Anwendung von Maus parthenogenetischen Haploid embryonalen Stammzellen als Ersatz für Sperma

Zusammenfassung

Dieser Artikel zielt darauf ab, die Verwendung von parthenogenetischen haploiden embryonalen Stammzellen als Ersatz für Spermien für den Aufbau von halbgeklonten Embryonen zu demonstrieren.

Zusammenfassung

In Organismen mit sexueller Fortpflanzung sind Keimzellen die Quelle totipotenter Zellen, die sich zu neuen Individuen entwickeln. Bei Mäusen erzeugt die Befruchtung einer Eizelle durch ein Spermatozoon eine totipotente Zygote. Kürzlich haben mehrere Veröffentlichungen berichtet, dass haploide embryonale Stammzellen (haESCs) ein Ersatz für gametische Genome sein und zu Embryonen beitragen können, die sich zu Mäusen entwickeln. Hier stellen wir ein Protokoll zur Anwendung parthenogenetischer HaESCs als Ersatz für Spermien vor, um Embryonen durch intrazytoplasmatische Injektion in Eizellen zu konstruieren. Dieses Protokoll besteht aus Schritten zur Vorbereitung von haESCs als Spermienersatz, zur Injektion von haESC-Chromosomen in Eizellen und zur Kultur halbgeklonter Embryonen. Die Embryonen können nach dem Embryotransfer fruchtbare halbgeklonte Mäuse hervorbringen. Die Verwendung von haESCs als Spermienersatz erleichtert die Genombearbeitung in der Keimbahn, Studien zur embryonalen Entwicklung und die Untersuchung genomischer Prägung.

Einleitung

Bei Säugetieren sind Gameten die einzigen Zellen, die genetische Informationen an die nächste Generation übertragen. Die Fusion einer Eizelle und eines Spermatozoons bildet eine diploide Zygote, die sich zu einem erwachsenen Tier entwickelt. Mutationen in gametischen Genomen werden dabei von den Nachkommen vererbt und treiben die genetische Variation in Art¹voran. Die Einführung von Mutationen in der Keimbahn wurde angewendet, um genetisch veränderte Tiere für verschiedene biologische Studien zu produzieren, einschließlich der Charakterisierung der Genfunktion und der Krankheitsmodellierung. Sowohl Eizellen als auch Spermatozoen sind endlos differenzierte und hochspezialisierte Zellen, die ihre Proliferation eingestellt haben. Daher ist die direkte Modifikation von Gameten technisch schwierig, und es wurden spezielle Ansätze entwickelt. Genetische Veränderungen können durch Injektion genetisch veränderter ESCs in Blastozysten in die Mauskeimbahn eingeführt werden, wo sie sich in den sich entwickelnden Embryo integrieren und die Keimbahn besiedeln. Darüber hinaus hat sich die genetische Veränderung von Zygoten mit Genom-Editing-Ansätzen, einschließlich des CRISPR/Cas9-Systems, weit verbreitet².

Kürzlich wurde ein hervorragender Ansatz berichtet, der haESCs als Ersatz für ein gametisches Genom^3,4,5,6,7,8anwendet. HaESCs sind Stammzelllinien, die aus der inneren Zellmasse parthenogenetischer oder androgenetischer haploider Blastozysten abgeleitet sind und einen einzigen Satz chromosomen^4,7,9,10besitzen. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl parthenogenetische als auch androgenetische HäSchen zum Genom von halbgeklonten Mäusen nach intrazytoplasmatischer Injektion in Eizellen beitragen können. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen können die Genome von haESCs aufgrund ihrer Selbsterneuerungskapazität direkt in der Kultur verändert werden. Die Einführung genetischer Veränderungen in die Keimbahn durch den Ersatz von Spermien durch haESCs ist eine wichtige Methode für biologische Studien. Es sieht die Möglichkeit vor, das mütterliche oder väterliche Genom, das aus parthenogenetischen bzw. androgenetischen HaESCs abgeleitet ist, getrennt zu kulturieren und zu manipulieren. HaESCs können dann als gametischer Genomersatz verwendet werden, was besonders für Studien zu genomischen Prägungen, allelespezifischer Expression und elterlichen spezifischen Prozessen von Vorteil ist.

Bei Mäusen sind sowohl mütterliche als auch väterliche genomische Informationen für die normale Embryoentwicklung erforderlich¹¹. Daher konnten keine Vollzeitwelpen gewonnen werden, wenn wildtypparthenogenetische HaESCs (PhaESCs) injiziert wurden, um das Spermagenom^5,8zu ersetzen. Um den Entwicklungsblock zu überwinden, muss die genomische Prägung des mütterlichen Genoms von parthenogenetischen HaESCs zu einer väterlichen Konfiguration korrigiert werden. Dies kann durch Manipulation der differenziell methylierten Regionen (DR) erreicht werden. Bis heute wurden gezielte Löschungen der H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR und Rasgrf1-DMR untersucht, um mütterlich exprimierte Gene in phaESCs^3,5,8,12zu unterdrücken. Diese Studien zeigten, dass Deletionen sowohl der H19-DMR als auch der IG-DMRausreichen, um eine mütterliche in eine väterliche Abdruckkonfiguration umzuwandeln, die Spermienchromosomen ersetzen kann. Die intrazytoplasmatische Injektion von PhaESCs, die die beiden DMR-Deletionen in Eizellen tragen, ergab halbklonierte Welpen mit einer Häufigkeit zwischen 5,1% und 15,5% der übertragenen 2-Zellen-Embryonen.

Dieses Protokoll basiert auf der Anwendung von phaESCs mit Löschungen von H19-DMR und IG-DMR, die wir Double-Knockout-PhaESCs (DKO-phaESCs) bezeichnen. Wir geben detaillierte Anweisungen für die Modifikation der genomischen Prägung in phaESCs zur Etablierung von DKO-phaESC-Linien, zur Injektion von DKO-PhaESCs in Eizellen als Ersatz für ein Spermagenom, für die Kultur von halbgeklonten Embryonen in Blastozysten und für die Gewinnung von halbgeklonten Mäusen. Dieses Protokoll ist eine Referenz für Forscher, die eine präzise und direkte Manipulation des väterlichen Genoms und die Erzeugung von halbgeklonten Embryonen und Mäusen erfordern.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden unter der Lizenz ZH152/17 nach den Standards und Vorschriften der kantonalen Ethikkommission Zürich und der EPIC Tieranlage am Institut für Molekulare Gesundheitswissenschaften der ETH Zürich durchgeführt.

HINWEIS: Dieses Protokoll beginnt mit dem Löschen der H19- und IG-DMRs in phaESCs. Einzelheiten zur Festlegung von PhaESC-Zeilen finden Sie in den veröffentlichten Berichten^10,13. Eine Übersicht und ein Zeitrahmen dieses Protokolls (Schritte 1–14) finden Sie in Abbildung 1A; Medien, Lösungen und Puffer sind in Tabelle 1aufgeführt. Das Verfahren zur Festlegung von DKO-phaESC-Linien (Schritte 1–6) ist in Abbildung 1Bdargestellt, und die Strategie zur Konstruktion halbgeklonter Embryonen (Schritte 7–14) ist in Abbildung 1Cdargestellt.

1. Transfektion von Plasmiden zur Löschung von H19-DMR und IG-DMR in PhaESCs

1. Bereiten Sie CRISPR/Cas9-Plasmide für die Koexpression von Cas9-Nukleasen vor und führen Sie RNAs an, um die Löschung von H19-DMR und IG-DMRgezielt zu erreichen. Ligate vier Paare von Guide RNA Oligos (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R in Tabelle 2aufgeführt) in pX330 Plasmide.
   HINWEIS: Siehe das veröffentlichte Protokoll über das detaillierte Verfahren zur Herstellung dieser 4 CRISPR/Cas9-Plasmide¹⁴. Alternativ sind Plasmide, die für allgemeine Mausstämme verfügbar sind, auch über ein Repository zugänglich (Materialtabelle).
2. Die Oberfläche eines Brunnens einer 6-Well-Platte mit 1 ml 0,2% Gelatinelösung durch Inkubation bei 37 °C für 10 min beschichten.
3. Platte 2 × 10⁵ Wildtyp-PhaESCs auf dem Gelatine-beschichteten Brunnen in haESC-Medium ohne Antibiotika und inkubieren die Platte bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre} für 1 Tag.
   HINWEIS: Antibiotika werden aus dem Medium weggelassen, um die Effizienz der nachfolgenden Lipofektion zu erhöhen. Wir verwendeten Wildtype phaESCs in Durchgang 10. Wir empfehlen die Verwendung von Frühpassage-PhaESCs, aber eine Vielzahl von Durchgangsnummern wurden erfolgreich verwendet⁸. Die Korrelation zwischen Durchgangszahl und Effizienz der Gewinnung von halbgeklonten Embryonen und Mäusen ist derzeit nicht bekannt.
4. Transfekte PhaESCs im Brunnen einer 6-Well-Platte (ab Schritt 1.3) mit 6 Plasmiden gleichzeitig mit Lipofection-Reagenz: 50 ng PiggyBac-Plasmid mit CAG-EGFP-Transgen, 50 ng PiggyBac-Transposase-Plasmid und 600 ng jedes der 4 CRISPR/Cas9-Plasmide (ab Schritt 1.1). Siehe das Protokoll des Herstellers über das detaillierte Verfahren der Transfektion.
   HINWEIS: Zwei PiggyBac-Plasmide werden verwendet, um ein Transposon zur allgegenwärtigen Expression von verbessertem grünem Fluoreszenzprotein (EGFP) in das Genom von PhaESCs zu integrieren. Wenn keine GFP-Kennzeichnung der Zellen erforderlich ist, können diese beiden Plasmide durch ein CRISPR/Cas9-Plasmid zur vorübergehenden Expression von Fluoreszenzproteinen (z. B. pX458-Plasmid) anstelle eines der pX330-Plasmide ersetzt werden. Die transiente EGFP-Expression kann dann zum Sortieren transfizierter Zellen verwendet werden.
5. Zwei Tage nach der Transfektion, aspirieren Sie das Medium, und fügen Sie 800 L Trypsin.
6. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre} für 5 min. Fügen Sie dann 2 ml Waschpuffer hinzu, um das Trypsin zu löschen, und Pipette mehrmals, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
7. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Rohr.
8. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 160 x g für 5 min, und entfernen Sie den Überstand.
9. Setzen Sie das Zellpellet in 400 l haESC-Wartungspuffer auf, ergänzt um 15 g/ml Hoechst 33342.
   ANMERKUNG: Um die potentielle Toxizität von Hoechst 33342 zu reduzieren, wurden anstelle von 15 g/mL Hoechst 33342 und 50 m Verapamil 33342¹⁵verwendet.
10. Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre} für 15 min. Nach der Inkubation die Zellsuspension durch eine Zellsiebkappe in ein 5 ml-Rohr geben und das Rohr bei 4 °C halten, bis es im nächsten Schritt einsatzbereit ist (Abschnitt 2).

