Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

Camila F. Almeida; Emma C. Frair; Nianyuan Huang; Reid Neinast; Kim L. McBride; Robert B. Weiss; Kevin M. Flanigan; Nicolas Wein

doi:10.3791/61991

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Methodenartikel

Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

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DOI:

10.3791/61991

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3. April 2021

Camila F. Almeida¹ , Emma C. Frair¹ , Nianyuan Huang¹ , Reid Neinast² , Kim L. McBride²^,³^,⁴^,⁶ , Robert B. Weiss⁵ , Kevin M. Flanigan¹^,⁶ , Nicolas Wein¹^,⁶

¹Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, ²Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, ³The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, ⁴Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, ⁵Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, ⁶Department of Pediatrics, The Ohio State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Umwandlung von Hautfibroblasten in Myoblasten und deren Differenzierung in Myotuben. Die Zelllinien stammen von Patienten mit neuromuskulären Störungen und können zur Untersuchung pathologischer Mechanismen und zur Erprobung therapeutischer Strategien verwendet werden.

Zusammenfassung

Untersuchungen sowohl der Pathophysiologie als auch der therapeutischen Ziele bei Muskeldystrophien wurden durch die begrenzte Proliferativfähigkeit menschlicher Myoblasten behindert. Mehrere Mausmodelle wurden erstellt, aber sie stellen entweder nicht wirklich die menschliche Physiopathologie der Krankheit dar oder sind nicht repräsentativ für das breite Spektrum von Mutationen beim Menschen. Die Verewigung menschlicher Primärmyoblasten ist eine Alternative zu dieser Einschränkung; Es ist jedoch immer noch abhängig von Muskelbiopsien, die invasiv und nicht leicht verfügbar sind. Im Gegensatz dazu sind Hautbiopsien leichter zu erhalten und weniger invasiv für Patienten. Fibroblasten, die aus Hautbiopsien gewonnen werden, können verewigt und in Myoblasten transdifferenziert werden, was eine Quelle von Zellen mit ausgezeichnetem myogenem Potenzial bietet. Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte Reprogrammierungsmethode von Fibroblasten in eine myogene Abstammung. Fibroblasten werden mit zwei Lentiviren transduziert: hTERT zur Verewigung der Primärkultur und ein tet-induzierbares MYOD, das durch Zugabe von Doxycyclin die Umwandlung von Fibroblasten in Myoblasten induziert und dann reife Myotuben auslöst, die späte Differenzierungsmarker ausdrücken. Dieses schnelle Transdifferenzierungsprotokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug dar, um pathologische Mechanismen zu untersuchen und innovative genbasierte oder pharmakologische Biotherapien für neuromuskuläre Störungen zu untersuchen.

Einleitung

Zelluläre Modelle, die direkt aus menschlichen Geweben gewonnen werden, sind nützlich, um viele menschliche genetische Störungen zu modellieren, mit dem Vorteil, dass der ursprüngliche genomische Kontext besteht und in vielen Fällen die gleichen molekularen und zellulären Merkmale reproduziert werden, die bei den Patienten beobachtet wurden. Im Bereich der neuromuskulären Störungen, Muskelbiopsien haben eine große Quelle für menschliche Myoblasten und haben bei der Aufklärung der pathologischen Mechanismen geholfen. Darüber hinaus sind sie ein wichtiges Werkzeug für In-vivo-Tests von Medikamenten und Gentherapien. Einerseits ist die Ableitung von Myoblasten a....