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Kryo-Verletzungs-induzierte Herzregeneration im Axolotl und Echokardiographie sowie unverzerrte quantitative Histologie zur Bewertung der regenerativen Progression

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DOI:

10.3791/61966

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10. Mai 2021

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1Department of Clinical Medicine (Comparative Medicine Lab), Aarhus University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Operationsprotokoll vor, um eine Kryoverletzung des ventrikulären Myokards des Axolotls zu induzieren. Darüber hinaus stellen wir ein Protokoll zur nicht-invasiven Abschätzung der Infarktfraktion während des regenerativen Prozesses mit Echokardiographie und ein Protokoll zur präzisen Messung der Infarktfraktion im exzidierten Herzen mit unvoreingenommener quantitativer Histologie vor.

Zusammenfassung

Die Amphibien, Salamander und Molche der Urodele stellen die phylogenetische Gruppe dar, die den Säugetieren am nächsten steht und in der Lage ist, nach ventrikulärer Resektion eine vollständige Myokardregeneration durchzuführen. Das Resektionsmodell hat ein grundlegendes Wissen über die Prozesse bei der Herzreparatur generiert. Das Modell lässt sich jedoch nicht gut auf klinische Situationen beziehen, in denen Gewebeschäden, Apoptose, Nekrose, Fibrose und Hypertrophie die wichtigsten nachteiligen Folgen von Ischämie-induzierten Myokardinfarkten und nicht die Gewebeentfernung sind. Auf der anderen Seite ähnelt der Kryoverletzungs-induzierte Myokardinfarkt eher dem Ischämie-induzierten Myokardinfarkt. Im Folgenden wird eine detaillierte Beschreibung des Kryoverletzungsverfahrens beim Axolotl (Ambystoma mexicanum) gegeben, die ein Werkzeug zur Untersuchung grundlegender Mechanismen der Herzreparatur in einem Tetrapodenmodell bietet. Darüber hinaus bieten wir quantitative Methoden zur nicht-invasiven Abschätzung der Infarktgröße in vivo mit Echokardiographie und zur präzisen Messung der Infarktgröße mit unvoreingenommener quantitativer Histologie ex vivo an.

Einleitung

Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit eine der häufigsten Todesursachen 1,2. Ein Ischämie-induzierter Myokardinfarkt führt zu einem weit verbreiteten Zelltod bei Kardiomyozyten3. Obwohl ein schneller medizinischer Eingriff das Risiko eines sofortigen Todes verringern kann, führt die daraus resultierende fibrotische Reaktion, die der Mensch mit traditionellen Säugetiermodellen (Maus, Ratte, Kaninchen, Schwein usw.) teilt, zur Bildung von Narbengewebe, die letztendlich zu Herzhypertrophie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz führen können4. Im Gegensatz zu Säugetieren ist die kardiale Regeneration bei einigen nicht-amnionischen Tiermodellen wie Zebrafischen5 und Salamandern6 gut etabliert. Traditionell wurde die kardiale Regeneration bei diesen Spezies nach partieller Ventrikelresektion oder Kneifen untersucht 5,6,7,8,9,10. Im Jahr 2011 entwickelten jedoch drei Gruppen unabhängig voneinander eine Kryoverletzungs-induzierte Myokardinfarkttechnik im Zebrafisch 11,12,13. Die Kryoverletzungstechnik führt zu Nekrose und Apoptose in einem großen Teil des Herzventrikels des Zebrafisches und zu einer anfänglichen Anhäufung von fibrotischem Gewebe, das die pathologische Entwicklung des Säugetierherzens nach einem ischämischen Infarkt im Vergleich zur Ventrikelresektion besser modelliert 11,12,13. Darüber hinaus haben methodische Vergleiche des Kryoverletzungs-induzierten Myokardinfarkts mit dem Ischämie-induzierten Myokardinfarkt durch Koronararterien-Ligatur bei Maus und Schwein bewiesen, dass die Kryoverletzungstechnik in Säugetiermodellen eine nützliche Alternative darstellt14,15. Inspiriert von den Methoden, die am Kryoverletzungsmodell des Zebrafisches16,17 beteiligt waren, haben wir ein ähnliches Modell im Axolotl18 entwickelt, einer Amphibie, die für ihre regenerativen Fähigkeiten bekannt ist19, das es ermöglicht, die Mechanismen zu untersuchen, die an der Herzreparatur bei diesem Tetrapoden nach Gewebeschädigung und nicht nach Gewebeentfernung beteiligt sind.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung eines Kryoverletzungs-induzierten Myokardinfarkts beim Axolotl vor. Besonderen Wert legen wir auf schnelle und minimalinvasive entscheidende Schritte, die das Überleben, die Genesung und die experimentelle Reproduzierbarkeit erhöhen. Darüber hinaus geben wir Anleitungen für geeignete Techniken zur Beurteilung der anatomischen Regeneration in vivo mittels Echokardiographie und ex vivo mittels unvoreingenommener stereologischer quantitativer Histologie.

