Probenvorbereitung für metabolisches Profiling mittels MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung

Metaboliten, die Zwischen- oder Endprodukte des Stoffwechsels, einschließlich Nukleotide, Aminosäuren oder organische Säuren, Lipide, sind Schlüsselkomponenten für biologische Funktionen und Prozesse. Die Metabolomik, die Untersuchung von Metaboliten, ermöglicht die Erforschung ihrer biochemischen Wechselwirkungen und das Verständnis ihrer Rolle im Kontext der Grundlagen-, translationalen und klinischen Forschung. Metaboliten sind stark mit den Phänotypen von Organismen assoziiert und geben Aufschluss über biochemische Aktivitäten, die während des Zellstoffwechsels auftreten¹. Daher hat sich die Metabolomik neben der Genomik und Proteomik zu einem wichtigen Werkzeug zum Verständnis physiologischer und pathologischer Zustände entwickelt. Zum Beispiel wird die Metabolomik verwendet, um die Mechanismen hinter bestehenden Medikamenten sowie deren Toleranz zu klären. In der Arzneimittelentwicklung ist der xenobiotische Stoffwechsel nützlich, um die Aktivität oder Toxizität von Metaboliten über Spezies hinweg zu beurteilen, was später zur Unterstützung der personalisierten Medizin^{führt 2}. Trotz der breiten Anwendung der Metabolomik kann die Bildgebung von Metaboliten aufgrund der chemischen Reaktivität, der strukturellen Heterogenität und des breiten Konzentrationsbereichs der Metaboliten eine Herausforderung darstellen³. Die Konzentrationen labiler Metaboliten, einschließlich hochenergetischer Verbindungen, Glukose, Laktat, Glykolytikum, Pentose-Shunt-Signalweg und TCA-Zyklus-Zwischenprodukte, Phospholipide, Neurotransmitter, Signalverbindungen, können sich jedoch innerhalb von Sekunden ändern und über Minuten fortschreiten, wenn Gewebeenzyme während der Gewebeentnahme aktiv sind, wie z. B. postmortale Ischämie bei der Gehirnernte^4,5,6 . Um eine genaue Metabolomik-Datenerfassung zu gewährleisten, ist eine angemessene und sorgfältige Probenvorbereitung entscheidend^7,8. Zu den derzeit etablierten Plattformen für die Messung von Metaboliten gehören NMR, Enzymassays und Massenspektrometrie (einschließlich Flüssigkeits- und Gaschromatographie), von denen die letzte weiter unten diskutiert wird.

MALDI-MSI ist eine hochmoderne Technik, die die Analyse komplexer Proben durch den Nachweis einzelner molekularer Spezies ermöglicht. MALDI MSI bietet den Vorteil, verschiedene molekulare Verbindungen in biologischen Proben schnell und reproduzierbar messen zu können. Die massenspektrometrische Bildgebung ermöglicht außerdem die Erstellung von Bildern, die die Gewebebiologie auf der Grundlage ihrer zusammengesetzten Metaboliten darstellen, und zwar unter Beibehaltung der räumlichen Verteilung der Metaboliten in der Probe⁹. Die Fähigkeit von MALDI, Analyten in einer Probe ohne die Verwendung von Antikörpermarkierung, strukturellen Modifikationen oder anderen spezialisierten Reagenzien, wie sie bei der Immunfärbung verwendet werden, nachzuweisen, in Verbindung mit seiner Fähigkeit, Hunderte von Molekülen innerhalb eines einzigen Experiments zu überwachen, sind nur einige der Vorteile, die ms imaging beim metabolischen Profiling gewährt^{10. ( 11}) DER PRÄSIDENT. - Nach der 11 Neben häufig verwendeten Matrixen wie 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) und 9-Aminoacridin (9-AA) hat die kürzlich entdeckte neuartige Matrix N-(1-Naphthyl) Ethylendiamindihydrochlorid (NEDC), die sich gut für Analysen verschiedener niedermolekularer Metaboliten eignet, die Anwendung von MALDI MSI im metabolischen Profiling weiter verbessert^12.

