Summary
Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en detaljerad steg-för-steg-guide för montering av multigenkonstruktioner med hjälp av det modulära kloningssystemet baserat på Golden Gate-kloning. Det ger också rekommendationer om kritiska steg för att säkerställa optimal montering baserat på våra erfarenheter.
Abstract
Golden Gate-kloningsmetoden möjliggör snabb montering av flera gener i alla användardefinierade arrangemang. Den använder typ IIS-begränsningsenzymer som skär utanför deras igenkänningsplatser och skapar ett kort överhäng. Detta modulära kloningssystem (MoClo) använder ett hierarkiskt arbetsflöde där olika DNA-delar, till exempel promotors, kodningssekvenser (CDS) och terminatorer, först klonas till en ingångsvektor. Flera postvektorer monteras sedan i transkriptionsenheter. Flera transkriptionsenheter ansluts sedan till en multigenplasmid. Golden Gate-kloningsstrategin är av enorm fördel eftersom den tillåter ärrlös, riktad och modulär montering i en enpottreaktion. Det hierarkiska arbetsflödet möjliggör vanligtvis enkel kloning av ett stort antal multigenkonstruktioner utan behov av sekvensering utöver ingångsvektorer. Användningen av fluorescerande proteinavhopp möjliggör enkel visuell screening. Detta arbete ger ett detaljerat, steg-för-steg-protokoll för montering av multigenplasmider med hjälp av moclo-kit (Yeast Modular Cloning). Vi visar optimala och suboptimala resultat av multigenplasmidmontering och ger en guide för screening för kolonier. Denna kloningsstrategi är mycket tillämplig för jästmetabolisk teknik och andra situationer där multigenplasmidkloning krävs.
Introduction
Syntetisk biologi syftar till att konstruera biologiska system med nya funktioner som är användbara för läkemedels-, jordbruks- och kemiindustrin. Att montera ett stort antal DNA-fragment på ett höggenomströmningssätt är en grundläggande teknik inom syntetisk biologi. En sådan komplicerad process kan bryta ner i flera nivåer med minskande komplexitet, ett koncept lånat från grundläggande ingenjörsvetenskaper1,2. Inom syntetisk biologi monterar DNA-fragment vanligtvis hierarkiskt baserat på funktionalitet: i) Delnivå: "delar" avser DNA-fragment med en specifik funktion, såsom en promotor, en kodningssekvens, en terminator, ett ursprung för replikering; ii) Tu-nivå (Transcription units) : en TU består av en promotor, en kodningssekvens och en terminator som kan transkribera en enda gen. iii) Multigennivå: En multigenplasmid innehåller flera TUs som ofta består av en hel metabolisk väg. Denna hierarkiska församling som är pionjär av BioBrick-samhället är det grundläggande konceptet för montering av stora uppsättningar DNA i syntetiskbiologi 3.
Under det senaste decenniethar 4,5,6,7, Golden Gate kloningstekniken avsevärt underlättat hierarkisk DNA-montering2. Många andra flerdelad kloningsmetoder, såsom Gibson kloning8,ligaturoberoende kloning (SLIC)9,uracil excision-baserad kloning (USER)10, ligase cykelreaktion (LCR)11, och in vivo rekombination (DNA Assembler)12,13, har också utvecklats hittills. Men Golden Gate-kloning är en idealisk DNA-monteringsmetod eftersom den är oberoende av genspecifika sekvenser, vilket möjliggör ärrfri, riktad och modulär montering i en enpottreaktion. Golden Gate kloning drar nytta av typ IIS begränsning enzymer som känner igen en icke-palindromisk sekvens för att skapa förskjutna överhäng utanför igenkännings platsen2. En ligase förenar sedan de glödgade DNA-fragmenten för att få en flerdelad sammansättning. Genom att tillämpa denna kloningsstrategi på moclo-systemet (modulär kloning) har monteringen av upp till 10 DNA-fragment med över 90 % transformatorer avskärmade som innehåller den korrekt monteradekonstruktionen 4.
MoClo-systemet erbjuder enorma fördelar som har påskyndat design-build-testcykeln för syntetisk biologi. För det första möjliggör de utbytbara delarna kombinatorisk kloning för att snabbt testa ett stort antal parametrar. Till exempel kräver optimering av en metabolisk väg vanligtvis cykling genom många promotors för varje gen för att balansera vägflödet. MoClo-systemet kan enkelt hantera sådana krävande kloningsuppgifter. För det andra måste man sekvensera delen plasmid men vanligtvis inte TU eller multigenplasmider. I de flesta fall är screening genom koloni PCR eller begränsningssammanfattning tillräcklig för verifiering på TU- och multigenplasmidnivå. Detta beror på att kloning av delen plasmid är det enda steget som kräver PCR, som ofta introducerar mutationer. För det tredje är MoClo-systemet idealiskt för att bygga komplexa metaboliska vägar med flera gener. Slutligen, på grund av de universella överhängen, kan de delplasmider återanvändas och delas med hela bioengineeringsgemenskapen. För närvarande finns MoClo-kit tillgängliga för växter14,15,5,16,17,svampar 6,18,19,20,21,22,bakterier 7,23,24,25,26,27och djur28,29. En MoClo-plattform med flera kungarike har också introducerats nyligen30.
