Methodenartikel

Kovalente Markierung mit Diethylpyrocarbonat zur Untersuchung der Proteinstruktur höherer Ordnung durch Massenspektrometrie

5.3K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/61983

⸱

15. Juni 2021

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die experimentellen Verfahren zur Durchführung einer diethylpyrocarbonat-basierten kovalenten Markierung mit massenspektrometrischem Nachweis werden beschrieben. Diethylpyrocarbonat wird einfach mit dem interessierenden Protein oder Proteinkomplex gemischt, was zur Modifikation von lösungsmittelzugänglichen Aminosäureresten führt. Die modifizierten Rückstände können nach proteolytischem Aufschluss und Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie identifiziert werden.

Zusammenfassung

Die Charakterisierung der Struktur höherer Ordnung eines Proteins ist für das Verständnis seiner Funktion unerlässlich. Die Massenspektrometrie (MS) hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug für diesen Zweck entwickelt, insbesondere für Proteinsysteme, die mit herkömmlichen Methoden schwer zu untersuchen sind. Um die Struktur eines Proteins durch MS zu untersuchen, werden spezifische chemische Reaktionen in Lösung durchgeführt, die die Strukturinformationen eines Proteins in seine Masse kodieren. Ein besonders effektiver Ansatz ist die Verwendung von Reagenzien, die lösungsmittelzugängliche Aminosäure-Seitenketten kovalent modifizieren. Diese Reaktionen führen zu Massenzuwächsen, die in Kombination mit proteolytischem Aufschluss und Tandem-Massenspektrometrie mit Rückstandsauflösung lokalisiert werden können. Hier beschreiben wir die Protokolle, die mit der Verwendung von Diethylpyrocarbonat (DEPC) als kovalentes Markierungsreagenz zusammen mit dem MS-Nachweis verbunden sind. DEPC ist ein hochelektrophiles Molekül, das in der Lage ist, bis zu 30% der Rückstände im durchschnittlichen Protein zu kennzeichnen und dadurch eine hervorragende strukturelle Auflösung zu bieten. DEPC wurde erfolgreich zusammen mit MS eingesetzt, um Strukturelle Informationen für kleine Single-Domain-Proteine wie β2-Mikroglobulin bis hin zu großen Multi-Domain-Proteinen wie monoklonalen Antikörpern zu erhalten.

Einleitung

Proteine sind essentielle Biomoleküle in praktisch jedem physiologischen Prozess. Die Vielfalt der Funktionen, die Proteine erfüllen, ist aufgrund der Strukturen, die sie annehmen, und der Wechselwirkungen, die sie mit anderen Biomolekülen haben, möglich. Um die Proteinfunktion auf einer tieferen Ebene zu verstehen, werden biochemische und biophysikalische Werkzeuge benötigt, um diese wichtigen strukturellen Merkmale und Wechselwirkungen aufzuklären. Traditionell haben Röntgenkristallographie, kryogene Elektronenmikroskopie und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) die gewünschten Details auf atomarer Ebene geliefert, um die Proteinstruktur aufzudecken. Zahlreiche Proteinsysteme können jedoch aufgrund eines schlechten Kristallisationsverhaltens, einer begrenzten Proteinverfügbarkeit, einer übermäßigen Probenheterogenität oder molekularer Gewichtsbeschränkungen nicht mit diesen Techniken abgefragt werden. Folglich sind neuere Analysemethoden entstanden, die diese Einschränkungen überwinden. Zu den aufkommenden Techniken, die Proteinstrukturinformationen liefern können, gehört die Massenspektrometrie.