Trotz der breiten Anwendung von MALDI MSI verhindern die hohen Kosten des Instruments und die Komplexität des experimentellen Verfahrens seine breitere Implementierung in einzelnen Forschungslabors. Daher werden die meisten MALDI MSI-Studien durch gemeinsame Kerneinrichtungen unterstützt. Die Probenvorbereitung, einschließlich Objektträgervorbereitung und Matrixbeschichtung, ist der kritischste Schritt in MALDI MSI. Die Objektträgervorbereitung wird jedoch normalerweise im Labor eines einzelnen Forschers durchgeführt, was zu möglichen Variationen bei der späteren MALDI-MSI-Erfassung führt. Hier wollen wir ein detailliertes Protokoll für die Probenvorbereitung biologischer Proben bereitstellen, bevor wir mit MALDI MSI-Messungen fortfahren, und ein metabolomisches Profiling des Entwicklungsgehirns der Maus als Beispiel verwenden.

Das Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Advanced Science Research Center (ASRC) der City University of New York (CUNY).

1. Ernte das Gewebe

1. Bereiten Sie das Aluminiumboot vor. Bereiten Sie ein Rechteck Aluminium 10cm x 20 cm vor, falten Sie es in der Mitte, um 10 cm Doppelschicht quadratisch zu machen. Beschriften Sie die Probeninformationen auf einer Seite und falten Sie die andere Seite, um ein Boot mit einer Unterseite von etwa 4 cm x 4 cm zu bilden.
2. Das Boot auf dem flüssigen Stickstoff (LN₂₎in einer Styroporbox vorkühlen.
   HINWEIS: Wenn das Boot zu klein ist, kann die Probe aus dem Boot fallen und durch direkten Kontakt mit LN₂übergefroren werden, was zu einer Fragmentierung während der Kryosektion führen kann.
3. Euthanisieren Sie das Tier durch zervikale Dislokation nach institutionellen IACUC-Richtlinien, sezieren Sie sofort das Gewebe von Interesse.
   1. Halten Sie das Intervall zwischen Tieranästhesie und Schnappgefrieren so kurz wie möglich, um die Veränderung der Metaboliten während der Gewebeentnahme, insbesondere der labialen Metaboliten im Gehirn aufgrund einer postmortalen Ischämie, zu minimieren.
      HINWEIS: Die Durchblutung des Tieres mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) erhöht die Dauer der Ischämie, verändert die Konzentrationen labiler Metaboliten weiter und übertreibt die künstlichen Ergebnisse. Daher wird das Perfusionieren oder Waschen des Gewebes mit PBS nicht empfohlen, es sei denn, die Kontamination von Blut oder Körperflüssigkeit ist von mehr Betroffener als die Verschlechterung der Metaboliten oder das Auswaschen für das individuelle Projekt.
4. Legen Sie das Gewebe sofort in das Aluminiumboot, das auf flüssigem Stickstoff schwimmt, schließen Sie den Deckel der Styroporbox und frieren Sie je nach Größe des Gewebes 2-10 Minuten ein: 2 min, 5 min, 7 min für den postnatalen Tag 1 (P1), P21, P60 Mausgehirn bzw. 10 min für P60 Rattengehirn.
   HINWEIS: Frieren Sie das Gewebe nicht für längere Zeit ein (z. B. 5 Minuten für das P1-Mausgehirn), da das überfrorene Gewebe während der Kryosektion zu einer Gewebefragmentierung führen kann.
5. Entfernen Sie das Boot mit einer Zette, falten Sie die Folie, um das Gewebe einzuwickeln, transportieren Sie es auf Trockeneis und lagern Sie es bei -80 °C für den späteren Gebrauch. Wenn eine sofortige Schnittung folgt, tragen Sie die Proben auf Trockeneis zum Kryostaten.
   HINWEIS: Um die Metaboliten besser zu erhalten, wird es bevorzugt, die Probe in intaktem Gewebe zu lagern und direkt vor der MALDI-Bildgebung zu abschnitten. Das Gewebe kann bei -80 °C bis zu 24 Monate gelagert werden.

2. Kryosektion des Gewebes

HINWEIS: Tragen Sie beim Umgang mit den Indium tinoxid (ITO)-Objektträgern jederzeit Handschuhe. Vermeiden Sie direktes Atmen auf dem Objektträger oder tragen Sie Masken (optional), um die Kontamination des menschlichen Speichels auf dem Gewebeabschnitt zu verhindern.