För Saccharomyces cerevisiaehar Lee et al.6 utvecklat en mångsidig MoClo-verktygslåda, en utmärkt resurs för jästsyntetisk biologigemenskap. Detta kit finns i ett bekvämt 96-brunnsformat och definierar åtta typer av utbytbara DNA-delar med en mångfaldig samling av väl karakteriserade promotors, fluorescerande proteiner, terminatorer, peptidtaggar, urvalsmarkörer, replikerings ursprung och genomredigeringsverktyg. Denna verktygslåda gör det möjligt att montera upp till fem transkriptionsenheter i en multigenplasmid. Dessa egenskaper är värdefulla för jästmetabolisk teknik, där partiella eller hela vägar är överp uttryckta för att producera riktade kemikalier. Med hjälp av detta kit har forskare optimerat produktionen av geraniol, linalool31, penicillin32, mukonsyra33, indigo34, och betalain35 i jäst.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat, steg-för-steg-protokoll för att vägleda användningen av MoClo-verktygslådan för att generera flergenvägar för antingen episomal eller genomiskt uttryck. Genom omfattande användning av detta kit har vi funnit att noggrann mätning av DNA-koncentrationer är nyckeln till att säkerställa equimolarfördelningen av varje del i Golden Gate-reaktionen. Vi rekommenderar också T4 DNA ligase över T7 DNA ligase eftersom den förra fungerar bättre med större antal överhäng36. Slutligen måste alla interna igenkänningsplatser för BsmBI och BsaI avlägsnas eller tämjas före monteringen. Alternativt kan man överväga att syntetisera delar för att ta bort flera interna webbplatser och för att uppnå samtidig kodonoptimering. Vi visar hur man använder denna verktygslåda genom att uttrycka en fem-gen väg för β-karoten och lykopen produktion i S. cerevisiae. Vi visar vidare hur man slår ut ADE2-locusen med hjälp av genomredigeringsverktygen från detta kit. Dessa färgbaserade experiment valdes för enkel visualisering. Vi visar också hur man genererar fusionsproteiner och skapar aminosyramutationer med Golden Gate-kloning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Det hierarkiska kloningsprotokollet som erbjuds i denna verktygslåda kan delas in i tre huvudsteg: 1. Kloningsdelplasmider; 2. Avskriftsenheter för kloning(TUs). 3. Kloning av multigenplasmider (figur 1). Detta protokoll börjar från primer design och slutar med tillämpningar av klonade multi-gene plasmid.
1. Primer design för kloning delen plasmid (pYTK001):
- Designa de främre och omvända primers som innehåller flankerande nukleotider TTT i slutet av 5', en BsmBI-igenkänningsplats med ytterligare en nukleotid (CGTCTCN), ett 4-nukleotider (nt) överhäng (TCGG) som kompletterar inträdesvektorns. En BsaI-igenkänningsplats med ytterligare en nukleotid (GGTCTCN) och ett 4-nt delspecifikt överhäng, utöver den mallspecifika sekvensen (figur 2A). GoldenBraid 4.037 och GoldenMutagenesis38 är några av de online-program som kan användas för Golden Gate-specifik primerdesign.
- Om BsaI- eller BsmBI-igenkänningsplatser finns i någon del, använd ett domesticeringssteg för att mutera dessa platser före Golden Gate-montering39. För integrativa plasmider (se steg 4), tämja alla NotI-igenkänningswebbplatser. För att tämja en del med ett oönskat erkännandeställe, dela upp delen i två underdelar nära det oönskade området (figur 2A):
- Designa den främre primern för den första delen på samma sätt som i steg 1.1. men designa den omvända primern med BsmBI-platsen och endast ett 4-nt genspecifikt överhäng.
- Designa den andra underdelen framåt primer med BsmBI-platsen och det 4-nt genspecifika överhänget endast som överlappar den omvända primern i den första underdelen. Designa den omvända primern för den andra underdelen på samma sätt som i steg 1.1.
- Introducera önskad mutation(er) i antingen omvänd (för steg 1.2.1) eller framåt primer (steg 1.2.2) vid den genspecifika regionen primer.
OBS: Alternativt kan en BsmBI- och BsaI-fri och kodonoptimerad del syntetiseras kommersiellt. För kodning sekvenser (CDS), en synonyma mutation kan lätt införlivas vid den tredje nukleotid av en aminosyra kodon. För promotors och terminatorer rekommenderas dock kontroll av muterad promotor eller terminatoraktivitet med hjälp av en reporteranalys39. Om det finns en oönskad begränsningsplats mot slutet av sekvensen kan den muteras med en längre omvänd primer. Om det finns flera oönskade platser kan platsstyrd mutagenes som tillåter mutering av flera platser utföras40.
- Ibland är det önskvärt att visga två proteiner som en enda del med en länkare däremellan (figur 2A). Länkaren hjälper till att säkerställa den strukturella integriteten hos de två enskilda proteinerna41.
- Den främre primern för den första genen är densamma som i steg 1.1. I den omvända primern, inkludera en BsmBI-plats, ett 4-nt genspecifikt överhäng och en linkersekvens. 4-nt överhänget kan vara antingen linker eller andra genens första nukleotider.
- För den andra genen, designa den främre primern så att den har en BsmBI-igenkänningsplats och ett 4-nt överhäng som kompletterar den omvända primern i den första genen. Designa den omvända primern av den andra genen som i steg 1.1.
- För att förstärka delarna genom polymeraskedjereaktion (PCR)42, använd en DNA-polymeras med hög återgivning för att förstärka delarna från antingen ett genomiskt DNA, en cDNA eller en plasmid. Kontrollera PCR-produkten på en 1% agarosgel följt av gelrening. Användning av renat DNA rekommenderas starkt, om gelrening är mödosam, använd minst en spinnkolonn för att rena PCR-produkten.
2. Kloning av delar till ingångsvektorn (pYTK001) för att skapa delplasmider (figur 2B)
- För att ställa in Golden Gate-reaktionsblandningen, tillsätt 20 fmol av varje PCR-produkt och ingångsvektorn (pYTK001), 1 μL 10X T4-ligasbuffert, 0,5 μL Esp3I (en mycket effektiv isoschizomer av BsmBI) och 0,5 μL T4-ligase. Tillsätt ddH2O för att få den totala volymen till 10 μL.
- För att ställa in kloningsreaktionen, kör följande program i en termocyklist: 25-35 cykler på 37 °C i 5 min (matsmältning) och 16 °C i 5 min (ligatur), följt av en slutlig matsmältning vid 50 °C i 10 min och enzyminaktivering vid 80 °C i 10 min.