Die Massenspektrometrie (MS) misst das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/ z) eines Moleküls, so dass Proteinstrukturinformationen höherer Ordnung erhalten werden müssen, indem die gewünschte Strukturinformation in die Masse des Proteins kodiert wird. Es wurden mehrere Ansätze zur Kodierung dieser Informationen entwickelt, darunter Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX)1,2,3,4, chemische Vernetzung (XL)5,6und kovalente Markierung (CL)7,8,9,10. In HDX werden Backbone-Amid-Wasserstoffe durch etwas massivere Deuteriume mit Raten ausgetauscht, die von der Lösungsmittelzugänglichkeit und dem H-Bindungsumfang abhängen. Das Ausmaß von HDX kann lokalisiert werden, indem das Protein schnell in Peptidfragmente verdaut wird, bevor diese Fragmente durch das Massenspektrometer getrennt und gemessen werden oder indem das Protein in einem Top-Down-Experiment dissoziiert wird. Die Bestimmung der Austauschrate liefert weitere Einblicke in die Proteindynamik. HDX hat sich trotz der Herausforderungen im Zusammenhang mit dem Rückaustausch und der Notwendigkeit spezieller Geräte zur Maximierung der Reproduzierbarkeit als wertvolles Werkzeug zur Charakterisierung der Proteinstruktur erwiesen. Bei XL-MS werden Proteine mit bifunktionellen Reagenzien umgesetzt, die kovalent benachbarte Rückstandsseitenketten innerhalb eines gegebenen Proteins oder zwischen zwei Proteinen verbinden. Auf diese Weise kann XL-MS Entfernungsbeschränkungen bereitstellen, die zur Charakterisierung der Proteinstruktur verwendet werden können. Die Regionen des Proteins, die vernetzt sind, können durch proteolytische Verdauung identifiziert werden, gefolgt von einer Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS-Analyse. Während XL-MS ein vielseitiges Werkzeug ist, das zur Untersuchung einer Vielzahl von Proteinkomplexen, einschließlich innerer Zellen, verwendet wurde, ist die Identifizierung der XL-Produkte eine Herausforderung und erfordert spezielle Software.

CL-MS hat sich in letzter Zeit als komplementäres und manchmal alternatives MS-basiertes Werkzeug zur Untersuchung der Proteinstruktur und -interaktionen herausgestellt. Bei CL-MS wird ein Protein oder Proteinkomplex kovalent mit einem monofunktionellen Reagenz modifiziert, das mit lösungsmittelexponierten Seitenketten reagieren kann (Abbildung 1). Durch den Vergleich der Modifikationsausdehnungen eines Proteins oder Proteinkomplexes unter verschiedenen Bedingungen können Konformationsänderungen, Bindungsstellen und Protein-Protein-Grenzflächen aufgedeckt werden. Nach der CL-Reaktion können ortsspezifische Informationen, oft auf der Ebene einzelner Aminosäuren, mit typischen Bottom-up-Proteomik-Workflows gewonnen werden, bei denen Proteine proteolytisch verdaut, Peptidfragmente durch LC getrennt und modifizierte Stellen mit Tandem-MS (MS / MS) identifiziert werden. Die reiche Geschichte der Biokonjugatchemie hat zahlreiche Reagenzien für CL-MS-Experimente zur Verfügung gestellt. CL-Reagenzien lassen sich in zwei allgemeine Kategorien einteilen: (i) spezifisch und (ii) unspezifisch. Spezifische Reagenzien reagieren mit einer einzigen funktionellen Gruppe (z. B. freieAmine) 8,10 und sind einfach zu implementieren, liefern jedoch tendenziell nur begrenzte strukturelle Informationen. Unspezifische Reagenzien reagieren mit einer Vielzahl von Seitenketten, erfordern aber oft spezielle Geräte wie Laser oder Synchrotronquellen, um diese hochreaktiven Spezies herzustellen. Hydroxylradikale sind das am häufigsten verwendete unspezifische Reagenz, das in Hydroxyl radical footprinting (HRF)7, 11,12,13 Experimenten angewendetwurde,um eine breite Palette von Proteinen und Proteinkomplexen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu untersuchen.

Unsere Forschungsgruppe hat erfolgreich ein weiteres relativ unspezifisches Reagenz namens Diethylpyrocarbonat (DEPC) verwendet, um die Proteinstruktur und -wechselwirkungen im Rahmen der CL-MS-Experimente14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25zuuntersuchen. DEPC bietet die Einfachheit spezifischer Markierungsreagenzien (d.h. es ist keine spezielle Ausrüstung erforderlich, um die Reaktionen durchzuführen), während es mit bis zu 30% Aminosäuren im durchschnittlichen Protein reagiert. Als hochelektrophiles Reagenz ist DEPC in der Lage, mit dem N-Terminus und den nukleophilen Seitenketten von Cystein-, Histidin-, Lysin-, Tyrosin-, Serin- und Threoninresten zu reagieren. Typischerweise wird ein einzelnes Produkt dieser Reaktionen erzeugt, was zu einer Massenzunahme von 72,02 Da führt. Diese einzelne Art von Produkt steht im Gegensatz zu den bis zu 55 verschiedenen Produkten, die hergestellt werden können, wenn Proteine mit Hydroxylradikalen reagieren7. Eine solche einfache Chemie erleichtert die Identifizierung von markierten Stellen.