Der Kryoverletzungs-induzierte Myokardinfarkt beim Axolotl kann angewendet werden, um grundlegende Mechanismen zu untersuchen, die an der Myokardregeneration bei diesem Tetrapoden beteiligt sind. Der Axolotl ist tolerant gegenüber Kryoverletzungs-induziertem Myokardinfarkt, der mindestens 45% des Ventrikels betrifft, was zu einer Abnahme des Schlagvolumens und des Herzzeitvolumens führt, ohne dass sich sein Verhalten in seinem relativ trägen Lebensstil ändert, jedoch führen schwerere Verletzungen möglicherweise zu einer verminderten Tiergesundheit.

Kurz gesagt, um eine Kryoverletzung zu induzieren, wird ein ventraler Schnitt am Thorax eines anästhesierten Axolotls vorgenommen. Der Ventrikel wird durch stumpfe Dissektion zugänglich gemacht und eine vorgekühlte Kryosonde wird 10 s lang angewendet, um eine Kryoverletzung zu induzieren. Der ventrale Schnitt wird genäht und das Tier erholt sich schnell und es gibt keine Anzeichen von Verhaltensänderungen, nachdem das Bewusstsein wiedererlangt wurde. Kontroll-/Scheintiere erhalten eine ähnliche Behandlung, erhalten aber eine ungekühlte Kryosonde. Die kardiale Leistungsfähigkeit kann mittels Echokardiographie (Hochfrequenz-Ultraschallgeräte erforderlich, ≥20 MHz) überwacht werden, wie sie an gesunden Axolotl-Herzen, die zuvor20 Jahre alt waren, ausführlich beschrieben wurde, und die Infarktfraktion kann nicht-invasiv und wiederholt während des Regenerationsprozesses abgeschätzt werden. Infarzierte Herzen können jederzeit während des 3-monatigen Regenerationsprozesses entnommen, für die Histologie kryogeschnitten und mit Standardverfahren (z. B. Eosin & Hämatoxylin oder Massons Trichrom-Färbung) gefärbt werden. Insbesondere die Trichrom-Färbung nach Masson ermöglicht eine klare Unterscheidung zwischen infarktierten und gesunden Anteilen des Ventrikels. Die Infarktfraktion des Ventrikels wird mit stereologischen Techniken bestimmt, die zuvor für kardiale Studien beschrieben wurden21.

Protokoll

Dieses Protokoll entspricht allen institutionellen (Universität Aarhus) und nationalen (Protokoll # 2015-15-0201-0201-00615) Tierhaltungsvorschriften und -richtlinien.

1. Vorbereitung der Kryosonde

  1. Schneiden Sie drei Litzen Kupferdraht mit 1 mm Durchmesser in 10 cm große Stücke.
  2. Wickeln Sie Kupferlitzen zu einem Strang auf.
  3. Schmelzen Sie mit einem Gasbrenner ein Ende der Kupferschnur zu einem kugelförmigen Ende mit einem Durchmesser von 2 mm auf.
    HINWEIS: Kupfer hat eine hohe Wärmeleitfähigkeit (401 W m-1 K-1 bei 0 °C) und kann bei leicht handhabbaren Temperaturen (Schmelzpunkt 1084,6 °C) geformt werden, aber eine Kupferoberfläche neigt dazu, mit der Zeit zu korrodieren, insbesondere wenn sie mit Blut in Berührung kommt, was die Wärmeleitfähigkeit deutlich senkt. Daher muss eine kupferbasierte Kryosonde gelegentlich poliert werden. Alternative, stabilere Metalle, die auch für Kryosonden verwendet werden können, sind Silber (Wärmeleitfähigkeit 428 W m-1 K-1 bei 0 °C, Schmelzpunkt 961,8 °C) und Gold (Wärmeleitfähigkeit 318 W m-1 K-1 bei 0 °C, Schmelzpunkt 1064,2 °C).
  4. Entfernen Sie den Kolben von einer 2-ml-Spritze und ziehen Sie den weichen Gummikopf ab.
  5. Führen Sie das nicht-sphärische Ende der Kupferschnur durch die Spritze und binden Sie sie an die Pistole
  6. Setzen Sie den Kolben wieder in die Spritze ein (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Wenn die Kryosonde nicht verwendet wird, sollte der Kupferstrang geschützt werden, indem der Kolben vollständig zurückgezogen wird. Während des Gebrauchs wird der Kolben ganz nach innen geschoben, um den Kupferstrang dem Kühlbad auszusetzen.