OBS: 35 cykler av matsmältning/ligatur rekommenderas vid kloning av flera DNA-bitar i ingångsvektorn samtidigt, till exempel under kloning av fusionsgener eller tämjning av en gen. - Omvandla hela reaktionsblandningen till DH5α-stammen eller motsvarande Escherichia coli kemiskt kompetenta celler genom värmechock. Omvandling av hela den klonade produkten på 10 μL till 35 μL kemiskt kompetenta E. coli-celler (2 X 105 cfu/ml, cfu beräknas genom att omvandla 5 ng pYTK001 till 100 μL av de behöriga cellerna) rekommenderas. Sprid på en lysogen buljongplatta (LB) med 35 μg/ml kloramfenikol (cm). Inkubera vid 37 °C över natten.
- Efter 16-18 h, ta ut plattan från inkubatorn och håll plattan vid 4 °C i ca 5 h för att låta supermappens gröna fluorescerande protein (sfGFP) utvecklas för en mer intensiv grön färg.
- För enklare screening, placera plattan på en ultraviolett (UV) eller en blå ljustransilluminator. SfGFP som innehåller kolonier kommer att fluorescera under UV-ljuset.
- De gröna kolonierna är negativa eftersom de innehåller den oklippta pYTK001. De vita kolonierna är troligen positiva. Kloningen är vanligtvis framgångsrik om det finns ~ 30-100% vita kolonier. Utför ytterligare screening av några vita kolonier av antingen koloni PCR eller begränsning matsmältningar (föreslagna enzym: BsaI-HFv2).
- Rena plasmider från några av de potentiellt korrekta kolonierna och bekräfta sekvenserna genom Sanger-sekvensering.
3. Montering av delplasmider i "kassett" plasmider
OBS: En kassettplasmid innehåller en användardefinierad transkriptionsenhet (TU) bestående av en promotor, en CDS och en terminator. En kassettplasmid tillåter uttryck av en enda gen. Om kassettplasmiderna kommer att monteras i en multigenplasmid, är det första steget att bestämma antalet och ordningen på TUs i multigenplasmiden. Dessa kommer att avgöra vilka kopplingar som ska användas i kassettplasmiderna eftersom anslutningar länkar TUs i multigenplasmiden. Den första TU:ns vänstra kontakt ska vara ConLS, och den högra kontakten i den sista TU:et ska vara ConRE. De kommer att överlappa ConLS och ConRE av multigenplasmider. Resten av kopplingarna ska vara i den ökande numeriska ordningen. Om multigenplasmiden till exempel innehåller fyra TUs, skulle kopplingskombinationerna vara ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 och ConL3-TU4-ConRE (Figur 1).
- Innan transkriptionsenheter monteras rekommenderas montering av en mellanvektor med följande sex delar: vänster kontakt, sfGFP-avhopp (pYTK047), höger kontakt, en jästvalsmarkör, ett jästursprung av replikation och delen plasmid med en mRFP1, ett E. coli-ursprung och den ampicillinresistenta genen (pYTK083) ( Figur3).
- Rena ovanstående sex plasmider. Registrera deras koncentrationer med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer eller en fluorescensbaserad analys och späd varje plasmid med ddH2O så att 1 μL har 20 fmol DNA. Beräkna DNA-molarkoncentrationen med hjälp av en online-kalkylator.
OBS: Det är mycket viktigt att mäta DNA-koncentrationerna exakt och att pipet exakt för att enheten ska fungera, särskilt för enheter med fem till sju delar plasmider. Små fel i DNA-koncentrationen av varje plasmid kan orsaka en betydande minskning av kloningseffektiviteten. - Tillsätt 1 μL av varje plasmid, 1 μL 10X T4 ligasbuffert, 0,5 μL BsaI-HFv2 (en mycket effektiv version av BsaI) och 0,5 μL T4-ligase. Gör upp volymen till 10 μL genom att tillsätta ddH2O.
- För att ställa in kloningsreaktionen, kör följande program i termocyklisten: 25-35 cykler på 37 °C i 5 min (matsmältning) och 16 °C i 5 min (ligatur). Utelämna de slutliga matsmältnings- och värmeinaktiveringsstegen eftersom BsaI-platserna måste behållas i den mellanliggande vektorn (figur 3).
- Omvandla hela reaktionsblandningen till DH5α-stammen eller andra E. coli-kompetenta celler. Sprid på en LB-platta med 50 μg/ml karbinicillin (Cb) eller ampicillin. Inkubera vid 37 °C över natten.
OBS: Carbenicillin är en stabil analog av ampicillin. - Efter 16-18 h, ta ut plattan ur inkubatorn. Plattan kommer att innehålla både blekröda och blekgröna kolonier (figurerna 6C och 6D). Håll plattan vid 4 °C i ca 5 timmar för att låta mRFP1 och sfGFP mogna. Använd en UV- eller blåljustransilluminator för att identifiera de gröna kolonierna, som innehåller den potentiellt korrekta mellanvektorn.
- Strecka ut de gröna kolonierna på en LB + Cb-platta och inkubera vid 37 °C över natten. Nästa dag, strecka ut igen på en LB + Cm-platta och inkubera vid 37 °C över natten. Kolonierna som växer på LB + Cm-plattor innehåller felmonterade plasmider eftersom cm-resistenta delvektorer behålls.
- Välj de kolonier som inte växer på LB + Cm-plattan och utför restriktionssammanfattningar (föreslagna enzymer: BsaI-HFv2, Esp3I) för att bekräfta den korrekt monterade plasmiden. Alternativt kan du använda koloni PCR för screening.
- Rena ovanstående sex plasmider. Registrera deras koncentrationer med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer eller en fluorescensbaserad analys och späd varje plasmid med ddH2O så att 1 μL har 20 fmol DNA. Beräkna DNA-molarkoncentrationen med hjälp av en online-kalkylator.