Hier stellen wir Protokolle für die Verwendung von DEPC-basiertem CL-MS zur Verfügung, um Proteinstruktur und -interaktionen zu untersuchen. Details im Zusammenhang mit der Reagenzienvorbereitung, DEPC-Proteinreaktionen, Proteinverdauungsbedingungen, LC-MS- und MS / MS-Parametern und Datenanalyse werden beschrieben. Wir demonstrieren auch den Nutzen der DEPC-Markierung, indem wir Beispielergebnisse aus Protein-Metall-, Protein-Liganden- und Protein-Protein-Interaktionen sowie Protein-Protein-Interaktionen liefern, die beim Erhitzen strukturelle Veränderungen erfahren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Protein- und Reagenzienzubereitung

HINWEIS: Dieses Protokoll enthält einen Beispiel-Workflow für die Kennzeichnung eines Proteins mit DEPC. Einige der aufgeführten Bedingungen und Reagenzkonzentrationen können je nach Protein der Wahl variieren.

  1. Bereiten Sie alle Reagenzlösungen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor.
  2. Bereiten Sie eine Proteinlösung der gewünschten Konzentration, normalerweise im Bereich von zehn μM, in einem 10 mM 3-(N-Morpholino)propanesulfonsäure (MOPS) Puffer bei pH 7,4 vor. Alternativ können Sie eine vorhandene Proteinlösung mit Pufferaustausch in 10 mM pH 7,4 MOPS vorbereiten, wenn die Probe einen nukleophilen Puffer enthält, der mit DEPC reaktiv wäre. Andere Puffer (z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung) können ebenfalls verwendet werden, sofern sie keine nukleophilen funktionellen Gruppen aufweisen.
  3. Bereiten Sie eine 100 mM DEPC-Lösung in trockenem Acetonitril (ACN) vor, indem Sie 1,45 μL der 6,9 M DEPC-Stammlösung in 98,55 μL des ACN pipettieren.
    HINWEIS: Es gibt nicht den einen Satz von Konzentrationen, die mit jedem Protein funktionieren, obwohl die optimalen Konzentrationen basierend auf der Anzahl der His- und Lys-Rückstände geschätzt werden können23. Beispielsweise reagiert das Protein mit 50 μL einer 50 μM β2-Mikroglobulinlösung mit 0,2 μL des 100 mM DEPC für eine endgültige DEPC-Konzentration von 200 μM (entspricht dem 4-fachen der Proteinkonzentration), um das gewünschte molare Verhältnis anhand dieses allgemeinen Beispiels zu gewährleisten (Tabelle 1). Die DEPC-Markierung ist eine Reaktion2. Ordnung, so dass die Änderung der Proteinkonzentration oder der DEPC-Konzentration im Reaktionsgemisch die Markierungsrate ändert.
  4. 1 M Imidazollösung durch Wiegen von 10 mg Imidazol und Auflösen in 146,9 μL HPLC-Wasser vorbereiten.