1. Bevor Sie das Gewebe teilen, sammeln Sie die gewünschte Anzahl von MALDI-kompatiblen ITO-beschichteten Glasobjektträgern.
2. Testen Sie die Leitfähigkeit des Objektträgers mit einem voltmeter, das auf Widerstand eingestellt ist. Beschriften Sie die Seite, auf der eine Widerstandsmessung gelesen wird: Dies ist die Seite, an der die Gewebeabschnitte haften. Legen Sie den Dia immer auf ein sauberes Papiertuch, um eine Kontamination zu vermeiden.
3. Kühlen Sie die Dias in einem auf -20 °C eingestellten Kryostaten vor.
4. Wenn Gewebeproben aus den -80 °C entfernt wurden, lassen Sie das Gewebe je nach Größe des Gewebes für ca. 45-60 min in der Kryostatkammer ausgleichen. Wenn Proben aus Trockeneis entfernt werden, gleichen Sie sie für ca. 30 Minuten aus.
5. Reinigen Sie den Kryostaten gründlich mit 70% Ethanol. Kühlen Sie alle notwendigen Werkzeuge einschließlich dünnspitzigem Künstlerpinsel und Pinzette in der Kryostatkammer vor.
6. Stellen Sie die Temperatur der Kryostatkammer und des Probenkopfes entsprechend der Art des Gewebes ein: -14 °C für Leber, -20 °C für Muskeln und -25 °C für Haut⁹.
7. Montieren Sie das Gewebe mit Kryogewebe einbettender Verbindung OCT am Futter, um OCT aus dem interessierenden Bereich zu vermeiden.
8. Legen Sie eine saubere Klinge in die Bühne und verriegeln Sie. Stellen Sie die Position der Bühne und den Winkel der Probe ein, um den gewünschten Schnittwinkel zu erreichen.
   HINWEIS: Wenn verschiedene Arten / Genotypen von Gewebe geschnitten werden sollen, stellen Sie sicher, dass Sie entweder die Probe neu positionieren, so dass ein sauberer Teil der Klinge verwendet wird, oder vor dem Schneiden der nächsten Probe zu einer neuen Klinge wechseln, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
9. Schneiden Sie weiter, bis die interessierende Region (z. B. Corpus callosum im Gehirn) gefunden ist. Achten Sie darauf, die Bühne sauber zu halten, indem Sie zusätzliche Stücke mit einem Künstlerpinsel abbürsten, der im Kryostaten ausgeglichen wurde.
10. Sobald der gewünschte Bereich aufgedeckt ist, schneiden Sie kleinere Abschnitte von 10-12 μm Dicke. Wenn der Abschnitt dazu neigt, leicht zu flocken oder auseinanderzufallen, erhöhen Sie die Temperatur des Kryostaten und bleiben Sie im Bereich von -22 ° C bis -11 ° C. Wir haben festgestellt, dass die optimale Schnitttemperatur für Hirngewebe -15 °C bis - 18 °C beträgt.
11. Sobald ein guter Abschnitt geschnitten wurde, kleben Sie ihn auf den ITO-Objektträger (in der Kryostatkammer arbeiten).
12. Übertragen Sie einen Abschnitt des Gewebes mit der Spitze des Künstlerpinsels auf ITO-Dias.
13. Erwärmen Sie den Abschnitt mit den Fingern, indem Sie einen Finger unter den Schlitten legen, um den Abschnitt aufzuwärmen, um eine sichere Montage zu gewährleisten. Der Gewebeabschnitt wird zuerst in 5-10 s transparent und dann in etwa 30-60 s undurchsichtig.
14. Legen Sie den Schieber vorsichtig im Kryostaten beiseite.
15. Wiederholen Sie die Schritte für andere Gewebeproben und stellen Sie sicher, dass jeder Abschnitt des Gewebes gleichmäßig auf dem Objektträger platziert und so ausgerichtet wie möglich ausgerichtet ist.
16. Da das MALDI-Target bis zu zwei Objektträger aufnehmen kann, platzieren Sie die Abschnitte aus mehreren Proben derselben Kohorte auf einem einzigen Objektträger oder auf zwei Objektträgern, um sicherzustellen, dass sie gleichzeitig analysiert werden können.
17. Wenn Sie fertig sind, legen Sie ITO-Dias in eine Vakuumbox und geben Sie sie mit Trockenmittel in einen Trockenmittel. Vakuumtrocknen Sie den Schlitten für 45-60 min.
    HINWEIS: Wenn im Labor kein Vakuum-Aussauger verfügbar ist, halten Sie die Objektträger ständig unter -20 °C, um eine Verschlechterung der Metaboliten zu vermeiden.
18. Lagerung und Versand von Objektträgern: Sofern die Probe nicht von den MALDI-Bildgebungskerneinrichtungen vorbereitet wird, um direkt mit der MALDI-Bildgebung fortzufahren, lagern Sie die Objektträger bei -80 ° C oder versenden Sie sie an Kerneinrichtungen oder andere MALDI-Forschungslabors auf Trockeneis.
19. Um die Proben bestmöglich zu konservieren, legen Sie die Dias in den Diatransporter, füllen Sie ihn mit Stickstoff (optional), versiegeln Sie ihn mit Parafilm, legen Sie ihn in einen Reißverschlussbeutel, der dann in einen anderen Reißverschlussbeutel mit Trockenmittel gelegt wird. Beschriften Sie den äußeren Reißverschlussbeutel.
20. Lagerung bei -80 °C (bis zu 6 Monate) oder Versand mit ausreichend Trockeneis.