- När den mellanliggande vektorn har monterats är nästa steg att montera transkriptionsenheter. Detta är en 4-delars montering med följande delar: mellanvektorn, en promotor, en CDS och en terminator.
- Rena de fyra delplasmiderna. Registrera deras koncentrationer och späd ut var och en av plasmiden så att 1 μL har 20 fmol DNA.
- För att ställa in reaktionsmixen, följ steg 3.1.2.
- Följ steg 2.2 för att ställa in kloningsreaktionen.
- Omvandla hela kloningsreaktionsblandningen till DH5α eller motsvarande E. coli-kompetenta celler och platta på LB + Cb. Inkubera vid 37 °C över natten.
- Efter 16-18 h, ta ut plattan från inkubatorn. Vita och blekgröna kolonier kommer att visas (figurerna 6E och 6F). Håll plattan vid 4 °C i ca 5 timmar för att låta sfGFP mogna. Använd en UV- eller blå ljustransilluminator för att identifiera de icke-fluorescerande vita kolonierna. Dessa innehåller de potentiellt korrekta transkriptionsenheterna.
- Streak ut och växa 8-10 vita kolonier och utföra en koloni PCR. Rena plasmider från kolonierna som testar positivt från koloniNS PCR. Utför begränsning matsmältningen (föreslagna enzym: Esp3I) för att ytterligare bekräfta monteringen.
OBS: Sekvensering av transkriptionsenheter är vanligtvis inte nödvändigt eftersom kloning endast innebär begränsnings matsmältning och ligatur. Alla sekvenser av intresse har bekräftats på delplasmidnivå.
4. Montering av kassettplasmider i "multigen" plasmider:
OBS: Multigenplasmider tillåter uttryck av mer än en gen. Beroende på nedströmsapplikationen kan multigenplasmider vara replikativa eller integrativa. Replikiva plasmider har jäst ursprunget till replikation; därför kan det upprätthållas stabilt när jästcellen delar sig. Integrativa plasmider har inte jästens ursprung av replikation. Istället har de 5' och 3 ' homologi armar som gör det möjligt att integrera flera gener i specifika lokus av genomet genom homolog rekombination.
- För multigenplasmider, montera först en mellanvektor.
- För att montera replikiva mellanliggande vektorer (figur 4A), montera följande sex delar: den vänstra kontakten (ConLS'-pYTK008), sfGFP-avhoppet (pYTK047), den högra kontakten (ConRE'-pYTK072), en jästvalsmarkör, En jäst ursprung av replikering, och delen plasmid med mRFP1, en E. coli ursprung av replikering och kanamycin-resistent gen (pYTK084).
- För montering, följ stegen från 3.1.1 till 3.1.3.
- Omvandla hela kloningsreaktionsblandningen till DH5α eller motsvarande E. coli-kompetenta celler och plåt på LB plus 50 μg/ml kanamycin (Km). Inkubera vid 37 °C över natten.
- För röd/grön färgbaserad screening, följ steg 3.1.5.
- För screening av felmontörer, streak och växa de gröna kolonierna på en LB + Km platta. Följ sedan steg 3.1.6.
- För integrativa multigenvektorer (figur 4B), bestäm den genomiska johannesbrödet av intresse först och designa sedan cirka 500 baspar av 5' och 3 ' homologi armar för att integrera till den locus.
- Klona 5' och 3' homologi armar från jäst genomiskt DNA till posten vector-pYTK001. Följ steg 1 och 2.
- Montera följande sju plasmider: den vänstra kontakten (ConLS'-pYTK008), sfGFP-avhoppet (pYTK047), den högra kontakten (ConRE'-pYTK072), en jästvalsmarkör, 3' homologi armen, delen plasmid med mRFP1, E. coli ursprung av replikering och kanamycin-resistent genen (pYTK090) och 5' homology armen.
- Följ steg 4.1.1 för montering och screening.
- För att montera replikiva mellanliggande vektorer (figur 4A), montera följande sex delar: den vänstra kontakten (ConLS'-pYTK008), sfGFP-avhoppet (pYTK047), den högra kontakten (ConRE'-pYTK072), en jästvalsmarkör, En jäst ursprung av replikering, och delen plasmid med mRFP1, en E. coli ursprung av replikering och kanamycin-resistent gen (pYTK084).
- Montering av multigenplasmiden
- Rena plasmider från mellanvektorn som erhålls i steg 4.1 och kassettplasmiderna från steg 3. Registrera deras koncentrationer med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer eller en fluorescensbaserad analys. Späd var och en i ddH2O så att 1 μL har 20 fmol DNA.
- Tillsätt 1 μL mellanvektor, 1 μL av varje transkriptionsenhet, 1 μL 10x T4 ligasbuffert, 0,5 μL Esp3I och 0,5 μL T4 ligase. För volymen till 10 μL med ddH2O.
- Följ steg 2.2 för att ställa in kloningsreaktionen.
- Omvandla hela kloningsreaktionsblandningen till DH5α eller motsvarande E. coli-kompetenta celler och plåt på LB + Km. Inkubera vid 37 °C över natten.
- Utför den grönvita screeningen enligt steg 3.2.5.
- Rena plasmider från några vita kolonier och utför restriktionssammanfattningar. Användning av NotI-HF-enzymet rekommenderas eftersom det finns två NotI-platser vid E. coli-ursprunget respektive km-urvalsmarkören (figur 4B). Om den monterade plasmiden är mycket stor kan en annan begränsningsplats väljas för ytterligare bekräftelse. Alternativt kan du skärma med koloni PCR innan du fortsätter att begränsa matsmältningen.
5. Tillämpning av multigenplasmider för kromosom- eller plasmidbaserade genuttryck
- Integrering av multigenplasmid i jästgenomet för kromosomgenuttryck (figur 5)
- Designa en guide RNA (gRNA) för önskad locus. Om du använder flera onlineresurser, till exempel Benchling, CRISPRdirect43och CHOPCHOP44,rekommenderas du för att fastställa den maximala specifikiteten för mål.