2. Kovalente Markierung intakten Proteins

  1. Stellen Sie die Wasserbadtemperatur auf 37 °C ein und warten Sie, bis das Bad eine stabile Temperatur erreicht hat.
    HINWEIS: Reagenzkonzentrationen und -volumina für ein Beispiel-Kennzeichnungsprotokoll finden Sie in Tabelle 1.
  2. Mischen Sie in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen MOPS-Puffer und Proteinlösung in den in Tabelle 1aufgeführten Volumina .
  3. Zum Protein und Puffer werden 0,2 μL der DEPC-Lösung hinzugefügt, wobei Sie sicherstellen, dass die resultierende Lösung richtig gemischt wird, und legen Sie dann das Röhrchen mit dem Reaktionsgemisch für 1 Minute in das 37 ° C-Wasserbad.
    HINWEIS: Das zugesetzte ACN-Volumen sollte 1% des gesamten Reaktionsvolumens nicht überschreiten, um eine Störung der Proteinstruktur während der Markierungsreaktion zu vermeiden. Die Reaktionszeit liegt beim Anwender, obwohl eine 1-minütige Reaktion unter den Beispielbedingungen die Überetikettierung und die potenzielle Hydrolyse von DEPC14minimiert.
  4. Nach 1 Minute das Röhrchen mit dem Reaktionsgemisch aus dem Wasserbad entfernen und die Reaktion mit 1 μL der 1 M Imidazollösung abschrecken, um den verbleibenden nicht umgesetzten DEPC aufzufangen.
    HINWEIS: Die Endkonzentration von Imidazol im Reaktionsgemisch sollte dem 50-fachen der DEPC-Konzentration im Reaktionsgemisch entsprechen. Dadurch wird sichergestellt, dass verbleibende nicht umgesetzte DEPC abgesplündert wird.

3. Herstellung von Protein digest für Bottom-up LC-MS

HINWEIS: Wählen Sie Verdauungsbedingungen, die für das interessierende Protein bereit sind. Übliche Schritte beinhalten die Entfaltung des Proteins und die Reduzierung und Alkylierung von Disulfidbindungen.

  1. Entfalten Sie das Protein, indem Sie dem Reaktionsgemisch ein geeignetes Entfaltungsreagenz hinzufügen.
    HINWEIS: Häufige Entfaltungsmittel sind ACN, Harnstoff und Guanidinhydrochlorid (GuHCl).
  2. Herstellung von Lösungen von Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) und Jodoacetamid (IAM), indem jeweils 5 mg wiegen und in neuen Mikrozentrifugenröhrchen in 174,4 und 270,3 μL mit 10 mM pH 7,4 MOPS Puffer für die Reduktions- und Alkylierungsschritte gelöst werden.
  3. Reduzieren Sie die Disulfidbindungen, indem Sie 2 μL der 100 mM TCEP-Lösung (Endkonzentration von 2 mM in Reaktionsgemisch) in das Reaktionsgemisch geben und 3 Minuten bei Raumtemperatur reagieren.
    HINWEIS: Die Endkonzentration von TCEP sollte dem 40-fachen der Proteinkonzentration pro Disulfidbindung entsprechen, die in der Lösung vorhanden ist.
  4. Alkylat reduzierte Cysteine mit 4 μL der 100 mM IAM-Lösung (Endkonzentration von 4 mM in Reaktionsgemisch) für 30 Minuten im Dunkeln. IAM ist lichtempfindlich und zersetzt sich unter direktem Licht.
    HINWEIS: Die Endkonzentration von IAM in Lösung sollte doppelt so hoch sein wie die für TCEP verwendete Konzentration oder das 80-fache der Proteinkonzentration pro Disulfidbindung.
  5. Verdauen Sie das Protein mit einem geeigneten Enzym wie Trypsin oder Chymotrypsin. Ein Protein:Enzym-Verhältnis von 10:1 für eine 3-stündige Verdauung bei 37 °C mit immobilisiertem Enzym bei einer Schüttelrate von 300 Hüben/min ist typischerweise ausreichend für DEPC-markierte Proteine. Siehe Diskussion.
  6. Trennen Sie nach der Verdauung das immobilisierte Enzym von den verdauten Peptiden durch Zentrifugation bei 12.000 U / min für 5 Minuten.
  7. Analysieren Sie die Probe sofort per LC-MS/MS oder frieren Sie die Probe mit flüssigem Stickstoff ein, um den Probenabbau und den Markierungsverlust zu minimieren. Lagern Sie die tiefgefrorenen Proben bei < -20 °C, bis sie für die LC-MS/MS-Analyse bereit sind.

4. LC-MS/MS Analyse

HINWEIS: Standard-LC-MS/MS-Parameter für die Bottom-up-Proteomik können verwendet werden, um markierte Stellen auf den proteolytischen Peptidfragmenten zu identifizieren. Im Folgenden finden Sie ein allgemeines Beispiel.