2. Durch Kryoverletzung induzierter Myokardinfarkt

  1. Betäuben Sie Axolotl, indem Sie es in 200 mg/l Benzocain-Anästhetikum tauchen. Dreißig Minuten Eintauchen ergeben ~2,5 h vollständige Anästhesie.
    HINWEIS: Benzocain ist wasserunlöslich und sollte zuerst in 3 ml (pro 200 mg Benzocain) Aceton gelöst werden, das anschließend in das Wasserbad gegeben wird. Längeres Eintauchen in Benzocain kann die Genesung beeinträchtigen, daher sollte die Zeit in Benzocain sorgfältig überwacht werden.
  2. Lege den Axolotl mit der Bauchseite nach oben auf einen Operationsteller (Kopf nach links für einen Rechtshänder). Immobilisieren, indem Sie alle Körperteile mit Ausnahme des Thorax in Gewebetücher einhüllen, die in Anästhesielösung getränkt sind (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Das Einhüllen des Tieres in feuchte Tücher sorgt für eine feuchte Umgebung, die für eine Wasseramphibie von entscheidender Bedeutung ist, und macht Tierarztsalbe auf den Augen überflüssig. Verwenden Sie in den nachfolgenden Schritten autoklavierte Instrumente, um die Sterilität während der Operation zu gewährleisten.
  3. Verwenden Sie eine Iridektomieschere, um einen ~1 cm langen Längsschnitt in der Haut leicht rechts bis zur Mittellinie des Thorax zu machen (Abbildung 1C).
  4. Befreien Sie mit einer Pinzette die Knorpelplatten vom Brustgürtel.
    HINWEIS: Der Brustgürtel ist eine empfindliche Struktur und es sollte darauf geachtet werden, dass seine Elemente nicht beschädigt werden, da dies die spätere Wundheilung sowie die Fortbewegung und das Wohlbefinden der Tiere beeinträchtigen kann.
  5. Öffnen Sie das freiliegende Perikard vorsichtig mit einem Schnitt, ohne die darunter liegenden Herzstrukturen zu beschädigen. Bevor Perikardflüssigkeit austritt, aspirieren Sie diese in eine 1-ml-Spritze mit einer stumpfen 2-Gauge-Nadel (Abbildung 1D).
  6. Platzieren Sie eine stumpfe Pinzette mit einer festen Öffnung (~1 cm) in der Wunde, um die Wundränder und Knorpelplatten auseinander zu halten (Abbildung 1E).
  7. Legen Sie die Kryosonde mindestens 2 Minuten lang in die Flüssigkeit N2 , wobei der Kupferdraht freigelegt wurde.
    HINWEIS: Wenn die Masse des Kupferdrahtes zu klein ist (d.h. zu kurz) oder wenn er unzureichend gekühlt wird, kann es zu einer unerwünschten unvollständigen transmuralen Kryoverletzung kommen.
  8. Wischen Sie den freiliegenden Ventrikel vorsichtig mit einem Wattestäbchen oder fest gerollten Gewebetüchern ab, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit auf der Ventrikeloberfläche vorhanden ist (Abbildung 1F).
  9. Nehmen Sie die auf -196 °C gekühlte Kryosonde aus der Flüssigkeit N2 und legen Sie sie direkt auf den freiliegenden Ventrikel (Abbildung 1H). Es wird sich an der Herzkammer festsetzen. Die Kryosonde sollte auf der lateralen Seite des Ventrikels in Richtung des Apex platziert werden, um eine Schädigung anderer kardialer Strukturen zu vermeiden und nachfolgende Querschnitte für die Mikroskopie zu ermöglichen, die sowohl gesundes als auch infarktiertes Myokard enthalten. Nach 10 s tragen Sie die zuvor gesammelte Perikardflüssigkeit auf die Kryosondenspitze auf (Abbildung 1I). Dadurch wird die Sonde aufgetaut und es kann sich vom Ventrikel lösen.
    HINWEIS: Das Auftragen der Kryosonde auf einen Ventrikel mit übermäßigem Wasser führt entweder zu einem unvollständigen Kryoinfarkt, wenn die Sonde zu schnell erhitzt wird, oder zu einer zu ausgedehnten Myokardschädigung, wenn eine dünne Wasserschicht, die die gesamte Oberfläche des Ventrikels bedeckt, sofort eingefroren wird. Keine der beiden Situationen ist wünschenswert. Im Falle einer erfolgreichen Induktion der Kryoverletzung erscheint eine kleine rote kreisförmige Schwellung am Ventrikel (Abbildung 1J). Beim Umgang mit Scheintieren wird eine ungekühlte Kryosonde auf ähnliche Weise 10 s lang platziert (Abbildung 1G).
  10. Legen Sie das Perikard auf den Ventrikel, entfernen Sie die Pinzette, die die Wunde offen hielt, und ordnen Sie die Knorpelplatten des Brustgürtels neu an.
    HINWEIS: Bei der anschließenden Echokardiographie zur Beurteilung der Herzfunktion ist es entscheidend, dass alle Lufteinschlüsse, selbst winzige Blasen, die unter den Knorpelplatten auftreten können, entfernt werden, da diese bildgebende Artefakte induzieren. Diese Blasen können durch leichtes Drücken des Gewebes oder durch Zugabe von autoklavierter amphibischer Ringer-Lösung (6,6 g/L NaCl, 0,15 g/L KCl, 0,15 g/L CaCl2, 0,2 g/L NaHCO3 in destilliertem Wasser) auf die Wundoberfläche entfernt werden, um die Luftblasen aufzulösen.
  11. Nähen Sie die Haut (3-5 Stiche) mit einem auflösbaren Faden (6-0) (Abbildung 1K).
  12. Decken Sie den Operationsbereich mit feuchten Tüchern ab, die über die Wunde gehoben werden, und tränken Sie sie dann mit Anästhesielösung.
  13. Stellen Sie die Operationsschale mit dem Tier für 2 Stunden auf Eis, um die erste Bildung einer Wundepidermis zu ermöglichen, und versiegeln Sie die Wundränder, bevor das Tier seiner unsterilen Wasserumgebung ausgesetzt wird.
  14. Setzen Sie das Tier in ein sauberes Gefäß mit Aquarienwasser um. Das Tier sollte zu diesem Zeitpunkt wieder zu Bewusstsein kommen. Beobachte das Tier, bis es wieder bei vollem Bewusstsein ist und koordinierte Bewegungen hat. Beenden Sie die Fütterung und den Wasserwechsel für zwei Tage nach der Operation und halten Sie den Axolotl allein in seinem eigenen Aquarium, damit die Wunde verschlossen werden kann, bevor es wieder zu Störungen kommt.
    HINWEIS: Nachdem sie das Bewusstsein wiedererlangt haben, haben die meisten Axolotl das Verlangen, Luft zu schlucken. Um diesen Prozess zu erleichtern und den Bewegungsaufwand zu begrenzen, kann es von Vorteil sein, den Wasserstand im Aquarium kurz nach der Operation für 1-2 Tage nach der Operation zu senken. Eine niedrige Konzentration von Benzocain (20 mg/L) kann 24 Stunden nach der Operation als Analgetikum verwendet werden.