- Klona det syntetiserade 20-nt gRNA till pCAS plasmid45 av Gibson kloning. Linjärisera pCAS-plasmiden med PCR med hjälp av ett omvänt primerpar som binder till 3' av HDV ribozyme respektive 5' i tracrRNA (figur 5). Alternativt klona gRNA i sgRNA dropout plasmid (pYTK050) och montera avhoppen plasmid i en kassettplasmid med länkar. Montera sedan Cas9 TU med Cas9-delens plasmid (pYTK036). Slutligen montera Cas9 TU och sgRNA TU i en replikativ multigenplasmid.
- Linjärisera 5-15 μg integrativ multigenplasmid med 1 μL NotI-HF-enzym över natten. Omvandla 1 μg pCAS-gRNA och den linjäriserade integrativa multigenplasmiden till S. cerevisiae. Bered kompetenta celler med antingen ett kommersiellt tillgängligt jästomvandlingskit eller enligt protokollet av Geitz och Schiestl, 200746.
OBS: Det är onödigt att rena den linjäriserade multigenplasmiden efter NotI-matsmältningen. - Pellet cellerna efter återhämtning, kassera supernaten, tvätta med en lika stor mängd vatten. Plätera jästceller på hela den syntetiska medium (CSM) avhopp plattan eller jästextrakt peptone dextros medium (YPD) plattan med antibiotika, beroende på jäst selektiv markör. Inkubera vid 37 °C i två dagar för kolonier att bildas. Om ingen koloni observeras, inkubera i ytterligare en till två dagar vid 30 °C.
- Screenjästkolonier för integration av koloni PCR47.
- För att bota pCAS, strecka ut kolonin med rätt integration på en icke-selektiv YPD-platta. Odla vid 30 °C över natten. Strecka en koloni från YPD-plattan på en färsk YPD-platta. Återigen, växa vid 30 °C över natten. Strecka en koloni från den andra YPD-plattan till en YPD plus 100 μg/mL nourseothricin, urvalsmarkören för pCAS. Framgångsrik härdning sker när jästceller inte växer på den selektiva plattan.
OBS: Om pCAS-plasmiden inte härdas i två omgångar av icke-selektiv YPD, strecka igen på en ny YPD för ytterligare 1-2 rundor.
- Transformering av replikatorisk multigenplasmid för plasmidbaserat genuttryck
- Omvandla 100 ng-1 μg ren multigenplasmid till S. cerevisiae kompetenta celler.
- Plätera jästceller omedelbart efter omvandlingen på CSM-avlämningsplattan eller YPD plus antibiotikaplatta, beroende på vilken jästvalsmarkör som används. Inkubera vid 30 °C i 2-3 dagar för kolonier att bildas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här resultaten av fyra replikatoriska multi-gen plasmider för β-karoten (gul) och lykopen (röd) produktion. En integrativ multi-gene plasmid för att störa ADE2 locus konstruerades, vars kolonier är röda.
Klonings-CDS till ingångsvektorn (pYTK001)
ERG20 förstärktes från jästgenomet och de tre karotenoidgenerna crtE, crtYB, crtI från plasmid pLM49448 in i ingångsvektorn pYTK001 enligt beskrivningen. Jästpromotors pENO2, pTIP1, pPYK1 och pPDC1 och terminatorer tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2 klonades som en del plasmider. En punkt mutation infördes i CrtYB (G247A) för att producera lykopen och en BTS1-ERG20 fusion konstruktion skapades för att bättre kanalisera prenyl mellanliggande till karotenoider. Figurerna 6A och 6B visar en representativ platta för framgångsrik kloning av en delplasmid och ger ett exempel på grön/vit screening med 90,35 ± 4,22% totala kolonier som potentiellt är korrekta (vita).
Montering av transkriptionsenheter (kassettplasmider)
Innan kassettplasmiden monterades slutfördes utformningen av multigenplasmiden. För de fyra karotenoid-TUs klonades fyra mellanliggande vektorer med olika anslutningar först efter steg 3.1. Figurerna 6C och 6D visar en representativ platta från en framgångsrik sammansättning av mellanvektorn och ger ett exempel på den röd/gröna screeningen, med 17,56 ± 3,32% totala kolonier som är positiva (gröna). Även om detta förhållande är relativt lågt, underlättas screeningen kraftigt av den gröna fluorescensen.
Därefter monterades TUs för BTS1-ERG20, ERG20, crtE, crtYB, crtYB(G247A) och crtI efter steg 3.2(tabell 1). Figurerna 6E och 6F visar en representativ platta av en framgångsrik sammansättning av tv-8:erna och ger ett exempel på en grön/vit screeningmetod, där 65,02 ± 4,99 % totala kolonier är positiva (vita).
Montering av multigenplasmider
Fyra replikativa och en integrativ multi-gen plasmider monterades. För replikiva multigenplasmider monterades ERG20, BTS1-ERG20, crtE, crtYB, crtYB (G247A) och crtI i fyra olika kombinationer, vilket skapade fyra plasmider: två för β-karoten och två för lykopenproduktion (tabell 2). Förhållandet mellan potentiellt korrekta kolonier (gröna) för mellanliggande vektorkloning var 1,83 ± 0,15% (figurerna 7A och 7B). Även om detta antal verkar lågt, gjordes screeningen lätt genom att upptäcka den gröna fluorescensen (figur 7B). När den mellanliggande plasmiden klonades var framgångsgraden för montering av multigenplasmider (vita) från mellanstadiet 93,77± 1,65% (figurerna 7C och 7D). Figurerna 7E och 7F visar en suboptimal sammansättning av multigenplasmider, eftersom antalet positiva kolonier (vita) var försumbara. Efter omvandling till jäst växte kolonier som producerar β-karoten (gul) och lykopen (röd) på dag tre. Fyra kolonier från varje tallrik ströddes ut på färska tallrikar och odlades i ytterligare två dagar. Figurerna 8A och 8B visar att genom att blanda BTS1-ERG20 riktas mer geranylgeranyl-pyrofosfat mot karotenoidproduktionen, sett av mörkare färger än enbart med hjälp av ERG20. Vidextraktion 49 och kvantifiering av karotenoiderna genom UV-Vis-spektrofotometri med autentiska standarder, Det ses att fusion av BTS1-ERG20 leder till produktion av 0,729 μg/mg β karoten, vilket är ~35 gånger högre än 0,021 μg/mg β-karoten som produceras av stammen enbart med ERG20. På samma sätt är produktionen av lykopen ~16,5 gånger högre i stammen med BTS1-ERG20 (1,126 μg/mg) jämfört med ERG20 (0,068 μg/mg) ensam(figur 8C).
