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Probenahme und Verarbeitung von Nasenbürsten mittels digitaler Hochgeschwindigkeits-Ziliar-Videomikroskopie – Anpassung an die COVID-19-Pandemie

DOI:

10.3791/61949

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November 7th, 2020

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1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center, University of Liège, 2Department of ENT, University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit, University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics, University of British Columbia and British Columbia Children's Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology, University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège

In This Article

Summary

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Um eine erfolgreiche und qualitativ hochwertige ziliäre Funktionsanalyse für die PCD-Diagnostik zu gewährleisten, ist eine präzise und sorgfältige Methode zur Probenahme und Verarbeitung des respiratorischen Epithels unerlässlich. Um während der COVID-19-Pandemie weiterhin PCD-diagnostische Dienstleistungen anbieten zu können, wurde das ziliäre Videomikroskopieprotokoll aktualisiert, um geeignete Maßnahmen zur Infektionskontrolle aufzunehmen.

Abstract

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Die primäre ziliäre Dyskinesie (PCD) ist eine genetisch bedingte Motilziliopathie, die zu einer signifikanten otosinopulmonalen Erkrankung führt. Die PCD-Diagnose wird aufgrund von Herausforderungen mit unterschiedlichen diagnostischen Modalitäten oft übersehen oder verzögert. Die Ziliar-Videomikroskopie mit digitaler Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie (DHSV), einem der diagnostischen Instrumente für PCD, gilt als die optimale Methode zur Durchführung einer ziliären Funktionsanalyse (CFA), die aus der Analyse der Ziliarschlagfrequenz (CBF) und des Schlagmusters (CBP) besteht. Dem DHSV fehlt jedoch ein standardisiertes, veröffentlichtes Arbeitsverfahren für die Verarbeitung und Analyse von Proben. Es verwendet auch lebendes respiratorisches Epithel, ein wichtiges Problem der Infektionskontrolle während der COVID-19-Pandemie. Um während dieser Gesundheitskrise weiterhin diagnostische Dienstleistungen anbieten zu können, wurde das ziliäre Videomikroskopieprotokoll angepasst, um angemessene Maßnahmen zur Infektionskontrolle zu enthalten.

Hier beschreiben wir ein überarbeitetes Protokoll für die Probenahme und Laborverarbeitung von Flimmeratmungsproben und heben die Anpassungen hervor, die zur Einhaltung der COVID-19-Infektionskontrollmaßnahmen vorgenommen wurden. Repräsentative Ergebnisse von CFA aus Nasenputzproben von 16 gesunden Probanden, die nach diesem Protokoll verarbeitet und analysiert wurden, werden beschrieben. Wir veranschaulichen auch, wie wichtig es ist, epitheliale Flimmerstreifen in optimaler Qualität zu erhalten und zu verarbeiten, da Proben, die nicht den Qualitätsauswahlkriterien entsprechen, nun eine CFA zulassen, was möglicherweise die diagnostische Zuverlässigkeit und die Effizienz dieser Technik verringert.

Introduction

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Die primäre Ziliärdyskinesie (PCD) ist eine vererbte heterogene motile Ziliopathie, bei der die respiratorischen Zilien stationär, langsam oder dyskinetisch sind, was zu einer gestörten mukoziliären Clearance und einer chronischen oto-sino-pulmonalen Erkrankung führt 1,2,3,4. Die klinischen Manifestationen der PCD sind chronischer feuchter Husten und chronische verstopfte Nase ab dem frühen Säuglingsalter, rezidivierende oder chronische Infektionen der oberen und unteren Atemwege, die zu Bronchiektasen führen, sowie r....

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Protocol

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Die Genehmigung wurde von der Ethikkommission des Krankenhauses Lüttich und der Universitätsabteilung für Hygiene und Gesundheitsschutz am Arbeitsplatz eingeholt.