  1. Trennen Sie die DEPC-markierten Peptide mit einer stationären C18-Phase in umgekehrter Phase. Verwenden Sie eine typische mobile LC-Phase von zwei Lösungsmitteln: (A) Wasser + 0,1% Ameisensäure und (B) ACN + 0,1% Ameisensäure unter Verwendung eines Gradienten (z. B. Abbildung 2),um die beste Trennung von Peptiden zu erreichen.
    HINWEIS: Die Trennzeit kann basierend auf der Probenkomplexität optimiert werden, und die mobile Phasendurchflussrate hängt davon ab, ob Kapillar- oder Nano-LC verwendet wird.
  2. Verwenden Sie ein Massenspektrometer, das in der Lage ist, Online-LC-MS und MS / MS zu tun, um DEPC-Modifikationsstellen auf dem Peptid zu identifizieren. In unseren Experimenten haben wir erfolgreich verschiedene Arten von Massenspektrometern eingesetzt. Jedes Massenspektrometer, das in der Lage ist, ms/MS vieler Peptide im Verlauf einer LC-MS-Analyse automatisch durchzuführen, sollte geeignet sein. Relevante MS-Parameter sind: ESI-Quellspannung = -4000 V für reguläre ESI; -2000 V für Nanospray; Orbitrap-Auflösung = 60.000; Dynamische Ausschlussdauer = 30 s; MS/MS-Aktivierungstyp: CID, ETD oder beides; Massenscanbereich = 200-2.000; Automatic Gain Control = 4.0E5 (MS1 in Orbitrap) und 5.0E4 (MS2 in linearer Quadrupol-Ionenfalle).
  3. Laden und injizieren Sie die verdaute, markierte Proteinprobe in das LC-System und starten Sie die LC-MS/MS-Erfassung. Wenn die Probe blitzgefroren wurde, vor der Analyse auftauen. Leiten Sie das LC-Abwasser für die ersten 5 Minuten in den Abfall um, um zu vermeiden, dass übermäßige Salze in die ESI-Quelle gelangen.
    HINWEIS: Im Allgemeinen wird eine 5-μL-Injektionsschleife verwendet, die die Injektion von etwa 2,5 μg Protein in die LC-MS/MS ermöglicht. Dies ist abhängig von den Belastungsbedingungen des LC, um den Probeninjektor nicht zu verstopfen.