Replikiva multigenplasmider omvandlas till jäst med (A) BTS1-ERG20 fusion TU och (B) ERG20 TU. På varje tallrik har jäst på vänster sida plasmider som innehåller crtE TU, crtYB TU och crtI TU för produktion av β-karoten och jäst på höger sida har plasmider som innehåller crtE TU, crtYB (G247A)TU och crtI TU för produktion av lykopen.
För den integrativa plasmiden monterades ConLS', sfGFP dropout, ConRE', HIS3 (jästvalsmarkör), ADE2 5' och 3' homology arms efter steg 4.1.2. 5' och 3' homologi armar var 500 bp ifrån varandra, ta bort ~180 aminosyror efter integration. Dessutom hade 5' homologi armen sex stopp kodoner mot dess 3'. Den muterade ADE2 resulterade i röda kolonier50. ADE2 gRNA 5'-ATTGGGAC GTATGATTGTTGAGG-3'51 användes och följde steg 5.1 för genomisk integration. Efter 3-4 dagar observerades röda kolonier på YPD-plattan + 100 μg/mL nourseothricin, vilket indikerar att ADE2 hade störts framgångsrikt (Figur 8D och 8E).
Figur 1: Översikt över sammansättning av flera gener. Montering sker i tre nivåer. I nivå 1 förstärks CDS, eller någon annan del, från genomet eller syntetiseras och klonas sedan till pYTK001-ingångsvektorn med BsmBI (eller Esp3I) enzymet. ColE1: E. coli beskärning av replikation; CmR: Kloramfenikolresistent gen. I nivå 2 monteras transkriptionsenheten (TU) som innehåller en promotor, en CDS och en terminator med BsaI-enzymet. I nivå 3 monteras upp till fem transkriptionsenheter i en multigenplasmid med BsmBI(eller Esp3I) enzymet. Multigenplasmiden kan vara antingen replikativ eller integrativ. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Primerdesign och kloning av delplasmider. (A) Primer design för att förstärka enskilda delar, tämja gener eller skapa punktmutationer och montera fusionsproteiner. Primers inkluderar BsmBI och BsaI-igenkännings- och klippplatser och MoClo-överhänget för korrekt montering. MoClo-överhäng representeras som 1, 2, 3, 4 och 5, 6, 7, 8. Interna primers för domesticering eller skapande av fusionsprotein innehåller BsmBI men inte BsaI-platserna. Överhängen för dessa är anpassade interna sekvenser (NNNN och N'N'N'N' i lila). Terminal "ttt" ingår för optimal enzym matsmältning. Goi: gen av intresse. (B) Kloning förstärkta delar till pYTK001 inträdesvektor med BsmBI (eller Esp3I). Kompletterande överhäng leder till integration av delen och avlägsnande av BsmBI-erkännandeplatsen. ColE1: E. coli beskärning av replikation; CmR: Kloramfenikolresistent gen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Enhetens sammansättning av transkription. För att montera TU-plasmiderna rekommenderas monteringen av en mellanvektor för att underlätta kombinatorisk TU-montering. För att montera den mellanliggande vektorn, klona Con LX (X: en av de fem vänstra anslutningarna), sfGFP-avhoppet, Con RY (Y: en av de fem högra kontakterna), en jäst ORI (replikerings ursprung) och en jästmarkördel i mRFP1-avhoppsvektorn med BsaI-enzymet. Den mellanliggande plasmiden är resistent mot ampicillin. BsaI-igenkänningsplatserna behålls för TU-plasmidkloning. För att klona TU-plasmiden monteras en promotor, en CDS och en terminator i mellanvektorn med BsaI. Den klonade TU kommer att ha BsmBI-platser i ConLX- och ConRY-regionerna för nästa steg multigenmontering. Den klonade TU är också resistent mot ampicillin. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Namn | ConLX (vänster kontakt) | Promotorn | Cd | Terminator | ConRY (höger kontakt) |
| BTS/ERG20 Tu | Ls | pENO2 (på 2) | BTS1/ERG20 | tTDH2 (på)tTDH2 | R1 (R1) |
| ERG20 Tu | Ls | pENO2 (på 2) | ERG20 | tTDH2 (på)tTDH2 | R1 (R1) |
| crtE (crtE) Tu | L1 (L1) | pTIP1 (pTIP1) | crtE (crtE) | tHSP26 | R2 |
| crtYB Tu | L2 (L2) | pPDC1 (pPDC1) | crtYB | tADH2 (på 2) | R3 (R3) |
| crtYBG247A Tu | L2 (L2) | pPDC1 (pPDC1) | crtYBG247A | tADH2 (på 2) | R3 (R3) |
| crtI Tu | L3 (L3) | pPYK1 | crtI | tACS2 (på 2) | Re |
Tabell 1: Transkriptionsenheter som används i denna studie. Promotors och terminatorer förstärktes från S. cerevisiae. BTS1 (geranylgeranyl diphosphate syntas) och ERG20 (farnesyl pyrofosfat synthetase) förstärktes från S. cerevisiae. Generna crtE (geranylgeranyl diphosphate syntas), crtYB (bifunctional lykopen cyclase/phytoene syntas) och crtI (phytoene desaturase) var från Xanthophyllomyces dendrohous.