3. Matrixvorbereitung

1. Bereiten Sie die Matrix vor.
   HINWEIS: Alle Reagenzien müssen HPLC-Grad haben.
   1. NEDC in einer Konzentration von 10 mg/ml zubereiten. 10 ml Matrix in einem Lösungsmittel aus 70% Methanol gelöst (100 mg NEDC, 7 ml Methanol, 3 ml H2O) werden₁₀ml Methanol vorbereitet.
   2. Bereiten Sie zusätzlich eine zusätzliche 10 ml 70% ige Methanol: Wasserlösung vor, um das Sprühsystem vor dem Einfüllen der Matrix zu spülen.
2. Sobald die Objektträger in Schritt 2.17 dehydriert sind, platzieren Sie "X" -Markierungen auf den leeren Raum des Glasobjektträgers außerhalb der Gewebeabschnitte mit einem fetten Punkt Silbermarker und legen Sie dann ein zweites "x" mit einem feinen Punkt schwarzen Marker auf das silberne "X". Das schwarze "X" mit einem scharfen Kontrast aus dem silbernen Hintergrund (das fette silberne "X") wird später als treuhänderischer Marker für die spätere Massenspektrenerfassung im MALDI-Instrument dienen.
3. Laden Sie den Schlitten in das MALDI-Gleitmetallziel. Verwenden Sie eine Kunststoffabdeckung und zeichnen / umreißen Sie, wo sich die Proben auf der Kunststoffabdeckung befinden. Verwerfen.
4. Scannen Sie das Bild des Dias zusammen mit dem MALDI-Target mit einem Flachbettscanner. Die Schrauben auf der Oberfläche des Ziels dienen als Abstandhalter, um die Beschädigung oder Kontamination des Gewebeabschnitts durch den Scanner zu verhindern. Zeigen Sie eine Vorschau des ausgewählten Folienbereichs in 16-Bit-Graustufen und 2400 dpi an und scannen Sie ihn. Speichern Sie das Bild für die spätere Verwendung in MALDI MSI.

4. Matrixabscheidung

HINWEIS: Es gibt mehrere Methoden, um eine gleichmäßige Matrixschicht in feiner Kristallgröße auf den MALDI-Dia aufzutragen, einschließlich Sublimation, Tröpfchen-Inkjet-Druck, automatisches Matrixsprühgerät und manuelles Spray mit Künstler-Airbush⁹. Wir werden in diesem Protokoll ein automatisches Matrix-Sprayer als Beispiel für seine hohe Reproduzierbarkeit verwenden.