2. Einzelzellige Beschichtung transfizierter PhaESCs mit einem Durchflusszytometer

1. Einen Tag vor dem Sortieren der transfäfierten PhaESCs werden die embryonalen Fibroblasten (MEFs) der plattebestrahlten Maus auf gelatinebeschichteten 96-Well-Platten mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² in MEF-Medium. In der Regel sind 6 Platten vorbereitet, um eine phaESC Linie mit gezielten Löschungen zu etablieren. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre.}
   HINWEIS: Bestrahlte MEFs sind im Handel erhältlich. Wir verwenden MEFs aus E12.5-Embryonen von DR4-Mäusen. Obwohl haESCs auf gelatinebeschichteten Platten ohne MEFs wachsen können, empfehlen wir MEFs zur Erhöhung der Lebensfähigkeit sortierter einzelhäSs.-haESCs.
2. Am Tag der Sortierung das MEF-Medium aus den 96-Well-Platten ansaugen und 120 L frisches haESC-Medium pro Brunnen hinzufügen. Halten Sie die Platten bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre.}
3. Richten Sie einen Zellsortierer mit einer 100-m-Düse gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Zur Anregung von Hoechst 33342 bzw. EGFP-Fluoreszenz werden ein 355 nm UV-Laser und ein 488 nm blauer Laser eingesetzt.
   HINWEIS: Alternativ kann Hoechst 33342 durch Anregung mit 405 nm erkannt werden.
4. Sortieren Sie die transfizierten PhaESCs in der 5 ml-Röhre (ab Schritt 1.10) mit einem Tor zum Sammeln von haploiden Zellen in der G1/S-Phase, die EGFP-Expression zeigen. Legen Sie eine einzelne Zelle in jeden Brunnen der 96-Well-Platten ab Schritt 2.2 ab.
   HINWEIS: Der Nachweis der Hoechst 33342 Färbung unterscheidet in der Regel 3 Spitzen von Zellen mit einem 1n-, 2n- und 4n-DNA-Gehalt, die haploiden Zellen in der G1-Phase entsprechen, einer Mischung aus haploiden Zellen in G2/M-Phase und Diploidenzellen in der G1-Phase und Diploidenzellen in der G2/M-Phase. Haploide Zellen in der G1/S-Phase werden als Der Peak mit geringerer Intensität der Hoechst 33342 Fluoreszenz identifiziert. Ein repräsentatives Ergebnis und ein Sortiertor sind in Abbildung 2Adargestellt.
5. Nach der Beschichtung die 96-Well-Platten bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre} inkubieren.

3. Unterklonen transfizierter PhaESCs

1. Drei Tage nach der einzelligen Beschichtung können Kolonien in mehreren Brunnen der 96-Well-Platten unter dem Mikroskop beobachtet werden. Markieren Sie die Brunnen, in denen nur einzelne Kolonien wachsen.
   HINWEIS: Unserer Erfahrung nach wurden einzelne Kolonien in 20%–40% der Brunnen der 96-Well-Platten beobachtet.
2. Ersetzen Sie am 4. Tag nach der einzelligen Beschichtung die Hälfte des Mediums durch ein neues haESC-Medium in den Brunnen durch einzelne Kolonien.
3. Einen Tag vor der Passierung (an Tag 4 oder 5 nach einzelliger Beschichtung) bestrahlte die Platte MEFs auf gelatinebeschichteten 96-Well-Platten mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² in MEF-Medium. Halten Sie die Platten bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre.}
4. Wählen Sie nach 5 oder 6 Tagen einzellige Beschichtung die Brunnen der 96-Well-Platten aus, die einzelne Kolonien mit einem Durchmesser von mehr als 150 m enthalten.
   HINWEIS: Etwa 100 Brunnen werden vorzugsweise ausgewählt, um eine phaESC-Linie mit den gezielten DMR-Deletionen zu erstellen.
5. Saugen Sie das Medium in den ausgewählten Brunnen und fügen Sie 30 l Trypsin hinzu. Inkubieren Sie die 96-Well-Platten bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre} für 5 min. Fügen Sie dann jedem Brunnen 30 L Waschpuffer hinzu, um das Trypsin zu löschen.
6. Fügen Sie 140 L haESC-Medium in jeden Brunnen und Pipette mehrmals, um einzelne Zellen zu erhalten.
7. Aspirieren Sie das MEF-Medium aus den Brunnen der 96-Well-Platten, die in Schritt 3.3 vorbereitet werden.
8. Übertragen Sie die PhaESCs von Schritt 3.6 in einen frischen Brunnen der neuen 96-Well-Platte ab Schritt 3.7.
9. Inkubieren Sie die 96-Well-Platten, die PhaESC-Subklonen bei 37 °C in einer 5%-CO2-Atmosphäre enthalten.
10. Am nächsten Tag, aspirieren Sie alle Medium aus jedem Brunnen, und fügen Sie 120 L neue haESC Medium. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre.}
11. Einen Tag bevor die Zellen zum Passieren konfluent werden, die bestrahlten MEFs auf gelatinebeschichtete 24-Well-Platten mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² in MEF-Medium verschichten. Halten Sie die Platten bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre.}
12. Wenn phaESCs für die Passierung konfluent geworden sind, aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 30 l Trypsin hinzu. Die 96-Well-Platten bei 37 °C für 5 min inkubieren.
13. Fügen Sie 90 L Waschpuffer in jeden Brunnen, um das Trypsin zu löschen. Pipette mehrmals, um einzelne Zellen zu erhalten.
14. Das MEF-Medium aus den Brunnen der 24-Well-Platten ab Schritt 3.11 ansaugen und 600 l frisches haESC-Medium hinzufügen.
15. Übertragen Sie 60 l der Suspension von PhaESC-Subklonen aus jedem Brunnen in Schritt 3.13 in einen neuen Brunnen der 24-Well-Platten ab Schritt 3.14. Bewahren Sie die verbleibende Suspension jedes phaESC-Subklons für DNA-Extraktion und Genotypisierung in Schritt 4 auf.
16. Inkubieren Sie die 24-Well-Platten mit den PhaESC-Subklonen bei 37 °C in einer 5%-CO2-Atmosphäre.
17. Einen Tag bevor die Zellkulturen die Dichte für die Passierung erreichen, die bestrahlten MEFs auf gelatinebeschichtete 6-Well-Platten mit einer Dichte von 4 × 10⁴ Zellen/cm² in MEF-Medium verschichten. Halten Sie die Platten bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre.}
18. Wenn phaESCs konfluent genug für die Passierung werden, aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 250 l Trypsin hinzu. Die 24-Well-Platten bei 37 °C 5 min inkubieren.
    HINWEIS: Nach der Genotypisierung in Schritt 4.9 müssen nur phaESC-Zeilen mit Löschungen sowohl der H19-DMRals auch der IG-DMR durchgehen.
19. Fügen Sie 750 l Waschpuffer in jeden Brunnen, um das Trypsin zu löschen. Pipette mehrmals, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Rohr.
20. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 160 x g für 5 min, entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Zellpellet in 2 ml haESC-Medium wieder auf.
21. Aspirieren Sie das MEF-Medium aus den Brunnen der 6-Well-Platten ab Schritt 3.17. Übertragen Sie die phaESC Suspension von jedem Rohr von Schritt 3.20 in einen neuen Brunnen. Halten Sie die Platten bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre.}
22. Erweitern Sie die Zellklone, indem Sie die Schritte 3.17 bis 3.21 wiederholen und die Plattengröße und die Volumen von Trypsin, Waschpuffer und haESC-Medium erhöhen. Bereiten Sie einen T25-Kolben für jede unterklonte PHaESC-Linie von MEFs für Schritt 5 vor.
    HINWEIS: Wir empfehlen, ein Aliquot jeder subklonierten PhaESC-Linie in 300 L Gefriermedium einzufrieren und einen Kryostock in flüssiger Stickstoffspeicherung zu halten, bevor sie mit Schritt 5 fortfahren.