Figur 4: Multigenplasmidmontering. (A)Replikiv plasmidenhet. Montering av den replikiva mellanvektorn inkluderar kloning av Con LS", sfGFP-avhoppet, Con RE', en jäst ORI, en jästmarkör och ett E. coli-ursprung och markör på mRFP1-avhoppsvektorn med BsaI-enzymet. ConLS och ConRE: s webbplatser introducerar BsmBI-igenkänningsplatser till vektorn. Potentiellt korrekta enheter kan screenas genom att leta efter gröna kolonier på en selektiv tallrik med kanamycin. De tidigare monterade TUs kan sedan klonas till mellanvektorn med BsmBI-enzymet. Denna plasmid innehåller en jäst ORI så att den kan replikera i en jäst värd. b)Integrativ plasmidenhet. Monteringen av den integrativa mellanvektorn inkluderar kloning av Con LS", sfGFP-avhoppet, Con RE', en 5' homologiarm, en 3 ' homologiarm, en jästmarkör och E. coli-ursprunget och markören i RFP-avhoppsvektorn med BsaI-enzymet. Korrekta sammansättningar ska se gröna ut på en selektiv platta med kanamycin. Transkriptionsenheter som tidigare gjorts kan klonas till den replikiva mellanvektorn med BsmBI-enzymet. Denna vektor har inte en jäst ORI och kommer att integreras i mållokan genom CRISPR och homolog rekombination. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Namn | TU1 (på andra) | TU2 (på andra) | TU3 (på andra) | TU4 (på andra) | Produkt |
| B/E-β-Karoten | BTS1/ERG20 | crtE (crtE) | crtYB | crtI | β-karoten |
| B/E-Lykopen | BTS1/ERG20 | crtE (crtE) | crtYBG247A | crtI | Lykopen |
| E-β-Karoten | ERG20 | crtE (crtE) | crtYB | crtI | β-karoten |
| E-Lykopen | ERG20 | crtE (crtE) | crtYBG247A | crtI | Lykopen |
Tabell 2: Multigenplasmider som används i denna studie.
Figur 5:CRISPR-integration. A)CRISPR- och helperplasmidkloning. PCAS-plasmiden innehåller Cas9 endonukleas och komponenter (tRNA-promotor, SNR52 terminator, HDV ribozyme och tracrRNA) för optimalt uttryck av ett gRNA. Klona pCAS+gRNA-plasmiden genom att montera det syntetiska gRNA med det linjäriserade pCAS med Gibson-kloning. B)CRISPR-stödd genetisk integration. Steg 1: Samtransformation: pCAS +gRNA omvandlades till jäst tillsammans med den integrativa plasmid som innehåller den eller de gener som är av intresse (GOI), en selektiv jästmarkör och 5' och 3' homologi region som riktar sig till den genomiska locus. För optimal integration, linjärisera den integrativa plasmiden med NotI. Steg 2: Integration vid mållok: Odla den omvandlade jästen på en tallrik selektiv för jästmarkören, antingen antibiotisk eller auxotrofisk. Utför genotypning för att bekräfta integrationen. Steg 3: Härda pCAS + gRNA-plasmiden genom att strimpa jäst på en icke-selektiv platta. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6:Representativa plattor av ingångsvektor- och transkriptionsenhetsnivåkloning i E. coli. Representativa plattor av den framgångsrika kloningen av en gen i ingångsvektorn pYTK001 under(A)synligt ljus och (B) UV-ljus. Positiva kolonier är vita och negativa kolonier är gröna. Förhållandet mellan de totala kolonierna och kolonierna är 90,35 ± 4,22 %. Lyckad montering av mellanvektorn för transkriptionsenhetsnivåmontering och grönt/rött urval under (C) synligt ljus och (D) UV-ljus. Positiva kolonier är gröna. Förhållandet mellan de totala kolonierna och kolonierna är 17,56 ± 3,32 %. Lyckad montering av transkriptionsenhet från den mellanliggande vektorn och grön/vit screening under (E) synligt ljus och (F) UV-ljus. Positiva kolonier är vita och negativa kolonier är gröna. Förhållandet mellan positiva kolonier totalt är: 65,02 ± 3,32 %. Data kommer från tre biologiska replikat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Representativa plattor av multigenplasmidkloning i E. coli. Montering av mellanvektorn för sammansättning av flera gennivå och rött/grönt urval under(A)synligt ljus och (B) UV-ljus. Positiva kolonier är gröna och negativa kolonier är röda. Förhållandet mellan positiva kolonier totala kolonier är 1,83 ± 0,15%. Lyckad montering av flera TV-objekt från mellanvektorn och det grönvita urvalet(C)under synligt ljus och(D)UV-ljus. Positiva kolonier är vita. Förhållandet mellan positiva kolonier totalt kolonier är 93,77 ± 1,65%. Suboptimal montering av multigenplasmid under (E) synligt ljus och (F) UV-ljus. Antalet positiva kolonier är försumbart. Data kommer från tre biologiska replikat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 8: Representativa plattor av integrativa och replikiva plasmider i jäst. Replikiva multigenplasmider omvandlas till jäst med (A) BTS1-ERG20 fusion TU och (B) ERG20 TU. På varje tallrik har jäst på vänster sida plasmider som innehåller crtE TU, crtYB TU och crtI TU för produktion av β-karoten och jäst på höger sida har plasmider som innehåller crtE TU, crtYB (G247A)TU och crtI TU för produktion av lykopen. C)kvantifiering β karoten och lykopen från jästextrakt med fyra multigenplasmider med hjälp av en UV-vis-spektrometer. Maximal absorbans registrerades vid 450 nm och 470 nm för β-karoten respektive lykopen. Den absoluta kvantifieringen utfördes med hjälp av autentiska standarder(kompletterande figur S3). Fusion av BTS1-ERG20 leder till en produktion av ~35 gånger högre β-karoten och ~16,5 gånger högre lykopen jämfört med ENBART ERG20. Representativa plattor för störning av ADE2 locus genom integration av en multi-gen integrativ plasmid med en gRNA och ingen hjälpare DNA (D) och med gRNA och en multi-gen integrativ plasmid som hjälpare DNA (E). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande material. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MoClo-baserade kloningssatsen som utvecklats av Lee et al. ger en utmärkt resurs för snabb montering av en till fem transkriptionsenheter i en multigenplasmid antingen för replikering eller integration i jästgenomet. Användningen av detta kit eliminerar den tidskrävande kloningsflaskhalsen som ofta finns för att uttrycka flera gener i jäst.