3. Nicht-invasive Messung der Infarktfraktion mit Echokardiographie

  1. Betäuben Sie Axolotl wie in Schritt 2.1 beschrieben.
  2. Legen Sie das Tier in Rückenlage in einen kleinen Behälter mit 3-5 mm Anästhesielösung, der die Bauchfläche bedeckt.
  3. Platzieren Sie den Ultraschallschallkopf entlang der Längsachse des Tieres etwas rechts von der Mittellinie des Brustbereichs.
  4. Für eine zweidimensionale Abschätzung des Infarktanteils [IF(Ultraschall, 2D)] wird der Schallkopf so lange verschoben, bis die Infarktzone und der Ventrikel im B-Modus maximal erscheinen (Abbildung 2A-D, Zusatzmaterial 1-2).
  5. Erfassen Sie ≥3 Herzzyklen mit > 50 Bildern/s.
  6. Messen Sie die Querschnittsfläche des Ventrikels (CSAv) und der Infarktzone (CSAi) an der Enddiastole und schätzen Sie den zweidimensionalen Infarktanteil, indem Sie eine kugelförmige Ventrikelform und eine hemisphärische Infarktzonenform unter Verwendung der Gleichung annehmen:
    figure-protocol-1 (1)
    HINWEIS: Um die geometrischen Annahmen über die Form des Ventrikels und der Verletzungszone zu bewerten, kann der Schallkopf um 90° gedreht werden, um die Kurzachsenansicht des Herzens anzuzeigen (Abbildung 2E-F, Zusatzmaterial 3).
  7. Für eine dreidimensionale Abschätzung der Infarktfraktion positionieren Sie den Schallkopf entweder links oder rechts, bis am Ende der ventrikulären Diastole nur noch ein kleiner Teil des Ventrikels zu sehen ist.
  8. Bewegen Sie den Schallkopf in Schritten (z) von 0,5 mm (für Kleintiere, Körpermasse ≤ 20 g) oder 1 mm (Großtiere, Körpermasse > 20 g) über den Ventrikel und erfassen Sie mindestens 3 Herzzyklen pro Schritt/Schnitt.
    HINWEIS: Für eine angemessene Genauigkeit sollten 8 – 12 Scheiben (n) erfasst werden.
  9. Messen Sie CSAv und CSAi an der Enddiastole für jede Schicht (j) und schätzen Sie den dreidimensionalen Infarktanteil [IF (Ultraschall, 3D)] ohne geometrische Annahmen über die Form des Ventrikels und des Bruchs unter Verwendung der Gleichung:
    figure-protocol-2 (2)
    HINWEIS: Sowohl die zweidimensionale als auch die dreidimensionale Erfassung können verwendet werden, um die Herzfunktion (Schlagvolumen und Herzzeitvolumen) geometrisch zu messen, wie in den Abschnitten 3 und 6 von Dittrich et al. (2018)20 beschrieben. Ebenso können gepulste Wellengeschwindigkeits-Zeit-Integrale (Abbildung 2G) auch zur Messung der Herzfunktion verwendet werden, wie in Abschnitt 3 in Dittrich et al. (2018)20 beschrieben.
  10. Extrahieren Sie die interessierenden Bereiche von CSAv und CSAi in Schritt 3.9 als binäre Masken mit z-Abstand zwischen den Schichten, um den Ventrikel und die Infarktzone an der Enddiastole und der Endsystole dreidimensional zu modellieren (Abbildung 2H, Zusatzmaterial 4).