5. Datenanalyse

  1. Identifizieren Sie DEPC-Markierungsstellen und quantifizieren Sie Peptidspitzenbereiche mit geeigneter Software für das verwendete Massenspektrometer.
  2. DePC-Addition (72,02 Da) und Carbamidomethylierung (57,02 Da) als variable Modifikationen einschließen. Weitere Suchparameter für die MS/MS-Analyse sind wie folgt: Maximale verpasste Spaltungen = 3; Fragmentionentypen = b und y; Vorläufer-m/z-Toleranz = 10 ppm (dieser Wert sollte höher sein, wenn ein Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometer verwendet wird); Fragment-m/z-Toleranz = 0,5 Da (dieser Wert sollte niedriger sein, wenn ein hochauflösendes Massenspektrometer für einen Produktionenscan verwendet wird); Vorläuferladung = 1-4.
    HINWEIS: Verschiedene Datenbanksuchalgorithmen haben unterschiedliche Bewertungssysteme, und viele können Schwierigkeiten haben, DEPC-modifizierte Peptide zu identifizieren, da die Modifikationsstufen niedrig sein können. Eine Anpassung des Score-Cutoffs kann erforderlich sein, um mehr markierte Peptide zu identifizieren. Wenn ja, sollte die manuelle Abfrage der MS/MS-Daten verwendet werden, um Peptide mit niedriger Punktzahl zu überprüfen. Das Produkt der Hydrolyse des DEPC-Labels wird nicht in die Datensuche einbezogen, da das hydrolysierte DEPC nicht mehr auf nukleophile Seitenketten reaktiv ist.
  3. Bestimmen Sie die Prozentsätze der Modifikation auf Rückstandsebene unter Verwendung der chromatographischen Spitzenbereiche der modifizierten und unveränderten Versionen der Peptide.
    HINWEIS: Jedes Peptid, das den modifizierten Rückstand von Interesse enthält, muss berücksichtigt werden und alle enthaltenen Ladungszustände müssen in allen gemessenen Proben vorhanden sein. Peptide mit unterschiedlichen Ionisationswirkungsgraden und Eluierungen zu unterschiedlichen Zeiten führen dazu, dass dieser Wert ein relatives und kein absolutes Maß für die Modifikation einer bestimmten Stelle ist.
    figure-protocol-1
    wobei Ai,z die Spitzenfläche eines bestimmten Peptids (i) darstellt, das den interessierende Rückstand enthält und alle nachgewiesenen Ladungszustände berücksichtigt (z).
  4. Bestimmen Sie, ob eine Markierungsänderung zwischen einer Kontroll- und einer Versuchsprobe signifikant ist, indem Sie statistische Auswertungen verwenden. Drei Replikatmessungen für jede Probe sind typisch, und t-Tests werden am häufigsten mit 95- oder 99%-Konfidenzintervallen verwendet.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Identifizieren von DEPC-Änderungsstandorten und Änderungsprozentsätzen
Die Massenzugabe aufgrund kovalenter Markierung kann an den (a) intakten Protein- und (b) Peptidspiegeln8,9gemessen werden. Auf intakter Ebene kann eine Verteilung von Proteinspezies mit unterschiedlicher Anzahl von Markierungen durch direkte Analyse oder LC-MS von markierten Proteinproben erhalten werden. Um strukturell höher aufgelöste Informationen (d.h. ortsspezifische Markieru...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Kritische Schritte
Mehrere Punkte in Bezug auf das experimentelle Design sollten berücksichtigt werden, um zuverlässige Kennzeichnungsergebnisse zu gewährleisten. Erstens, um die Proteinmarkierung zu maximieren, ist es notwendig, Puffer mit stark nukleophilen Gruppen (z. B. Tris) zu vermeiden, da sie mit DEPC reagieren und das Ausmaß der Markierung verringern können. Es ist auch denkbar, dass solche Puffer mit markierten Rückständen reagieren könnten, was zur Entfernung des Etiketts und damit zum Verlust von ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Die Autoren bestätigen die Unterstützung der National Institutes of Health (NIH) unter Grant R01 GM075092. Das Thermo Orbitrap Fusion Massenspektrometer, mit dem einige der hier beschriebenen Daten erfasst wurden, wurde mit Mitteln des National Institutes of Health Grant S10OD010645 erworben.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Mikrozentrifugenröhrchen für 1,5 mLThermo Fisher Scientific3448
3-(N-Morpholino)propansulfonsäureMillipore SigmaM1254
3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, NatriumsalzMillipore SigmaM9381
Acclaim PepMap RSLC C18 SäuleThermo Scientific164537300 μ m x 15 cm, C18, 2 μ m, 100 A
AcetonitrilFisher ScientificA998-1
DiethylpyrocarbonatMillipore SigmaD5758
Wasser in HPLC-QualitätFisher ScientificW5-1
ImidazolMillipore SigmaI5513
Immobilisiertes ChymotrypsinProteoChemg4105
Immobilisiertes Trypsin, TPCK BehandeltesThermo Fisher Scientific20230
JodacetamidMillipore SigmaI1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphinMillipore SigmaC4706

Referenzen

  1. Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
  2. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
  3. Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
  4. Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
  5. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
  6. Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
  7. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
  8. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
  9. Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
  10. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335(2020).
  11. Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
  12. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
  13. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
  14. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
  15. Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
  16. Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
  17. Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
  18. Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
  19. Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
  20. Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
  21. Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
  22. Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
  23. Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
  24. Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
  25. Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
  26. Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
  27. Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
  28. Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115(2019).
  29. Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164(2001).
  30. Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
  31. Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
  32. Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
  33. Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
  34. Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
  35. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
  36. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
  37. Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
  38. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
  39. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
  40. Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
  41. Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
  42. Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO - A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
  43. Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Proteinstrukturproteolytischer VerdauTandem MassenspektrometrieLC MS MSHistidin Lysin Restel sungsmittelzug nglichstrukturelle Aufl sung

Verwandte Artikel