24-48 h bzw. 48-96 h nach siRNA- oder miR-Mimikabgabe für mRNA bzw. Protein.
- Führen Sie funktionelle Analysen von transfizierten Adipozyten durch, um Die Insulinsignalisierung, Glukoseaufnahme, Adipokinsekretion, Lipolyse und Lipogenese zu untersuchen.
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Ergebnisse
Mit dem hier beschriebenen Verfahren der Umgekehrttransfektion zur Modulation der Expression von Proteinen oder Mikro-RNAs in 3T3-L1-Adipozyten wurde gezeigt, dass die Adipozyten ihre Morphologie nach der Transfektion bewahren (Abbildung 1B, C). Tatsächlich waren die Adipozyten 2 Tage nach der Transfektion gut verteilt und an der Platte befestigt und präsentierten multilokuläre Lipidtröpfchen, die für reife 3T3-L1-Adipozyten charakteristisch ...
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Diskussion
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die Differenzierung und Transfektion reifer Adipozyten vor. Diese Reverse-Transfektionsmethode ist eine einfache, wirtschaftliche und hocheffiziente Methode, um Oligonukleotide wie siRNAs, micro-RNA-Nachahmungen und Anti-Mikro-RNAs in 3T3-L1-Adipozyten zu transfizieren, was eine der am schwierigsten zu transfizierenden Zelllinien ist. Diese Methode hat einige Einschränkungen, die berücksichtigt werden müssen. Dieses Protokoll ist nicht effizient für die Transfektion m...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom INSERM, der Université Côte d'Azur und der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) durch das Programm Investitionen für das zukünftige Exzellenzlabor (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) und die Exzellenzinitiative (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001) unterstützt. J.J. wird durch Zuschüsse der Société Francophone du Diabète (SFD), der Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), des Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) und der Fondation Benjamin-Delessert unterstützt. J.G. wird von ANR-18-CE14-0035-01 unterstützt. J-F.T. wird durch den ANR-Zuschuss ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 und einen Zuschuss der Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587) unterstützt. Wir danken auch der Imaging Core Facility von C3M, die vom Conseil Départemental des Alpes-Maritimes und der Région PACA finanziert wird und auch von der GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA) unterstützt wird.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 12-Well-Gewebekulturplatte | Dutscher | 353043 | |
| 2,5 % Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | verdünnt auf 5x mit D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthin, | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-Targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Rinderserum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Kollagen Typ I aus Kalbshaut | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethason | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modifiziertes Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4,5 g/l D-Glukose; L-Glutamin; nein Pyruvat-Ethanol |
| Sigma | 51976 | ||
| FAM-markierte Negativkontrolle si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fötales Rinderserum | Gibco | 10270-106 | |
| Freies Glycerinreagenz | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerin-Standardlösung | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 Antikörper | Santa Cruz | sc-131119 | Verdünnung : 0,5 & Mikro; g/mL |
| Verbessertes minimales essentielles Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, humanes rekombinantes | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA imitiert | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Serum für neugeborene Kälber | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Maus Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Entdeckung | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin und Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 Antikörper | Zellsignalisierung | 3470 | Verdünnung : 1/1000 |
| Petrischale 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB Antikörper | Zellsignalisierung | 9272 | Verdünnung : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 Antikörper | Zelle Signalweg | 9275 | Verdünnung : 1/1000 |
| Rosiglitazon | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfektionsreagenz (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-Tubulin Antikörper | Sigma aldrich | T6199 | Verdünnung : 0,5 µ g/mL |
| Vamp2 Antikörper | R& D Systems | MAB5136 | Verdünnung : 0,1 & Mikro; g/mL |
Referenzen
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
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- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
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