4. Unverzerrte quantitative Histologie zur Messung des Infarktanteils

  1. Erkunde das Herz eines anästhesierten Axolotls, der in Schritt 2.2 – 2.6 beschrieben wurde.
  2. Injizieren Sie mit einer 1-ml-Spritze, die mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet ist, langsam 5 μl/g Körpermasse von 1000 IE/ml heparinisierter amphibischer Ringer-Lösung in den Sinus venosus und warten Sie 2 Minuten, bis sich das Antikoagulans im Kreislauf verteilen kann.
  3. Euthanasieren Sie durch Enthauptung und Hirnmarkierung und entfernen Sie das gesamte Herz, indem Sie zuerst die Zuflussgefäße und dann den Ausflusstrakt durchtrennen.
  4. Übertragen Sie das Herz, indem Sie es vorsichtig durch den Ausflusstrakt anheben, in eine 60 × 15 mm2 Petrischale, die amphibische Ringer-Lösung enthält.
  5. Waschen Sie unter Vergrößerung das restliche Blut im Herzen aus, indem Sie den Sinus venosus vorsichtig mit 100 IE/ml heparinisierter Ringer-Lösung füllen.
    HINWEIS: Während die Präfixation des Herzens durch Perfusion des Herzens mit gepuffertem Formalin oder Paraformaldehyd durchgeführt werden kann, ist dies nicht erforderlich, da die Schnitte bei einer Gefriertemperatur durchgeführt werden. Anschließend kann die Fixierung der Schnitte auf Objektträgern durchgeführt werden. Ein vollständig gewaschenes Herz erscheint blass und weißlich und enthält keine Spuren von roten Blutkörperchen. Es ist wahrscheinlich, dass sich kleine Blutgerinnsel auf der Oberfläche des Ventrikels und der Vorhöfe bilden. Sie haben keinen Einfluss auf die Präzision im anschließenden quantitativen Histologieverfahren.
  6. Übertragen Sie das Herz auf fusselfreies Seidenpapier und tupfen Sie es 1 Minute lang ab.
  7. Bereiten Sie ein Kryowerkzeug in ausreichender Größe vor, indem Sie einen einzigen Tropfen der Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur auftragen und das Herz auf den Tropfen übertragen. Drücken Sie das Herz vorsichtig nach unten.
  8. Tragen Sie eine optimalere Schnitttemperaturmasse auf, um die Kryoform zu füllen, und stellen Sie sicher, dass der Ventrikel unten bleibt. Lassen Sie die Form 5 Minuten lang stehen, damit sich die Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur in der Probe verteilen kann.
  9. Friere die Form ein, indem du sie auf einen Deckel aus einer Pipettenspitze legst, die auf flüssigem Stickstoff schwimmt.
    HINWEIS: Für ein kontrollierteres Einfrieren können die Herzen über Nacht 1 Stunde lang in 10-30%iger Saccharoselösung gelagert werden, und das Schockfrosten kann mit flüssigem, stickstoffgekühltem Isopentan (2-Methylbutan) durchgeführt werden. Unserer Erfahrung nach ist das Endergebnis nicht wesentlich anders.
  10. Temperieren Sie die Kryoform in einem Kryostaten bei -18 bis -22 °C für mindestens 1 h, bevor Sie schneiden.
  11. Schneiden Sie die Probe bei einer Schichtdicke von 10 μm und entnehmen Sie sie jede 10. Schicht, um eine Plattendicke (t) von 100 μm zu erhalten. Fahren Sie mit dem Schneiden fort, bis das gesamte Herz durchtrennt ist.
    HINWEIS: Es können unterschiedliche Schicht- und Plattenstärken verwendet werden, es ist jedoch wichtig, dass die Scheibenentnahme genau an dem Punkt beginnt, an dem die Klinge den Ventrikel berührt, und dass das gesamte Herz mit mindestens 10-12 gleichmäßig verteilten Platten durchtrennt wird. Es können mehr als eine Schicht pro Platte erfasst werden, um doppelte Sätze bereitzustellen.
  12. Färben Sie Gewebeschnitte mit Standardprotokollen für Hämatoxylin und Eosin oder Massons Trichrom, um eine klare Unterscheidung zwischen Epikard, Myokard, Klappen und Infarktzone zu ermöglichen.
  13. Digitalisieren Sie den Gewebeschnitt mit einem Kameramikroskop oder Objektträgerscanner bei ausreichender Vergrößerung, um die trabekulierte Struktur des Axolotl-Ventrikels deutlich sichtbar zu machen (Abbildung 2I).
  14. Laden Sie den Bildstapel in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) und initialisieren Sie das Zellzähler-Plug-In (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
  15. Führen Sie ein Mehrzweck-Rastermakro (https://imagej.nih.gov/ij/macros/Multipurpose_grid.txt) aus, und generieren Sie ein Punktraster mit einer angemessenen Rasterdichte.
    HINWEIS: Die Gitterdichte (Rasterfläche) hängt von der Stichprobengröße und der Morphologie ab. Um eine wünschenswerte Genauigkeit zu erzielen, sollten mindestens 100-200 Schnittpunkte von Gitterpunkten und jeder der interessierenden Strukturen sichergestellt werden.
  16. Zählen Sie die Anzahl der Schnittpunkte zwischen Punktgitter und interessierenden Strukturen mit dem Zellzähler-Plugin (Abbildung 2I, Vergrößerung rechts).
    HINWEIS: Für die Genauigkeit ist es wichtig, nur die Schnittpunkte einzubeziehen, die genau am Zielpunkt des Fadenkreuzes angezeigt werden.
  17. Berechnen Sie den Infarktanteil aus der vordefinierten Punktrasterfläche [Ai(p) und Av(p)], der Plattendicke und der Anzahl der Punktgitterschnitte an jeder Platte (Pj) mit infarziertem Myokard und gesamtem ventrikulärem Myokard nach folgender Formel:
    figure-protocol-3 (3)