4. Erste Genotypisierung von subklonierten PhaESC-Linien mit MEFs

1. Um genomische DNA aus der verbleibenden Zellsuspension aus Schritt 3.15 zu extrahieren, fügen Sie jedem Brunnen der 96-Well-Platten 200 L Lysepuffer hinzu. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Rohr. Spülen Sie jeden Brunnen mit einem zusätzlichen 200 L Lysepuffer, um alle verbleibenden Zellen zurückzugewinnen und in der gleichen 1,5 ml-Röhre zu sammeln.
2. Inkubieren Sie das 1,5 ml Rohr bei 55 °C für 3 h mit Mischen.
3. Nach der Inkubation 460 l Isopropanol in jedes 1,5 ml-Rohr geben und sanft mischen, bis ein DNA-Ausscheider sichtbar wird.
4. Zentrifugieren Sie die Rohre bei ≥ 10.000 x g für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die DNA-Pellets mit 200 l 70% Ethanol.
5. Zentrifugieren Sie die Rohre bei ≥ 10.000 x g für 5 min und entfernen Sie den Überstand.
6. Trocknen Sie die Rohre in der Luft für 10 min und setzen Sie dann die DNA in 20 l Wasser wieder auf.
7. Führen Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit thermostabiler DNA-Polymerase nach dem Herstellerprotokoll durch.
   HINWEIS: Die Primerpaare für PCR sind in Tabelle 2 aufgeführt und werden wie folgt verwendet: H19-DMR-P1 und P3 (407 bp für gelöschte H19-DMR); H19-DMR-P2 und P3 (623 bp für Wildtyp H19-DMR); IG-DMR-P1 und P3 (319 bp für gelöschte IG-DMR); IG-DMR-P2 und P3 (492 bp für Wildtyp IG-DMR). Das Temperaturprofil der PCR für alle Primerpaare ist wie folgt: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. Die Länge der verstärkten DNA-Fragmente für die H19-DMR- und IG-DMR-Deletionen zeigt einige Variationen aufgrund der nicht-homologen Endverbindung im Zusammenhang mit CRISPR/Cas9-vermittelter Bearbeitung. PhaESCs wurden mit MEFs kultiviert, die Wildtyp H19-DMR und IG-DMR DNA enthalten. Daher sind Primerpaare von H19-DMR-P2/P3 und IG-DMR-P2/P3, die Wildtyp-DNA-Fragmente verstärken, nicht informativ. Diese Primerpaare sind jedoch als Steuerelemente enthalten und sollten in allen Reaktionen ein Band ergeben.
8. Analysieren Sie die PCR-Fragmente durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Siehe das veröffentlichte Protokoll über das detaillierte Verfahren der Elektrophorese¹⁶.
9. Identifizieren Sie Zelllinien mit Löschungen von H19-DMR und IG-DMR. Ein repräsentatives Bild der Elektrophorese ist in Abbildung 2Bdargestellt.
   HINWEIS: In unserem Fall wurden acht Zelllinien mit Löschungen von H19-DMR und IG-DMR unter 135 subklonierten PhaESC-Linien identifiziert.

5. Haploid-Zellreinigung von subklonierten PhaESC-Linien

1. Wenn die subklonierten PhaESC-Kulturen in den T25-Kolben ab Schritt 3.22 dicht genug für die Passierung werden, saugen Sie das Medium an und fügen Sie 1,5 ml Trypsin hinzu. Den Kolben bei 37 °C für 5 min inkubieren. Fügen Sie dann 4,5 ml Waschpuffer und Pipette mehrmals hinzu, um eine einzellige Suspension zu erhalten.
2. Übertragen Sie jede Zellsuspension in ein 15 ml-Rohr und zentrieren Sie das Rohr bei 160 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellpellets in 400 l haESC-Wartungspuffer, ergänzt mit 15 g/ml Hoechst 33342, wieder ab.
3. Die Zellsuspensionen 15 min bei 37 °C inkubieren. Übertragen Sie die Zellsuspensionen nach der Inkubation durch eine Zellsiebkappe in ein 5 ml-Rohr. Spülen Sie die Zellsiebkappe mit einem zusätzlichen HaESC-Wartungspuffer von 400 l und sammeln Sie die verbleibenden Zellen in demselben 5 ml-Rohr. Halten Sie das Rohr bei 4 °C, bis es zu sortieren ist.
4. Richten Sie ein Durchflusszytometer mit einer 100-m-Düse gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
   HINWEIS: Hoechst 33342 kann durch Anregung bei 405 nm erkannt werden. Hier kommt ein 355 nm UV-Laser zum Nachweis von Hoechst 33342 zum Einsatz.
5. Richten Sie die Zellsuspension (ab Schritt 5.3) und ein neues 15 ml-Rohr mit 2 ml haESC-Wartungspuffer ein, um sortierte Zellen im Durchflusszytometer zu sammeln.
6. Starten Sie die Analyse, und richten Sie das Sortiertor ein, um haploide Zellen in der G1/S-Phase zu sammeln. Siehe das Histogramm in Abbildung 2A zur Identifizierung der G1/S-Phase phaESC-Population.
   HINWEIS: Einige subklonierte PhaESC-Linien enthalten möglicherweise keine haploiden Zellen, da in Schritt 2 eine vollständige Diploidisierung oder eine fehlerhafte Beschichtung von diploiden Zellen besteht. Wenn haploide Zellen in der G1/S-Phase nicht beobachtet werden, fahren Sie mit einer anderen Probe ohne Sortierung fort. In unserem Fall enthielten 5 Zelllinien haploide Zellen und 3 Zelllinien enthielten nur diploide Zellen aus 8 subklonierten PhaESC-Linien.
7. Fügen Sie nach der Zellsortierung 5 ml Waschpuffer entlang der Wand des 15 ml Sammelrohrs hinzu. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 160 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand.
8. Wählen Sie eine Platte von geeigneter Größe für die Kultivierung in Abhängigkeit von der Anzahl der sortierten Zellen. Verwenden Sie einen einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte, eine 24-Well-Platte und eine 12-Well-Platte, um 1.000–40.000 Zellen, 40.000–200.000 Zellen und 200.000–400.000 Zellen zu beschaffen. Setzen Sie das Zellpellet in 120 l, 600 l bzw. 1,2 ml haESC-Medium wieder auf.
   HINWEIS: Plate die Zellen mit hoher Dichte, da niedrige Konfluzon kann Zelltod der Zellen nach der Sortierung verursachen. Ab diesem Zeitpunkt werden phaESCs auf gelatinebeschichteten Brunnen ohne MEFs kultiviert, um die Genotypisierung in Schritt 6 und die anschließende Anwendung der intrazytoplasmatischen Injektion ab Schritt 9 zu erleichtern.
9. Nach der Übertragung der Zellsuspension in einen gelatinebeschichteten Brunnen der entsprechenden Größe, inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre.}
10. Die Erweiterung der phaESC-Kulturen wird fortgesetzt, indem die Schritte 3.18 bis 3.21 mit zunehmenden Plattengrößen und zunehmenden Mengen an Trypsin, Waschpuffer und haESC-Medium wiederholt werden. Die Zellen werden auf gelatinebeschichteten Brunnen ohne MEFs kultiviert.
11. Für jede subklonierte phaESC-Linie eine Kultur in einem Brunnen einer 24-Well-Platte und einem Brunnen einer 6-Well-Platte für die Schritte 6 bzw. 9 vorbereiten.
    HINWEIS: Einige Zellen jeder subklonierten PhaESC-Leitung sollten in 300 L Gefriermedium als Kryostock in einem flüssigen Stickstoffspeicher eingefroren werden, bevor sie mit Schritt 9 fortfahren.

6. Zweite Genotypisierung von subklonierten PhaESC-Linien ohne MEFs

ANMERKUNG: Eine zweite Genotypisierungsrunde wird durchgeführt, um zu bestätigen, dass die subklonierten PhaESC-Linien sowohl die H19-als auch die IG-DMRslöschen und dass Wildtyp-Allele nach der Entfernung von MEFs fehlen.

1. Bestätigen Sie unter dem Mikroskop, dass die Kulturen in den Brunnen der 24-Well-Platten ab Schritt 5.11 frei von MEFs sind.
   HINWEIS: Wenn MEFs beobachtet werden, ist es notwendig, die Kulturen weiter zu verpassieren, bis DIE MEFs verschwunden sind, um zu vermeiden, dass die PCR mit Wildtyp-DNA aus MEFs kontaminiert wird.
2. Saugen Sie das Medium aus konfluenten Kulturen und fügen Sie 400 l Lysepuffer pro Bohrung der 24-Well-Platte hinzu. Nach mehreren Pipetten die Zellsuspension in ein 1,5 ml-Rohr übertragen.
3. Inkubieren Sie das 1,5 ml Rohr bei 55 °C für 3 h mit Mischen.
4. Nach der Inkubation 400 l Isopropanol in das 1,5 ml-Rohr geben und sanft mischen, bis ein DNA-Ausscheider sichtbar wird.
5. Zentrifugieren Sie das Rohr bei ≥ 10.000 x g für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 200 l 70% Ethanol.
6. Zentrifugieren Sie das Rohr bei ≥ 10.000 x g für 5 min und entfernen Sie den Überstand.
7. Trocknen Sie die Röhre in luftiger Luft für 10 min und setzen Sie dann die DNA in 50 l Wasser wieder auf.
8. Führen Sie die genotypisierende PCR nach Schritt 4.7 und Gelelektrophorese in Schritt 4.8 durch, um Zelllinien zu identifizieren, die sowohl die H19- als auch die IG-DMRs deletionen und frei von Wildtyp-Allelen sind.
   HINWEIS: Ein Bild einer typischen zweiten Genotypisierungsanalyse ist in Abbildung 2B als Referenz dargestellt. In unserem Fall waren alle 5 Zelllinien, die nach der haploiden Zellreinigung (Schritt 5) ausgewählt wurden, frei von Wildtyp-Allelen und besaßen nur die Löschallele der H19- und IG-DMRs.
9. Verwenden Sie die nach dieser zweiten Genotypisierung ausgewählten unterklonten PhaESC-Linien als DKO-phaESC-Linien.