1. Start: Schalten Sie die Matrix-Sprüheinheit ein, stellen Sie sicher, dass das Ventil bei LOAD positioniert ist, und starten Sie die Sprühsoftware. Überprüfen Sie, ob der Abluftventilator gut funktioniert. Starten Sie die Lösungsmittelpumpe nicht, wenn die aktive Entlüftung nicht ordnungsgemäß funktioniert.
2. Bestätigen Sie auf der Registerkarte Comms, dass alles kommuniziert, und starten Sie dann die Lösungsmittelpumpe bei 0,1 ml/min mit einem Gegendruck von ~500 psi (oder 3,4 MPa).
3. Starten Sie den Druckluftstrom zum Matrixsprühgerät, indem Sie den Stickstofftank auf 30 psi einstellen. Stellen Sie dann den Druckregler an der Vorderseite des Sprühgeräts auf 10 psi ein und stellen Sie die Temperatur der Sprühdüse wie gewünscht ein.
   HINWEIS: Wenn der Luftdruck im Gebet niedriger als 5 psi ist, kann sich die Sprühdüse zum Schutz nicht erwärmen.
4. Wenn sich das Ventil noch in der LOAD-Position befindet, verwenden Sie eine Spritze, um den Kreislauf mit 7 ml 70% Methanol zu spülen, und füllen Sie dann den Kreislauf mit 6 ml Matrix.
5. Legen Sie die Gewebeschieber in die Halter im Sprühgerät und klebten Sie beide Enden ab, um Bewegungen zu verhindern und eine matrixfreie Kante zu erhalten, um die Kontamination der Metallklemme auf dem MALDI-Target durch die Matrix zu vermeiden.
   HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, zuerst Matrixspray auf einem blanken Objektträger zu testen, bevor Sie mit wertvollen Probenobjektträgern fortfahren.
6. Überprüfen Sie, ob die Durchflussrate und die Temperatur stabil sind, um mit dem Sprühen zu beginnen.
7. Wählen Sie die gewünschte Methode vorgetestet mit leerem Glasträger.
8. Drücken Sie Start. Dadurch wird die Düsentemperatur eingestellt und der Pumpendurchfluss an die gewählte Methode angepasst. Schalten Sie das Ventil von Last in Sprühposition und bestätigen Sie dann, indem Sie auf Weiterklicken.
9. Lassen Sie das System laufen, was je nach Methode 5-20 Minuten pro Schlitten dauert. Schalten Sie das Ventil von Spray in Load Position und bestätigen Sie dann, indem Sie auf Weiter klicken, wenn Sie fertig sind.
10. Entfernen Sie die Objektträger aus dem Sprühgerät, untersuchen Sie das Muster der Matrixbeschichtung unter dem Mikroskop, um eine gleichmäßige Schicht aus feinem Matrixkristall zu gewährleisten.
11. Nach der Matrixabscheidung legen Sie den/die Schlitten zur sofortigen Verwendung in den MALDI-Metallhalter. Wenn nur ein Probenobjektträger vorhanden ist, fügen Sie einen weiteren leeren Objektträger hinzu, um die beiden Felder des MALDI-Halters zu füllen.
12. Reinigen Sie das System sofort nach dem Gebrauch gemäß den Anweisungen des Herstellers, um das Verstopfen der Sprühdüse zu verhindern.
13. Nachdem der Probenträger mit Matrix beschichtet wurde, fahren Sie entweder sofort mit dem MALDI-Bildgebungsinstrument fort oder versenden Sie es mit Trockeneis unter Verwendung der gleichen Doppelreißverschlussbeutelvorbereitung, die in Schritt 2.19 beschrieben wurde.
    HINWEIS: Unter Notfallbedingungen, wie z. B. wenn das MALDI-Instrument nicht für den sofortigen Gebrauch verfügbar ist, lagern Sie den beschichteten Objektträger im Vakuumzustand oder bei -20 ° C für bis zu 24 Stunden, obwohl die Verschlechterung einiger Metaboliten während der Lagerung auftreten kann, die nicht gründlich untersucht wurde.