Ergebnisse

Bei Axolotln mit einer Körpermasse von 11,8 ± 1,3 g und einer Gesamtlänge von 11,8 ± 0,5 cm führt das Kryoverletzungsverfahren mit einer Kryosonde von 2 mm (Durchmesser) 7 Tage nach der Verletzung, in dem die Infarktzone vollständig entwickelt ist, zu einem Infarktbereich, der 45,4 ± 14,2 % des ventrikulären Myokards bedeckt [Abbildung 2I, vergleiche Schnitt aus gesundem Herzen vor der Verletzung (oben) und 7 Tage nach der Verletzung (unten)]. Das Verfahren hat eine Mortalitätsrate von 2,2 % (2/90 Tiere). Das Verfahren führt zu einer gut definierten Verletzungszone, die mit nicht-invasiver Echokardiographie sichtbar, quantifiziert und modelliert werden kann (Abbildung 2C-H, Zusatzmaterial 1-4). Anfänglich wirkt sich ein durch Kryoverletzungen induzierter Myokardinfarkt signifikant auf die Herzfunktion aus, indem er das Schlagvolumen auf 62,2 % und das Herzzeitvolumen auf 73,9 % 7 Tage nach der Verletzung im Vergleich zu vor der Verletzung reduzierte, mit einer allmählichen Wiederherstellung von Form und Funktion über drei Monate (Daten nicht gezeigt). Bei dem relativ ruhigen Axolotl werden keine Verhaltensänderungen nach myokardialer Kryoverletzung beobachtet.