7. Superovulation von Mäusen

1. Zur Herstellung von MII-Oozyten, initiieren Superovulation durch intraperitoneale Injektion von 5 IE der schwangeren Stute Serum Gonadotropin (PMSG) Lösung in jede B6D2F1 weibliche Maus (4-5 Wochen alt) 63-65 h vor der Oozyten-Sammlung.
   HINWEIS: Der B6D2F1-Mausstamm wird für dieses Protokoll empfohlen, da B6D2F1-Oozyten eine intrazytoplasmatische Injektion gut vertragen und nach dem Verfahren ein hohes Entwicklungspotenzial aufweisen¹⁷.
2. Achtundvierzig Stunden nach der PMSG-Injektion, intraperitoneal injizieren 5 IE der menschlichen Choriongonadotropin-Lösung in jede Maus.

8. Oozyten-Sammlung

1. Bereiten Sie eine 4-Well-Platte mit 700 l Hyaluronidase-Medium in einem Brunnen und 700 l M2-Medium in den verbleibenden 3 Brunnen vor. Zusätzlich bereiten Sie eine 6-cm-Schale mit 7 ml M2 Medium und eine Center-Well-Schale mit 900 l M16 Medium zu. Teller und Geschirr bei 37 °C in einer_{CO2-Atmosphäre} von 5% vorwärmen.
2. Am Tag der intrazytoplasmatischen Injektion die superovulierten Weibchen (ab Schritt 7.2) entweder durch Zervixdislokation oder CO2-Inhalation gegen 8 Uhr morgens einschläfern. Sezieren Sie die Eileiter mit Einer Pinzette und einer Schere. Legen Sie die Eileiter in die 6-cm-Schale mit M2 Medium.
3. Lassen Sie die Cumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) los, indem Sie die Ampulla der Eileiter mit einer 30 G Nadel zerreißen. COCs in vorgewärmte Hyaluronidase-Medium übertragen und bei 37 °C in einer 5%-CO2-Atmosphäre halten.
4. Nach 2-3 min, sammeln Sie haufenfreie Eizellen mit einer Mundpipette und waschen Sie die Eizellen 3 Mal, indem Sie sie auf frischem M2-Medium in den anderen 3 Brunnen der 4-Well-Platte übertragen.
5. Sammeln Sie Metaphase II (MII) Oozyten, die erste polare Körper besitzen, in einer Mittel-Well-Schale mit M16-Medium und halten Sie die Platte bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre} bis zur Verwendung für intrazytoplasmatische Injektion in Schritt 12.

9. Behandlung und Sammlung von DKO-PhaESCs

1. Bereiten Sie eine DKO-phaESC-Kultur in einem Brunnen einer 6-Well-Platte ohne MEFs bei 60–80% Konfluenz einen Tag vor der intrazytoplasmatischen Injektion (ab Schritt 5.11) vor.
2. Um einen Zellzyklusstillstand in der M-Phase zu induzieren, saugen Sie das Medium vollständig an und fügen Sie 2 ml haESC-Medium mit 0,05 mg/ml-Demekolumcin hinzu.
3. Nach 8 h Demekoluminbehandlung das Medium ansaugen und 800 l Trypsin hinzufügen.
4. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre} für 5 min, dann fügen Sie 2 ml Waschpuffer, um das Trypsin zu löschen, und Pipette mehrmals, um eine einzellige Suspension zu erhalten.
5. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Rohr. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 160 x g für 5 min und entfernen Sie den Überstand.
6. Setzen Sie das Zellpellet in 400 l haESC-Wartungspuffer mit 15 g/ml Hoechst 33342 wieder auf.
7. Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre} für 15 min. Nach der Inkubation die Zellsuspension durch eine Zellsiebkappe in ein 5 ml-Rohr geben und das Rohr bei 4 °C bis zur Zellsortierung in Schritt 10 aufbewahren.

10. Reinigung von M-Phase-verhafteten DKO-PhaESCs

1. Richten Sie ein Durchflusszytometer mit einer 100-m-Düse gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
   HINWEIS: Hoechst 33342 kann durch Anregung bei 405 nm erkannt werden. Hier kommt ein 355 nm UV-Laser zum Nachweis von Hoechst 33342 zum Einsatz.
2. Richten Sie die M-Phase-verhafteten DKO-PhaESCs ab Schritt 9.7 ein und starten Sie die Analyse. Wählen Sie ein geeignetes Sortiertor zum Sammeln der haploiden M-Phasenzellen (2n) aus der mit Demekkolin behandelten Probe aus.
   HINWEIS: Nach der Demekolumin-Behandlung werden 2 Zellpopulationen erwartet, die haploiden und diploiden M-Phasen-verhafteten Zellen entsprechen, wie in Abbildung 3Bdargestellt. Der Zellzyklusarrest nach der Demekolumin-Behandlung ist abgeschlossen, so dass kein haploider 1n DNA-Peak beobachtet wird. Dies ist wichtig, da die haploiden M-Phasen-Zellen und diploiden G1-Zellen den gleichen DNA-Gehalt (2n) aufweisen und überlappende Spitzen erzeugen würden.
3. Richten Sie ein 15 ml-Rohr mit 2 ml haESC-Wartungspuffer ein, um die sortierten Zellen im Durchflusszytometer zu sammeln. Starten Sie die Zellensortierung.
4. Fügen Sie nach der Zellensortierung 5 ml Waschpuffer entlang der Wand des Sammelrohrs hinzu. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 160 x g für 5 min und entfernen Sie den Überstand.
5. Setzen Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen von haESC-Wartungspuffer aus, um eine Endkonzentration von 5 x 10⁵ Zellen/ml zu erhalten.
6. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Rohr. Halten Sie die Röhre auf Eis, bis sie für die intrazytoplasmatische Injektion in Schritt 12 bereit ist.

11. Herstellung von Halte- und Mikroinjektionspipetten

HINWEIS: Für die Durchführung der intrazytoplasmatischen Injektion (Schritt 12) sind mehrere Halte- und Mikroinjektionspipetten erforderlich(Abbildung 4A). Diese Pipetten können auf maßgeschneiderte Anfrage von einem kommerziellen Lieferanten gekauft oder aus geeigneten Glaskapillaren mit einem Mikropipette-Puller und einer Mikroschmiede hergestellt werden.

1. Ziehen Sie Borosilikatglaskapillaren auf einem Mikropipette-Zieher. Um Borosilikatglaskapillaren ohne Filament (0,78 x 1,00 x 80 mm) zu ziehen, werden die folgenden Parameter für einen flammenden horizontalen Abzieher(Materialtabelle) als Referenz angegeben, unterscheiden sich jedoch für andere Instrumente und Glaskapillartypen: Heat 510 (Ramptest 480), Pull 0, Velocity 150, Time 175 und Pressure 200 für das Halten von Pipetten; Heat 510 (Ramptest 480), Pull 90, Velocity 140, Time 125 und Pressure 200 für Mikroinjektionspipetten.
   HINWEIS: Die optimalen Parameter müssen individuell definiert werden, da mehrere Faktoren wie Feuchtigkeit, das Modell eines Mikropipette-Ziehers und die Menge der Glaskapillaren die Form der Injektionspipetten beeinflussen können. Eine längliche Form mit einer allmählichen Verjüngung sollte angestrebt werden.
2. Vorbereitung von Haltepipetten
   1. Setzen Sie eine gezogene Kapillare in Schritt 11.1 zu einer Mikroschmiede vorbereitet. Legen Sie die Kapillare über die Glasperle auf das Filament und senken Sie die Kapillare, um beim Erhitzen des Filaments einen Kontakt mit der Glasperle herzustellen.
   2. Brechen Sie die Kapillare, indem Sie die Heizung ausschalten und sich von der Glasperle so lösen, dass ihr Außendurchmesser 60–100 m beträgt.
   3. Positionieren Sie die Kapillarspitze horizontal, um der Glasperle auf dem Filament zu zu begegnen.
   4. Erhitzen Sie das Filament, damit der Innendurchmesser der Kapillarspitze auf einen Durchmesser von 10 bis 20 m schmelzen kann.
   5. Bewegen Sie die Kapillare so, dass die Glasperle an einem Punkt von 1 mm von der Kapillarspitze ohne Kontakt positioniert wird. Erhitzen Sie das Filament, damit sich die Kapillare in einem 20°-Winkel biegen kann. Demontage der Kapillare, so bezeichnet als Haltepipette, von der Mikroschmiede.
      HINWEIS: Um die Größe der Kapillare zu messen, wird vorzugsweise ein Okular-Absehen in der Mikroschmiede installiert.
3. Herstellung von Mikroinjektionspipetten
   1. Setzen Sie eine gezogene Kapillare in Schritt 11.1 zu einer Mikroschmiede vorbereitet. Legen Sie die Kapillare über die Glasperle auf das Filament und senken Sie die Kapillare, um beim Erhitzen des Filaments einen Kontakt mit der Glasperle herzustellen.
   2. Brechen Sie die Kapillare, indem Sie die Heizung ausschalten und sich von der Glasperle in einer Position lösen, in der ihr Außendurchmesser 6 m beträgt.
   3. Bewegen Sie die Kapillare so, dass die Glasperle an einem Punkt von 1 mm von der Kapillarspitze ohne Kontakt positioniert wird. Erhitzen Sie das Filament, damit sich die Kapillare in einem 20°-Winkel nach oben biegen kann. Lösen Sie die Mikroinjektionspipette von der Mikroschmiede und lagern Sie sie in einer sicheren Box für die spätere Verwendung.
      ANMERKUNG: Die Mikroinjektionspipetten werden mit den folgenden Spezifikationen hergestellt: Außendurchmesser, 6 m; Innendurchmesser, 4,5–5 m; Biegewinkel, 20°. Die Definition des optimalen Designs der Mikroinjektionspipette ist wichtig für den Erfolg der intrazytoplasmatischen Injektion. Ein zu großer Innendurchmesser kann das Brechen der Plasmamembran der Spender-DKO-PhESCs verhindern (siehe Diskussionsteil). Wenn der Innendurchmesser zu schmal ist, kann er die sanfte Pipettierung der Spender-DKO-PhESCs behindern. Ein Biegewinkel < 30° ist vorzuziehen, da ein hoher Biegewinkel die Wirkung von Piezoimpulsen behindert.