Vi testade fem olika förhållanden för matsmältnings-/ligaturcyklerna av Golden Gate-kloning med T4 DNA-ligas. Vi fann att 30 cykler av matsmältningen vid 37 °C i 5 min och ligatur vid 16 °C i 5 min följt av ett slutligt matsmältningssteg vid 50 °C i 10 min och ett proteininaktiveringssteg vid 80 °C i 10 min resulterade i 99,5% kolonier som potentiellt var korrekta i en 4-delars montering(kompletterande figur S1 och tabell S3). Ligatur vid 16 °C säkerställer optimal ligasaktivitet och överhängsglödgning. Slutlig matsmältning vid 50 °C förhindrar smältprodukter från omorganion. Denna cykel följdes för alla monteringsreaktioner om inget annat anges.
Vi har också hittat några kritiska steg som behöver särskild uppmärksamhet för optimala resultat. Vi rekommenderar starkt att du monterar mellanliggande vektorer med sfGFP-avhopparen innan transkriptionsenheterna monteras. I teorin kan alla sju delarna klonas till E. coli-vektorn med mRFP1, följt av röd/ vit screening. Men i praktiken utvecklar mRFP1 färg mycket långsamt och det är utmanande att skilja mellan blekröda och blekgula E. coli-kolonier under synligt ljus. Eftersom sfGFP absorberas vidUV-området 52, med hjälp av en UV eller en blå ljustransilluminator underlättar screeningen för ljusgröna kolonier. Kloning av en mellanvektor möjliggör också mer enkel montering av de olika promotor-, CDS- och terminatorkombinationerna, vilket möjliggör en enklare kombinatorisk biblioteksskapande, eftersom en sammansättning med fyra delar vanligtvis resulterar i mer positiva kolonier än en sammansättning med fler delar. Kompletterande figur S2 visar en progressiv minskning av förhållandet mellan potentiellt korrekta kolonier från en 6-delars till en 8-delars montering.
Koncentrationerna av alla delar skall mätas noggrant för att säkerställa equimolarkoncentrationen i varje del. Att kvantifiera delar med hjälp av en UV-Vis-spektrometer är vanligtvis tillräckligt men känsligare metoder, såsom fluorescensbaserade analyser, kan ge bättre resultat. Underlåtenhet att exakt kvantifiera alla delar resulterar ofta i låg monteringseffektivitet. Man bör välja högeffektiva Esp3I respektive BsaI-HFv2. Vi har observerat att T4 fungerar bra för båda överhängen i satsen och anpassade överhäng är nödvändiga för att smälta två delar, vilket överensstämmer med litteratur36, även om det ursprungliga papperet rekommenderade T7 ligase6. Att öka antalet cykler kan öka antalet potentiellt korrekta kolonier i viss utsträckning. Till exempel är 25 cykler av matsmältning och ligatur tillräckligt för att montera tre till fyra delar men 30-35 cykler ger bättre resultat för fler delar.
MolClo-strategin är fördelaktig jämfört med alternativa flerdelad monteringsmetoder8,9,10,11,12 eftersom den möjliggör modulär och mycket mångsidig kloning. Den primära begränsningen är dock domesticeringssteget eftersom delar ibland har flera BsmBI-, BsaI- eller NotI-platser. Att mutera alla delar kan vara tidskrävande. I det här fallet kan man överväga att syntetisera CDS utan dessa begränsningsplatser. För promotors och terminatorer kan dock mutering av även en enda nukleotid ändra deras funktionalitet. Därför rekommenderas validering av aktiviteten hos dessa delar med hjälp av en reporteranalys39. En annan begränsning är att detta kit endast tillåter upp till fem transkriptionsenheter i en multigenplasmid. Om fler transkriptionsenheter önskas kan ytterligare kontakter konstrueras genom att välja en uppsättning mycket kompatibla överhäng36.
Satsen ger 27 promotors, sex terminatorer, sju jästvalsmarkörer och två jästursprung av replikeringar. Anpassade delar, till exempel promotors och terminatorer, antingen inbyggda eller syntetiska, kan klonas till ingångsvektorn enligt detta protokoll. Jästen MoClo kit har främst använts för att överuttrycka multigen metaboliska vägar för att producera värdefulla kemikalier i jäst. Detta protokoll kan också användas när olika omkopplare för biologiska kretsar önskas i jäst. Det finns också en enorm potential att tillämpa detta kit för undersökning av grundläggande biologiska frågor om proteinproteininteraktioner, proteinlokalisering och enzymaktiviteter. Sammantaget är detta protokoll extremt flexibelt och pålitligt och kan stödja all krävande kloning i jästbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Research Foundation för State University of New York (Award #: 71272) och IMPACT Award of University at Buffalo (Award #: 000077).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
References
- Endy, D.
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
- Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
- Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
- de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
- Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
- Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
- Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
- Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
- Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
- Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
- Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
- Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
- Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
- Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
- Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
- Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
- Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
- Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
- Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
- Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
- Engler, C., Sylvestre, M. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. 1116, Humana Press. Ch. 9 119-131 (2014).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, Pt 1 263-273 (1986).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
- Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
- Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
- Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
- Jones, E., et al. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast 181 (1982).
- Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
- Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).