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Abbildung 1: Ablauf des Kryoinfarkts. A, eine speziell angefertigte Kryosonde, wird hergestellt, indem drei Kupferdrähte aufgewickelt, die Spitze zu einer Kugel geschmolzen und der Draht am Kolben einer 2,5-ml-Spritze befestigt wird. B-L, das Kryoinfarktverfahren. Nach der Umhüllung aller Körperteile mit Ausnahme der Operationszone in Feuchttüchern (B) wird mit einer Iridektomieschere (B) ein ventraler Schnitt am Thorax etwas rechts der Mittellinie (Bild B) durchgeführt und der Brustgürtel durch Stumpfdissektion befreit. Das Perikard wird vorsichtig mit einem Schnitt geöffnet und die Perikardflüssigkeit wird mit einer stumpfen 23-Gauge-Nadel (D) in eine 1-ml-Spritze aspiriert. Der Ventrikel wird freigelegt und die Wunde mit einer Pinzette mit vordefinierter Öffnungsweite (E) offen gehalten und die verbleibende Flüssigkeit auf dem Ventrikel abgewischt (F). Bei der Scheinchirurgie wird eine ungekühlte Kryosonde (G) auf die gleiche Weise wie bei der Kryoverletzung angewendet, bei der die in flüssigem Stickstoff (-196 °C) gekühlte Kryosonde an der Seitenwand des Ventrikels in Richtung Spitze (H) aufgebracht wird. Nach 10 s wird die Perikardflüssigkeit erneut auf die Kryosonde aufgetragen, um sie aus dem Ventrikel (I) zu lösen. Dadurch ergibt sich eine klar definierte Kryoverletzungszone (J). Zum Schluss werden der Herzbeutel und der Brustgürtel auf das Herz gelegt und die Haut mit einer auflösbaren Naht (K) vernäht (3-5 Stiche). Das Tier wird 2 Stunden lang auf Eis gelassen, um den Wundheilungsprozess einzuleiten (L). Der Schädel befindet sich nach links auf B-L und stellt die Ausrichtung des Tieres für einen Chirurgen mit dominanter rechter Hand dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Erwartete Ergebnisse. A und B, B-Modus-Langachsenbilder des gesunden Axolotl-Ventrikels in Diastole (A) und Systole (B). C und D, B-Modus Langachsenbilder von kryogeschädigten (2 Tage nach der Verletzung) Axolotl-Ventrikel in Diastole (C) und Systole (D). E und F, B-Mode-Kurzachsenbilder von kryogeschädigten (2 Tage nach der Verletzung) Axolotl-Ventrikel in Diastole (E) und Systole (F). G, Pulswellen-Doppler erfasste Geschwindigkeits-Zeit-Integrale des Herzens vor (oben) und 2 Tage nach dem Infarkt (unten). H, Modellierung des Herzens vor und 2 Tage nach dem Infarkt aus dreidimensionaler Ultraschallaufnahme. I, repräsentative transversale Histologieschnitte durch den Axolotl-Ventrikel 4 Tage nach dem Schein (oben) und 7 Tage nach dem Infarkt (unten), gefärbt mit Masson's Trichrome. Die Vergrößerung auf der rechten Seite zeigt das Punktgitter für die stereologische Messung des Infarktanteils. Punkte, die durch blaue und rote Kreise markiert sind, stellen den Schnittpunkt mit gesundem (blaue Kreise) und infarztem (rote Kreise) Gewebe dar. Der Schädel befindet sich bei A-D nach rechts und bei den Tieren rechts nach links in E-F, was die herkömmliche Darstellung von echokardiographischen Bildern darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Material 1: Lange Achse, gesunder Ventrikel vor dem Infarkt, B-Modus (siehe Abbildung 2A-B). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Material 2: Lange Achse, infarzierter Ventrikel (2 Tage nach Infarkt), B-Modus (siehe Abbildung 2C-D). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Material 3: Kurze Achse, infarzierter Ventrikel (2 Tage nach Infarkt), B-Modus (siehe Abbildung 2E-F). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Material 4: Dreidimensionale interaktive Modelle desselben Herzens, wie in Abbildung 2A-H und Zusatzmaterial 1-3 vor und nach dem Infarkt zu sehen. Starten Sie die interaktive PDF-Datei in Adobe Acrobat Reader 9 oder höher. Klicken Sie auf das Modell, um das 3D-Feature zu aktivieren. Drehen, zoomen und schwenken Sie das Modell mit dem Cursor. Im Modellbaum am linken Bildschirmrand können alle Segmente aktiviert/deaktiviert oder transparent gemacht werden. Der Modellbaum ist als Hierarchie aufgebaut, die mehrere Unterschichten enthält, die geöffnet werden können (durch Auswahl von +). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Um experimentelle Variationen zu minimieren, sollte das chirurgische Verfahren der Kryoverletzung sterilen Verfahren folgen und eine chirurgische Schulung an einer Reihe von Tieren durchgeführt werden, bevor versucht wird, Tiere für spezifische regenerative Experimente zu verwenden. Mit Training kann das Kryoverletzungsverfahren an einer Vielzahl von Axolotl-Größen und -Altersgruppen durchgeführt werden, von Jungtieren (5 g, 7 cm) bis hin zu großen Erwachsenen (100 g, 25 cm). Es ist wichtig, dass die Kryosonde eine ausreichende Größe hat und ausreichend gekühlt wird, um eine robuste und wiederholbare Kryoverletzung des Axolotl-Ventrikels zu gewährleisten. Für sehr kleine Tiere (5-8 g, 7-9 cm) kann die Kryosonde mit einem kleineren Durchmesser konstruiert werden. Während es zwingend erforderlich ist, dass das Kryoverletzungsprotokoll unter Verwendung eines Anästhetikums mit analgetischen Eigenschaften wie Benzocain und MS-222 (oder mit der zusätzlichen Anwendung eines sekundären Analgetikums) durchgeführt wird, kann die anschließende Echokardiographie mit anderen Anästhetika mit nur begrenzten analgetischen Eigenschaften durchgeführt werden, wie z. B. Propofol, von dem beschrieben wurde, dass es die Herzfunktion weniger beeinflusst als Benzocain und MS-222 im Axolotl22.