12. Intrazytoplasmatische Injektion von DKO-PhaESCs

1. Vor der intrazytoplasmatischen Injektion (ab Schritt 12.2) eine Polyvinylpyrrolidonlösung (PVP) vorbereiten, indem Sie 5 ml M2-Medium in ein 50 ml-Rohr mit 0,6 g PVP geben und das Rohr bei 4 °C 2 Tage lang aufeiner Wippe aufhemmen. Nachdem sich der PVP vollständig aufgelöst hat, wird die Lösung steril gefiltert und bei 4 °C gelagert.
2. Am Tag der intrazytoplasmatischen Injektion eine Center-Well-Schale mit 900 L KSOM-Medium zubereiten und die Schale bei 37 °C in einer 5%-CO2-Atmosphäre vorwärmen.
3. Bereiten Sie eine Mikromanipulationsschale vor, indem Sie Tropfen von 5 l PVP-Lösung und 20 l M2-Medium auf einem Deckel einer 10-cm-Schale ausrichten, die auf dem Kopf platziert wird. Bedecken Sie die Tropfen mit Mineralöl, und legen Sie die Schale auf die Bühne des Injektionsmikroskops.
   HINWEIS: Die empfohlene Anordnung der Mikromanipulationsschale ist in Abbildung 4Bdargestellt.
4. Installieren Sie eine Haltepipette auf dem Mikromanipulator. Füllen Sie die Mikroinjektionspipette mit dem Fluorcarbonöl mit einer Mikroladerspitze und montieren Sie sie am Piezoantrieb.
5. Tauchen Sie die Mikroinjektionspipette in einen Tropfen mit PVP-Lösung und Pipette auf und ab mehrmals ein, um das Glas mit PVP zu beschichten und es weniger klebrig zu machen. Laden Sie ein kleines Volumen pVP-Lösung in die Mikroinjektionspipette, und bewegen Sie die Pipette zu einem Tropfen mit M2 Medium.
6. Tauchen Sie die Haltepipette in das M2-Medium ein und konzentrieren Sie sich auf die Pipette im unteren Rand des Tropfens.
7. Übertragen Sie ca. 2 l DKO-phaESC Suspension von Schritt 10,6 in den M2-Mitteltropfen.
8. Übertragen Sie 10 MII-Oozyten von Schritt 8.5 in den gleichen M2-Mitteltropfen mit einer Mundpipette.
9. Drehen Sie zur Injektion eine Oozyte im mittleren Tropfen M2, sodass der Perivitelline-Raum der Mikroinjektionspipette gegenübersteht und sich die MII-Platte nicht im Pfad der Mikroinjektionspipette befindet (Abbildung 4A). Halten Sie die Eizelle, indem Sie Unterdruck durch die Haltepipette anwenden.
   HINWEIS: Eine MII-Platte wird visuell als Eindringlichkeit des Ooplasmas identifiziert, das als "Hump" bezeichnet wird und sich oft neben dem ersten polaren Körper befindet. Die MII-Platte enthält die meiotische Spindel mit angeschlossenen Chromosomen. Das Berühren der Mikroinjektionspipette und der MII-Platte muss vermieden werden, da mechanische Beschädigungen der Spindel und Chromosomen die Embryoentwicklung stören können.
10. Laden Sie einen DKO-phaESC durch sanften Unterdruck in die Spitze der Mikroinjektionspipette. Zerrupzern Sie die Plasmamembran eines DKO-phaESC durch Pipettieren, um die Injektion eines intakten DKO-phaESC zu vermeiden (Abbildung 3C; siehe Diskussion).
    HINWEIS: Falls die Plasmamembran eines DKO-phaESC nicht durch Pipettieren gebrochen wird, entsorgen Sie den DKO-phaESC und laden Sie einen anderen DKO-phaESC.
11. Setzen Sie die Mikroinjektionspipette in Kontakt mit der Zona pellucida der Oozyte und wenden Sie eine kleine Menge Anpressen innerhalb der Mikroinjektionspipette an.
12. Piezoimpulse (Intensität, 20; Frequenz, 4), um die Zona zu durchbrechen, während die Spitze der Mikroinjektionspipette in Richtung des Perivitelline-Raums geschoben wird. Vergewissern Sie sich, dass sich die MII-Platte, die eine Spindel und Chromosomen enthält, nicht im Pfad der Mikroinjektionspipette befindet.
    HINWEIS: Passen Sie empirisch die Einstellung auf die niedrigsten Piezopulse für das Bohren durch die Zona an, um die Möglichkeit von Schäden am Oolemma zu minimieren.
13. Entsorgen Sie das Fragment der Zona pellucida aus der Mikroinjektionspipette und positionieren Sie den DKO-phaESC am Rand der Pipette.
14. Durchdringen Sie die Oozyte mit der Mikroinjektionspipette, so dass das Oolemma die gegenüberliegende Seite erreicht.
    HINWEIS: Berühren Sie die MII-Platte nicht, um Schäden an Spindel und Chromosomen zu vermeiden.
15. Wenden Sie einen Piezopuls (Intensität, 6; Frequenz, 1) an, um das Oolemma zu durchbohren. Stellen Sie sicher, dass sich das Oolemma entlang der Welle der Mikroinjektionspipette entspannt.
    HINWEIS: Empirisch definieren Sie die niedrigste Einstellung des Piezopulses für das Brechen des Oolemmas, um die Schäden an der Oozyte zu minimieren.
16. Injizieren Sie den DKO-PhaESC mit einem minimalen Mediumvolumen in das Ooplasma und ziehen Sie die Mikroinjektionspipette glatt aus der Oozyte.
17. Lassen Sie die injizierte Oozyte aus der Haltepipette und legen Sie sie zur späteren Sammlung auf die Seite des Mikrotropfens.
18. Wiederholen Sie den Injektionsvorgang von den Schritten 12.9 bis 12.17 für die anderen MII-Oozyten im m2-Mitteltropfen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Eizellen mehr als 20 min aus dem Inkubator fernzuhalten. Nach unserer Erfahrung kann eine Charge von 10 Eizellen bequem innerhalb von 15 min nach entsprechendem Training manipuliert werden.
19. Übertragen Sie die Charge der injizierten Eizellen aus dem M2-Medium Tropfen auf eine vorgewärmte Mittel-Well-Schale mit KSOM-Medium.
20. Halten Sie das Gericht für 1 h bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre.}
21. Wiederholen Sie die Eizellenmanipulation aus den Schritten 12.5 und 12.20 mit zusätzlichen Gruppen von MII-Oozyten, um genügend injizierte Eizellen zu erhalten.

13. Aktivierung konstruierter halbklonierter Embryonen

1. Bereiten Sie zwei Center-Well-Gerichte mit je 900 L KSOM-Medium und Aktivierungsmedium zu. Bereiten Sie eine 4-Well-Platte mit 700 l KSOM Medium in jedem Brunnen vor. Geschirr und Teller bei 37 °C in einer_{CO2-Atmosphäre} von 5% vorwärmen.
2. Nach 1 h im KSOM-Medium die injizierten Eizellen ab Schritt 12.21 in die vorgewärmte Mittelbrunnenschale mit Aktivierungsmedium übertragen.
3. Halten Sie das Gericht für 6 h bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre} für die Aktivierung.
4. Nach der Aktivierung beobachten Sie einige halbgeklonte Embryonen, die drei polare Körper bilden, die die ersten und die zweiten polaren Körper der Oozyte sind, und den pseudopolaren Körper aus dem DKO-phaESC (Abbildung 3E).
5. Waschen Sie die Embryonen 3 Mal, indem Sie sie in neue Brunnen mit KSOM Medium in einer 4-Well-Platte übertragen.
6. Übertragen Sie die Embryonen in die Mittel-Well-Schale mit KSOM Medium und halten Sie die Schale bei 37 °C in einer 5%_{CO2-Atmosphäre} für die weitere Entwicklung.