1. Probenahme von respiratorischem Flimmerepithel

  1. Stellen Sie vor der Probenahme sicher, dass die Probanden mindestens 4-6 Wochen lang frei von Infektionen und frei von nasalen und inhalativen Medikamenten sind.
  2. Bereiten Sie das ergänzte M199-Präparat vor: Ergänzen Sie das Zellkulturmedium 199 (M199) (500 ml) mit antibiotischer Lösung (5 ml Streptomycin/Penicillin (50 μg/ml)) und antimykotischer Lösung (5 ml Amphotericin B (2,5 μg/ml)).
  3. Bereiten Sie 2....

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Results

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Um die Effizienz der Technik zu veranschaulichen, präsentieren wir die Ergebnisse der CFA in einer Serie von 16 gesunden erwachsenen Probanden (5 Männer, Altersspanne 22-54 Jahre).

Nasenputzproben von 14 (4 Männer, Altersspanne 24-54 Jahre) von insgesamt 16 Probanden lieferten genügend geeignete Epithelränder, die die für die Durchführung einer CFA erforderlichen Auswahlkriterien erfüllten. Von diesen 14 Nasenputzproben wurden insgesamt 242 Flimmerränder erfasst, von denen 212 die definierten .......

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Discussion

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Dieses Papier zielt darauf ab, ein Standardverfahren für CFA unter Verwendung von Nasenbürstenproben bereitzustellen, wobei Anpassungen für angemessene Überlegungen zur Infektionskontrolle während der COVID-19-Pandemie vorgenommen wurden. Die PCD-Diagnose ist eine Herausforderung und erfordert derzeit gemäß internationaler Empfehlung eine Reihe verschiedener diagnostischer Tests, darunter nasale Stickstoffmonoxidmessung, CFA mit DHSV, ziliäre Ultrastrukturanalyse mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Markierung v.......

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Disclosures

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Diese Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

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Wir bedanken uns bei Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier und allen Teammitgliedern des PCD-Diagnosezentrums von Paris-Est für ihre Verfügbarkeit und den herzlichen Empfang während des Besuchs in ihrem PCD-Diagnosezentrum und den zahlreichen Austausch. Wir danken auch Robert Hirst und allen Teammitgliedern im PCD-Zentrum von Leicester für ihren Empfang und ihre Zeit, ihren Rat und ihr Fachwissen.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL konische RöhrchenFisherScientific35209615 ml konisches Röhrchen aus hochklarem Polypropylen mit Deckel
Amphotericin BLONZA17-836EAntimykotische Lösung
Blakesley-weil NasenzangeNOVO SURGICALE7739-12Wird verwendet, um die Bürste für das Nasenbürsten zu halten
Bürste für die BronchialzytologieCONMED129Wird für die Nase verwendet
Bürsten WattestäbchenNUOVA APTACA2150/SGWird für COVID-19-Tests verwendet
Digitiale Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie-KameraIDTeu Innovation in BewegungCrashCam Mini 1510
ObjektträgerThermoScientific12372098Objektträger zur Erstellung der Visualisierungskammer Beheizte
BoxIBIDI-Zellen im Fokus10918Wird verwendet, um die Probe
InverslichtmikroskopZeissAXIO Vert.A1
Lens HeaterTOKAI HITTPiE-LHWird zur Erwärmung der Öl-Tauchlinse
Medium 199 (M199), HEPESTermoFisher Scientific12340030Cell Culture
Medium Motion Studio X64IDT MotionVersion 2.14.01Software
OilFischerScientific, Carl Zeiss
Rechteckiger DeckglasVWR631-0145Wird zur Abdeckung der Visualisierungskammer
verwendet Spacer (Ispacer) 0,25 mmSunjinlabIS203Wird für die Erstellung der hermetischen geschlossenen Visualisierungskammer
Quadratischer DeckglasVWR631-0122Wird für die Herstellung einer im Labor gebauten offenen Visualisierungskammer
verwendet Streptomycin/PenicillinFisherScientific, Gibco11548876Antibiotika-Lösung
11825153 verwendet

References

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  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H.

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Ciliary VideomicroscopyDigital High Speed VideomicroscopyNasal Brushing SamplingCiliary Functional AnalysisCiliary Beat FrequencyCiliary Beat PatternPrimary Ciliary DyskinesiaInfection Control MeasuresEpithelial Ciliated StripsVideo Analysis Software

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