Das Kryoverletzungsverfahren ist insofern eingeschränkt, als es keinen Ischämie-induzierten Myokardinfarkt durch Koronararterienverschluss in der gleichen Weise hervorruft wie Koronararterien-Ligaturverfahren, die den klinischen Fällen eines Myokardinfarkts beim Menschen eher ähneln. Die ligaturbasierte Methode ist jedoch nicht anwendbar im trabekulierten Amphibienherz mit sehr wenig koronaren Gefäßen und einer überwiegend luminalen Sauerstoffversorgung. Es wurde auch beschrieben, dass ein Kryoverletzungs-induzierter Myokardinfarkt die meisten pathologischen Folgen von Ischämie-induzierten Myokardinfarkten rekapituliert14,16. Die durch Kryoverletzung erzeugte Verletzungszone ist stark lokalisiert zum Gewebe in der Nähe der Kryosonde, und obwohl dies nicht einem komplexen und verzweigten Infarkt infolge einer Koronarblockade ähnelt, ist es in einer experimentellen Umgebung vorteilhaft, da die Grenzzone zwischen gesundem und infarktiertem Gewebe leicht erkannt werden kann und das Fortschreiten neu gebildeter Kardiomyozyten untersucht werden kann.

Der Axolotl ist ein wesentlich größeres Tier als der Zebrafisch mit einem komplizierteren Herz-Kreislauf-System, einschließlich eines Herzens, das aus drei Kammern (zwei Vorhöfe, ein Ventrikel) besteht, und einer funktionellen, wenn auch nicht anatomischen Trennung des Blutflusses in sauerstoffhaltigen und sauerstoffarmen Strömen23 im Vergleich zu dem Zweikammerherz und dem seriellen Flusssystem, das bei Teleosten zu finden ist. Das zuvor beim Zebrafisch beschriebene Kryoverletzungsverfahren beinhaltet keine postoperative Naht der eingeschnittenen Bauchfläche16,17. Dies ist beim Axolotl notwendig, um eine unnötige Exposition des Herzens gegenüber der unsterilen aquatischen Umgebung im Laborhabitat des Tieres zu vermeiden.

Eine unverzerrte, auf der Stereologie basierende quantitative Histologie wird derzeit im regenerativen Bereich unterschätzt, da die meisten quantitativen Messungen des Infarktanteils auf einem Bereich beruhen, der auf einem histologischen Schnitt in der mittleren Infarktzone und in einigen Fällen zwei benachbarten Abschnitten beruht24. Da das Konzept der Stereologie bei histologischen Untersuchungen an jeder Modellspezies angewendet werden kann, um robustere und unverzerrtere Messungen zu ermöglichen, schlagen wir vor, dass diese frei verfügbare Methode in die quantitative Bewertung der Herzregeneration nicht nur beim Axolotl, sondern bei allen regenerativen Spezies einbezogen werden sollte.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Casper Bindzus Foldager, Asger Andersen und Michael Pedersen (alle an der Abteilung für Klinische Medizin der Universität Aarhus) und David Gardiner (Abteilung für Entwicklungs- und Zellbiologie, University of California, Irvine) für ihre Hilfe bei der anfänglichen Entwicklung des Axolotl-Kryoverletzungsmodells und der Ultraschalluntersuchung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
S& T Schere SAS-15S& T AG - Mikrochirurgische InstrumenteIridektomieschere
Vevo 2100Fujifilm, VisualSonicsHochfrequenz-Ultraschallscanner

Referenzen

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