14. Entwicklung konstruierter halbklonierter Embryonen

1. Nach 1 Tag Kultur im KSOM-Medium ab Schritt 13.6 erreichen mehrere halbklonierte Embryonen das 2-Zell-Stadium (Abbildung 5A).
2. Zur weiteren Entwicklung von Präimplantationsembryonen in vitro die Kultivierung der halbgeklonten Embryonen im KSOM-Medium bei 37 °C in einer 5%-CO2-Atmosphäre fortsetzen. Übertragen Sie die halbgeklonten Embryonen an Tag 2 auf frisches KSOM-Medium. An Tag 4 erreichen mehrere Embryonen das Blastozystenstadium (Abbildung 5A).
3. Zur Ableitung von halbgeklonten Mäusen 2-Zell-Embryonen aus Schritt 14.1 in die Eileiter von pseudoschwangeren Empfängerinnen übertragen. Identifizieren Sie pseudoschwangere Weibchen, indem Sie sich einen Tag vor dem Embryotransfer mit vasectomisierten Männchen paaren und wählen Sie sie auf der Grundlage eines deutlich sichtbaren Steckers am Morgen des Tages für den Embryotransfer (0,5 Tage nach dem Koitum (dpc)). Um 19,5 dpc werden Vollzeitwelpen natürlich von Empfängerinnen geliefert (Abbildung 5B).

Ergebnisse

Ziel dieses Protokolls ist es, haESCs als Ersatz für Spermien anzuwenden, um halbgeklonte Embryonen und Mäuse zu erhalten. Zu diesem Zweck wurde eine DKO-phaESC-Leitung mit dem CAG-EGFP-Transgen erzeugt und zur intrazytoplasmatischen Injektion in MII-Oozyten verwendet. Um eine geeignete phaESC-Linie mit einer väterlichen Abdruckkonfiguration zu erhalten, haben wir Gentechnik mit Cas9-Nukleasen durchgeführt. Eine haploide ESC-Linie enthält haploide und diploide Zellen, die aufgrund einer inhärenten Tendenz von haploiden ESCs zur Diploidisierung¹⁰entstehen. Ein haploides Chromosom-Set ist eine Voraussetzung für einen erfolgreichen Ersatz des Spermagenoms. Die DNA-Gehaltsanalyse mittels Durchflusszytometrie zeigt die Verteilung von haploiden und diploiden Zellen in G0/G1-, S- und G2/M-Phasen (Abbildung 2A).

Zur Festlegung der DKO-phaESC-Linien wurden Wildtyp-PhaESC-Linien mit piggyBac-Transposonkonstrukten für stabile transgene EGFP-Expression und mit CRISPR/Cas9-Plasmiden zur Erlangung von Deletionen der H19-und IG-DMRs transfiziert. Um diploide ESCs auszuschließen und nur haploide ESCs zu isolieren, die EGFP exdrücken, wurde ein spezifisches Sortiergate definiert (Abbildung 2A). Einzelne haploide EGFP-positive Zellen wurden dann in einzelne Brunnen von 96-Well-Platten einbeschichtet, um Subklone zu erhalten. MEF-Feeder wurden verwendet, um die Beschichtungseffizienz und das Überleben der transfäften PhaESCs zu erhöhen. Nach der Erweiterung der Kulturen wurde eine erste Runde der Genotypisierung von PCR durchgeführt, um Unterklone zu identifizieren, die Löschungen beider DMRs tragen. Nachdem MEF-Feeder aus den Kulturen entfernt worden waren, wurde eine zweite Genotypisierung durchgeführt, um das Fehlen von Wildtyp-Allelen an den H19-und IG-DMRs zu bestätigen (Abbildung 2B). Von insgesamt 135 Subklonen erhielten wir 5 haploide DKO-phESC-Linien, die die gelöschten Allele trugen und frei von Wildtyp-Allelen sowohl der H19-DMRals auch der IG-DMR waren.

Ein CAG-EGFP-Transgen wurde in DKO-phaESCs eingeführt, um ihren Beitrag zu halbgeklonten Embryonen durch Visualisierung grüner Fluoreszenz unter dem Mikroskop zu untersuchen (Abbildung 3A). Für die intrazytoplasmatische Injektion wurden DKO-PhaESCs mit Demekolumcin behandelt, um sie in der M-Phase zu verhaften. So wurde der Zellzyklus von DKO-phaESCs mit dem von MII-Oozyten synchronisiert. Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigte 2 Populationen, die g2/M-Phase entsprechen, haploid (2n) und diploide Zellen (4n) nach der Behandlung mit Demekolumin (Abbildung 3B). Das Fehlen des 1n haploiden Peaks deutete darauf hin, dass der Zellzyklusstillstand weitgehend abgeschlossen war. M-Phase haploid ESCs wurden dann sortiert und in Eizellen injiziert. Dazu wurde ein einziger DKO-PhaESC in die Mikroinjektionspipette geladen und in das Zytoplasma einer MII-Oozyte injiziert (Abbildung 3C). Die Plasmamembran des DKO-phaESC wurde durch Pipettieren in die Spitze der Mikroinjektionspipette gebrochen.

Nach der Injektion wurde die EGFP-Expression selten in den konstruierten halbgeklonten Embryonen nachgewiesen, da sich das Zytoplasma von DKO-PhaESCs im großen Zytoplasma der Oozyte dispergiert hatte (Abbildung 3D). In seltenen Fällen konnte ein runder Punkt intensiver EGFP-Expression innerhalb des Ooplasmas beobachtet werden. Diese Beobachtung wurde wahrscheinlich durch die unbeabsichtigte Injektion intakter DKO-PhaESCs verursacht. Ein Versagen, die DKO-phaESC-Zellmembran zu brechen, ist wahrscheinlich nicht mit der weiteren Embryoentwicklung vereinbar und sollte vermieden werden. Eine Stunde nach der Injektion wurden Embryonen durch Behandlung mit Strontiumchlorid¹⁸aktiviert. Sechs Stunden nach Beginn der Aktivierung wurden bis zu 3 Polarkörper unter dem Mikroskop beobachtet (Abbildung 3E). Diese Polarkörper entsprechen dem ersten und zweiten Polarkörper der Oozyte und einem pseudopolaren Körper aus dem DKO-phaESC⁷. Darüber hinaus wurden zwei Vorkerne unter einem Differentialinterferenzkontrastmikroskop beobachtet, das dem pronuklearen Stadium von Zygoten nach normaler Befruchtung mit Spermien ähnelte.

Um entwicklungsfähig zu demonstrieren, wurden halbgeklonte Embryonen in das Blastozystenstadium kultiviert (Abbildung 5A). Darüber hinaus wurde eine Vollzeitmaus erhalten, nachdem halbklonierte 2-Zell-Stadium-Embryonen in die Eileiter eines Empfängerweibchens übertragen wurden (Abbildung 5B). Wie erwartet, war die Maus, die von einem halbgeklonten Embryo abgeleitet wurde, ein Weibchen, da weder Eizellen noch eizellenabgeleitete PhaESCs ein Y-Chromosom tragen. Die halb geklonte Maus war völlig normal und produzierte gesunde Nachkommen, wenn sie mit einem Wildtyp Schweizer Webster Männchen gepaart wurde. Bislang ist die halbgeklonte Maus seit über 600 Tagen ohne erkennbare gesundheitliche Probleme am Leben.

Abbildung 1: Überblick über die Anwendung von DKO-phaESCs als Spermienersatz. (A) Ein Zeitrahmen für die Verfahren des Protokolls. (B) Das Schema zeigt die Schritte zum Einrichten von DKO-phaESC-Linien (Schritte 1–6). (C) Das Schema zeigt die Schritte zum Konstruieren halbklonierter Embryonen durch intrazytoplasmatische Injektion eines DKO-PhaESC in eine MII-Oozyte (Schritte 7–14). Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; MEF = Maus embryonaler Fibroblast. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Einrichtung von DKO-phaESC-Zeilen durch CRISPR/Cas9-vermittelte Löschungen von H19- und IG-DMRs. (A) Flow-Zytometrie-Analyse von PhaESCs nach Transfektion mit PiggyBac-Plasmiden für stabile EGFP-Expression und mit 4 CRISPR/Cas9-Plasmiden. Nicht transfizierte PhaESCs werden als Kontrolle angezeigt. Das DNA-Profil (oben) zeigt die Zellzyklusverteilung von haploiden und diploiden Zellen. G1/S-Phase haploide Zellen, die EGFP exdrücken, werden durch das grüne Tor (unten, rechts) angezeigt. (B) Genotypisierung von PhaESC-Unterklonen, die auf MEFs (erste Genotypisierung) und nach Entfernung von MEFs (zweite Genotypisierung) angebaut wurden. Unterklonierte PhaESC-Zeilen 1, 2, 3 und 4 stellen Wildtypzellen dar, Zellen mit h19-DMR-Deletion, mit einer IG-DMR-Löschungund mit kombinierten H19-bzw. IG-DMR-Deletionen. Die DKO-phaESC-Zeilen 5–8 besitzen sowohl H19-DMR-als auch IG-DMR-Deletionen und sind frei von Wildtyp-Allelen. Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle; DMR = differenziell methylierter Bereich; MEF = Maus embryonaler Fibroblast; EGFP = verbessertes grünes fluoreszierendes Protein; WT = Wildtyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Injektion von mitotisch verhafteten DKO-PhaESCs in MII-Oozyten. (A) Morphologie einer DKO-phaESC-Kultur, die ein CAG-EGFP-Transgen und Streichungen der H19- und IG-DMRträgt; Skala bar = 50 m . (B) Repräsentative Durchflusszytometrieanalyse von DKO-phaESCs nach Festnahme mit Demecolin für 8 h. DKO-phaESCs ohne Demekoluminbehandlung werden als Kontrolle dargestellt. (C) Morphologie von DKO-phaESCs in der Mikroinjektionspipette. Es wird ein einziges intaktes DKO-phaESC vor (links) und nach (rechts) Das Brechen der Plasmamembran durch Pipettieren gezeigt; Skala bar = 20 m . (D) Konstruierte Embryonen bei 1 h nach Injektion von DKO-PhaESCs in MII-Oozyten. Ein zusammengeführtes Bild von EGFP-Fluoreszenz und hellem Feld wird gezeigt. Schwarze Pfeilspitzen zeigen runde Flecken intensiver EGFP-Expression nach Injektion intakter DKO-PhaESCs an, die vermieden werden sollten; Skala bar = 50 m. (E) Ein Differentialinterferenzkontrastbild von halbgeklonten Embryonen 6 h nach Beginn der Aktivierung mit Strontiumchlorid wird gezeigt. Weiße Pfeilspitzen zeigen Embryonen mit 3 polaren Körpern an, darunter einen pseudopolaren Körper aus dem injizierten DKO-phaESC; Skalenbalken = 50 m. Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle; EGFP = verbessertes grünes fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Schema des Aufbaus für die intrazytoplasmatische Injektion von DKO-PhaESCs in Eizellen. (A) Die Anordnung einer Injektionspipette, einer Haltepipette und einer Oozyte in der Injektionskammer wird angezeigt. α, Biegewinkel der Mikroinjektionspipette. (B) Layout der Tropfen in der Mikromanipulationsschale für intrazytoplasmatische Injektion. Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Entwicklung von halbgeklonten Embryonen. (A) Präimplantationsentwicklung von halbgeklonten Embryonen in vitro. Die EGFP-Expression wird zunächst an Tag 2 nach intrazytoplasmatischer Injektion bei vierzelligen Embryonen beobachtet. An Tag 4 kann eine intensive EGFP-Expression in Blastozysten beobachtet werden; Skala bar = 100 m . (B) Eine halbgeklonte Maus, die nach dem 2-Zell-Embryotransfer zu einem Empfängerweibchen erhalten wurde. Mit 74 dpp lieferte die halbgeklonte Maus (Pfeilspitze) ihre ersten Welpen (Sternchen) durch natürliche Geburt nach der Paarung mit einem Wildtyp Schweizer Webster Männchen. Halbgeklonte Embryonen und die in dieser Abbildung gezeigte halbgeklonte Maus sind identisch mit denen, die in Aizawa et al.³berichtet werden. Abkürzungen: EGFP = verbessertes grünes fluoreszierendes Protein; .dpp, Tage nach der Partum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Gelatinelösung
Komponente	Lagerkonzentration	Volumen / Gewicht	Endgültige Konzentration
Wasser	-	500 ml	-
Gelatine	-	1 g	0.2%
Haploid embryonale Stammzelle (HaESC) medium
Komponente	Lagerkonzentration	Volumen / Gewicht	Endgültige Konzentration
NDiff 227	-	10 ml	-
CHIR 99021	10 mM	3 l	18.00 UHR
PD 0325901	10 mM	1 L	1 M
Lif	1 x 106 I.E./ml	10 l	1.000 I.E./ml
Penicillin-Streptomycin	100x	100 l	1x
HaESC-Wartungspuffer
Komponente	Lagerkonzentration	Volumen / Gewicht	Endgültige Konzentration
HaESC Mittel	-	1 ml	-
HEPES-Lösung	1 M	20 l	20 mM
Waschpuffer
Komponente	Lagerkonzentration	Volumen / Gewicht	Endgültige Konzentration
DMEM / F-12	-	100 ml	-
BSA-Fraktion	7.5%	7,1 ml	0.5%
MEF mittel
Komponente	Lagerkonzentration	Volumen / Gewicht	Endgültige Konzentration
DMEM	-	500 ml	-
Fbs	-	56 ml	10%
β-Mercaptoethanol	14,3 mol/L	3,9 l	100 m
Penicillin-Streptomycin	100x	5,6 ml	1x
Lysis-Puffer
Komponente	Lagerkonzentration	Volumen / Gewicht	Endgültige Konzentration
Wasser	-	8,25 ml	-
Tris-HCl (pH 8.5)	1 M	1 ml	100 mM
Edta	0,5 M	100 l	5 mM
SDS-Lösung	10%	200 l	0.2%
Nacl	5 M	400 l	200 mM
Proteinase K	20 mg/ml	50 l	100 g/ml
Aktivierungsmedium
Komponente	Lagerkonzentration	Volumen / Gewicht	Endgültige Konzentration
KSOM	-	1 ml	-
Strontiumchlorid	1 M	5 l	5 mM
EGTA	0,5 M, pH 8,0	4 l	2 mM
PVP-Lösung
Komponente	Lagerkonzentration	Volumen / Gewicht	Endgültige Konzentration
M2 mittel	-	5 mL	-
Pvp	-	0,6 g	12%
PMSG-Lösung
Komponente	Lagerkonzentration	Volumen / Gewicht	Endgültige Konzentration
Pbs	-	450 l	-
PMSG	500 I.E./ml	50 l	50 I.E./ml
hCG-Lösung
Komponente	Lagerkonzentration	Volumen / Gewicht	Endgültige Konzentration
Pbs	-	450 l	-
Hcg	500 I.E./ml	50 l	50 I.E./ml
Hyaluronidase medium
Komponente	Lagerkonzentration	Volumen / Gewicht	Endgültige Konzentration
M2 mittel	-	380 l	-
Hyaluronidase	10 mg/ml	20 l	0,5 mg/ml
Abkürzungen: LIF = Leukämie-Hemmfaktor; MEF = Maus embryonaler Fibroblast;
FBS = fetales Rinderserum; DMEM = Dulbeccos modifizierter Adler Medium; BSA = Rinderserumalbumin;
EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; SDS = Natriumdodecylsulfat; EGTA = Ethylen-Bis(Oxyethylenenitrilo)Tetraessigsäure;
PBS = phosphatgepufferte Saline; PVP = Polyvinylpyrrolidon; hCG = humanes Choriongonadotropin;
PMSG = schwangere Stute Serum Gonadotropin.

Tabelle 1: Rezept von Medium, Puffer und Lösung.

Namen	Sequenz (5' bis 3')		Anwendung
H19-DMR-P1	GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG		Genotyping
H19-DMR-P2	AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC		Genotyping
H19-DMR-P3	TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT		Genotyping
IG-DMR-P1	TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG		Genotyping
IG-DMR-P2	CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA		Genotyping
IG-DMR-P3	ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG		Genotyping
H19-DMR-gRNA1-F	CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG		gRNA
H19-DMR-gRNA1-R	AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG		gRNA
H19-DMR-gRNA2-F	CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG		gRNA
H19-DMR-gRNA2-R	AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT		gRNA
IG-DMR-gRNA1-F	CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC		gRNA
IG-DMR-gRNA1-R	AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG		gRNA
IG-DMR-gRNA2-F	CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT		gRNA
IG-DMR-gRNA2-R	AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG		gRNA

Tabelle 2: Liste der Oligonukleotide.

Diskussion

Das Klonen von Säugetieren durch somatische Zellkernübertragung (SCNT) wurde in den 1990er Jahren^19,20,21entwickelt. Diese Entwicklungen folgten Klonstudien, die 30 Jahre zuvor bei Amphibien durchgeführt wurden²². Die erhebliche Verzögerung spiegelt die Schwierigkeit der Embryologie und der genomischen Prägung bei Säugetieren wider. Die Entwicklung von Säugetier SCNT ist die Grundlage für die Anwendung von haESC für die Substitution von Spermien, die in diesem Protokoll detailliert ist.

Die Zellzyklussynchronisierung ist ein wichtiger Erfolgsfaktor von SCNT²³. Dies gilt auch für die Injektion von haESC in diesem Protokoll. Die Einführung eines Spendergenoms in einen Empfänger erfordert, dass die Zellzyklusphasen angepasst werden, um Chromosomenbrüche oder Aneuploidien zu vermeiden, die die Embryoentwicklung abbrechen würden. Semi-Klonen hat die zusätzliche Komplexität, dass zwei Genome und ein Zytoplast kompatibel sein müssen. Ein früherer Bericht hat gezeigt, dass die Injektion von M-Phasen-verhafteten androgenetischen HaESCs bessere Entwicklungsraten von halbgeklonten Embryonen ergab als die Injektion von G1-Phasen-HaESCs in Eizellen⁷. Dieser Bericht schlägt M-Phase als geeigneten Synchronisationspunkt für das Halbklonen vor. Dementsprechend wurden PhaESCs in Metaphase mit Demekolumcin mit zitotisch verhaftet und in das Ooplasma von MII-Oozyten injiziert, die natürlicherweise in Metaphase II der Meiose verhaftet wurden. Wichtig ist, dass die M-Phasen-Absicherung in Maus-ESCs mit hoher Effizienz erreicht werden kann, was eine hervorragende Synchronisation zwischen Spender- und Empfängerzellzyklen ermöglicht.

Während der Mitose bricht die Kernmembran zusammen und eine Spindel bildet sich, an der sich die replizierten Chromosomen anheften. Nach Der Injektion von M-Phase DKO-phaESCs werden Schwesterchromatide in einen pseudopolaren Körper und die Zygote⁷ (Abbildung 3E) getrennt. Folglich trägt ein einziger Chromosomensatz aus einem DKO-phaESC zum halbgeklonten Embryo bei. Es ist wichtig, dass die Schwesterchromatiden der DKO-phaESC-Chromosomen nach der Injektion korrekt segregiert werden können. Die Plasmamembran eines intakten DKO-phaESC verhindert die Segregation in einen pseudopolaren Körper. Wir beobachteten in der Tat seltene Fälle, in denen die Plasmamembran von DKO-PhaESCs nicht gebrochen wurde und Embryonen intakte DKO-PhaESCs im Ooplasma nach der Injektion zeigten (Abbildung 3D). Daher ist darauf zu achten, dass die Plasmamembran von DKO-phaESCs durch Pipettieren entfernt wird. Während der Injektion ist es ebenso wichtig, die Störung der meiotischen Spindel der Oozyte zu vermeiden, die zu Chromosomensegregationsdefekten führen und auch Aneuploidie auslösen könnte.

Bei Säugetieren schränkt die genomische Prägung die Anwendung von PhaESCs als Spermienersatz ein. Parthenogenetische HaESCs besitzen eine mütterliche Konfiguration genomischer Abdrücke, während Spermien eine väterliche Konfiguration besitzen. Daher ist die Erzeugung von Vollzeitwelpen nach der Injektion von Wildtyp-PhaESCs als Spermienersatz nicht aufgetreten. Um diese Einschränkung zu überwinden, werden Löschungen der IG-und H19-DMRsin phaESCs entwickelt. Die Modifikation der eingeprägten Expression an den mütterlichen LocI Igf2-H19 und Gtl2-Dlk1 ist ausreichend, um die Konfiguration genomischer Abdrücke zu ändern, um die Erzeugung von halbgeklonten Mäusen mit einer Häufigkeit von über 5,1% auf der Grundlage übertragener 2-Zellen-Embryonen zu ermöglichen. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Ausrichtung auf zwei aufgedruckte Gene das Genom von PhaESCs in eine funktionelle väterliche Konfiguration verwandelt, die Spermien in Mäusen ersetzen kann. Dennoch ist für diese Strategie eine permanente genetische Veränderung der PhaESCs erforderlich. Als alternative Strategie kann androgenetischehaESC in Betracht gezogen werden. Androgenetische HaESCs stammen aus dem Spermagenom und besitzen väterliche Abdrücke. Es gab Berichte, dass Wildtyp androgenetische HaESCs als Spermienersatz dazu beitrugen, Vollzeitwelpen in einer Häufigkeit zwischen 1,3% und 1,9% der übertragenen Embryonen^4,7,24zu erzeugen. Vollzeit-Welpen wurden auch durch Injektion androgenetische haESCs mit Deletionen der IG- und H19-DMRs in einer Häufigkeit von 20,2% der übertragenen 2-Zell-Embryonen²⁴erhalten. Die erhöhte Effizienz des Semiklonens mit modifizierten androgenetischen HaESCs ist wahrscheinlich, weil Abdrücke in der Kultur instabil werden können. Aufdruckfehler werden durch die genetischen Löschungen kritischer DMRs korrigiert.

Angesichts der Schwierigkeit, genetische Veränderungen direkt in die Eizellen- oder Spermiengenome einzuführen, sind haESCs ein wertvolles Werkzeug, um die elterlichen Genome getrennt zu manipulieren. Die Verwendung von haESCs als Spermaersatz bietet einen bemerkenswerten Vorteil für die Genombearbeitung in der Mauskeimbahn. Eine aktuelle Studie hat CRISPR/Cas9-basierte Genombearbeitung mit der Anwendung von haESCs zur Charakterisierung von Prägungsregionen kombiniert, die für die embryonale Entwicklung entscheidend sind¹². Diese Studie analysierte die Rolle der Rasgrf1-DMR in Kombination mit den H19-und IG-DMRsbei der Entwicklung von bimaternalen Mäusen und die Funktion von 7 verschiedenen DMRs bei der Entwicklung von bipaternalen Mäusen. Die Methode zur Substitution von HaESCs für Spermien bildete die Grundlage für genetische Screening-Ansätze zur Identifizierung wichtiger Aminosäuren innerhalb des DND1-Proteins in der Entwicklung von Urkeimzellen und zur Identifizierung von Genen in der Knochenentwicklung^24,25,26. Studien über genomische Prägungen und genetisches Screening zur Identifizierung von Schlüsselfaktoren in der embryonalen Entwicklung sind beträchtliche Ansätze für die Anwendung von haESCs als gametische Genome.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mLTube	Eppendorf	0030 125.150	haESC-Kultur
15 ml Röhrchen	Greiner Bio-One	188271	haESC-Kultur
12-Well-Platte	Thermo Scientific	150628	haESC-Kultur
24-Well-Platte	Thermo Scientific	142475	haESC-Kultur
6-Well-Platte	Thermo Scientific	140675	haESC-Kultur
96-Well-Platte	Thermo Scientific	167008	haESC-Kultur
β-Mercaptoethanol	Merck	M6250	haESC-Kultur
BSA-Fraktion	Gibco	15260-037	haESC-Kultur
CHIR 99021	Axon	1386	haESC-Kultur
Demecolcin-Lösung	Merck	D1925	haESC-Kultur
DMEM	Gibco	41965-039	haESC-Kultur
DMEM / F-12	Gibco	11320-033	haESC-Kultur
DR4 Maus	The Jackson Laboratory	3208	haESC-Kultur
EDTA	Merck	E5134	haESC-Kultur
FBS	biowest	S1810-500	haESC-Kultur
Gefriermedium	amsbio	11897	haESC Kultur
	Gelatine Merck	G1890	haESC-Kultur
Hepes-Lösung	Gibco	15630-056	haESC-Kultur
Bestrahltes	MEF Gibco	A34966	haESC-Kultur
LIF (Leukämie-inhibitorischer Faktor)	hausgemacht)	haESC-Kultur
Lipofektionsreagenz	Invitrogen	11668019	haESC-Kultur
NDiff 227	Takara	Y40002	haESC-Kultur
PD 0325901	Axon	1408	haESC-Kultur
Pen Strep	Gibco	15140-122	haESC-Kultur
piggyBac Plasmid mit einem CAG-EGFP-Transgen	Addgene	#40973	haESC-Kultur
piggyBac Transposase Plasmid	System Biosciences	PB210PA-1	haESC
pX330 Plasmid	Addgene	#42230	haESC-Kultur
pX458 Plasmid	Addgene	#48138	haESC-Kultur
Trypsin	Gibco	15090-046	haESC-Kultur
DNA-Polymerase	Thermo Scientific	F549S	Genotypisierung
dNTP Mix	Thermo Scientific	R0192	Genotypisierung
Ethanol	Merck	100983	Genotypisierung
Salzsäure	Merck	100317	Genotypisierung
Isopropanol	Merck	109634	Genotypisierung Proteinase
K	Axon	A3830	Genotypisierung
SDS	Merck	71729	Genotypisierung
Natriumchlorid	Merck	106404	Genotypisierung
ThermoMixer	Epeendorf	5384000012	Genotypisierung
Tris	Merck	T1503	Genotypisierung
5 mL Röhrchen	Falcon	352063	Durchflusszytometrie
5 mL Röhrchen mit Zellsiebkappe	Falcon	352235	Durchflusszytometrie
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Durchflusszytometrie
MoFlo Astrios EQ	Beckman Coulter	B25982	Durchflusszytometrie
1 mL Spritze	Codan	62.1640	Superovulation
30-Gauge 1/2 Zoll Nadel	Merck	Z192362-100EA	Superovulation
B6D2F1 Maus	The Jackson Laboratory	100006	Superovulation
hCG	MSD Tiergesundheit	49451	Superovulation
PBS	Gibco	10010015	Superovulation
PMSG	Avivasysbio	OPPA1037 5000 I.E	Superovulation
10 cm Schale	Thermo Scientific	150350	Embryomanipulation
4-Well-Platte	Thermo Scientific	179830	Embryomanipulation
50 ml Röhrchen	Greiner Bio-One	227261	Embryomanipulation
6 cm Schale	Thermo Scientific	150288	Embryomanipulation
Schale in der Mitte	Corning	3260	Embryonenmanipulation
Digitale Wippe	Thermo Scientific	88880020	Embryomanipulation
EGTA	AppliChem	A0878	Embryonenmanipulation
Hyaluronidase	Merck	H4272	Embryonenmanipulation
KSOM	Merck	MR-020P-5F	Embryomanipulation
M16 mittel	Merck	M7292	Embryomanipulation
M2 medium	Merck	M7167	Embryomanipulation
Mineralöl	Merck	M8410	Embryomanipulation
Glaskapillare	Merck	P1049-1PAK	Embryomanipulation
Stereomikroskop	Nikon	SMZ745	Embryomanipulation
Strontiumchlorid	Merck	13909	Embryomanipulation
5ml Spritze	Codan	62.5607	Mikroinjektion
Borosilikatglas kappilär	Wissenschaftliches Produkt	GB100T-8P	Mikroinjektion
CellTram 4r Öl	Eppendorf	5196000030	Mikroinjektion
Fluorinert FC-770	Merck	F3556	Mikroinjektion
Haltepipette	BioMedical		Instruments-Mikroinjektion
Inverses Mikroskop	Nikon	Eclipse Ti-U	Mikroinjektion
Microforge	Narishige	MF-900	Mikroinjektion
Mikroinjektion Pipette	BioMedical	Instruments-Mikroinjektion
Microlaoder Spitzen	Eppendorf	5252 956.003	Mikroinjektion
Mikromanipulaor Arme	Narishige	NT-88-V3	Mikroinjektion
Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument	P-1000	Mikroinjektion
PiezoXpert	Eppendorf	5194000016	Mikroinjektion
PVP (Polyvinylpyrrolidin)	Merck	PVP360	Mikroinjektion
Spritzenfilter	SARSTEDT	83.1826.001	Mikroinjektion