Das repräsentative Experiment wurde gemäß dem in Abbildung 1gezeigten Workflow durchgeführt. Die entwicklungsförderlichen C57BL Wildtyp-Mausgehirne des postnatalen Tages 1, 21, 60 (erwachsene) wurden wie oben beschrieben nach CUNY IACUC-Richtlinien geerntet und für 2, 5 bzw. 7 Minuten auf einem Aluminiumboot, das auf flüssigem Stickstoff schwimmt, eingefroren. Die gefrorenen Gewebe wurden bei 10 μm dicken Abschnitten bei −15 °C kryossektioniert, die sowohl für den Probenkopf als auch für die Kammer eingestellt waren. Die Gewebeschreibeschnitte wurden dann schonend auf die vorgekühlte leitfähige Seite von ITO-beschichteten Glasobjektträgern für die MALDI-Bildgebung übertragen. Montierte Kryosektionen auf ITO-Objektträgern wurden 45 min bei Raumtemperatur im Vakuum ausgetrocknet, gefolgt von der Matrixabscheidung mit einem automatischen Matrixsprühgerät. Matrix NEDC wurde verwendet, um Metaboliten nachzuweisen, und eine Matrixlösung von 10 mg/ml in Methanol/Wasser (70/30, v/v) wurde mit einer Durchflussrate von 0,1 ml/min und einer Düsentemperatur von 75 °C für 12 Zyklen mit 5 s Trocknung zwischen jedem Zyklus abgeschieden. Es wurde eine Sprühgeschwindigkeit von 1300 mm/min, ein Spurabstand von 2 mm, ein N2-Gasdruck von 10 psi und eine Durchflussrate von 3 L/min und eine Düsenhöhe von 40 mm verwendet.

MALDI-Massenspektren wurden im negativen Ionenmodus mit dem MALDI Time of Flight (TOF) MSI-Instrument aufgenommen. 0,5-1 μL rote Phosphoremulsion (Pn-Cluster mit n = 1 - 90) Emulsion in Methanol wurden auf den ITO-Objektträgern neben den montierten Geweben abgeschieden und verwendet, um das Instrument im Massenbereich von 100 - 1000 m/ z durch Anwendung der quadratischen Kalibrierkurve13zu kalibrieren. Die Laserspotdurchmesser wurden auf das modulierte Strahlprofil "Medium" für 50 μm Rasterbreite fokussiert. Spektren im Massenbereich von m/z 50 bis 1000 wurden bei 1000 Hz für 500 Aufnahmen aufgenommen. Massenspektrendaten wurden aufgezeichnet und die Bildgebung wurde mit der fortschrittlichen MALDI MSI-Datenanalysesoftware weiter analysiert. Ionenbilder wurden mit RMS-Normalisierung (Root-Mean Square) bei einer Behälterbreite von ±0,25 Da erzeugt.

Die Ergebnisse in Abbildung 2 zeigen Ausgangsbilder der MALDI MSI-Datenanalysesoftware von m/z-Spektren, die aus jedem 100-Dalton-Intervall ausgewählt wurden, und zeigen deutlich den Nutzen für die Identifizierung von Spektren von niedermolekularen Metaboliten bis hin zu hochmolekularen Lipiden. Jede Zeile zeigt die jeweiligen Ionenwärmekarten, die sowohl räumliche als auch spektrale Informationen einer bestimmten Metabolitenspezies über drei Gewebe enthalten, die am postnatalen Tag 1, 21 und 60 gesammelt wurden. Für jedes repräsentative m/z kann die Analyse der regionalen Verteilung und Ionenhäufigkeiten verwendet werden, um relative Mengen entsprechender Arten zwischen verschiedenen Altersgruppen zu vergleichen. Eine Stärke der MALDI MSI-Methodik ist die Fähigkeit, die Spezifität bestimmter von m/z identifizierter Arten auf Entwicklungsmeilensteine oder spezifische anatomische Strukturen zu erkennen. Es wird beobachtet, dass einige Metaboliten bei P1-Neugeborenen angereichert (m/z 320.1), bei P60-Erwachsenen angereichert (m/z 846.5) oder gleichmäßig über Dasalter verteilt sind (m/z 480.3); andere molekulare Spezies sind spezifisch angereichert mit grauer Substanz (m/z 117.1; 524.3; 765.1), weißer Substanz (m/z 673.4; 846.5) oder CSF/Ventrikeln (m/z 239.0)(Abbildung 2A). Die räumliche Verteilung repräsentativer Metaboliten einschließlich Hypoxanthin (m/z 135,0), N-Acetyl-L-Asparaginsäure (m/z 174,0), Arachidonsäure (m/z 303,2) und mehrere Lipide wie Lysophosphatidylethanolamin LPE (18:1) (m/z 478,3), LPE(20:4) (m/z 500,3), LPE (22:6) (m/z 524,3), Phosphatidylethanolamin PE (44:10) (m/z 838,5), Phosphatidylinositol PI(38:4) (m/z 885,6) sind ebenfalls dargestellt (Abbildung 2B).

Abbildung 1. Workflow der MALDI- Time of Flight (TOF) Massenspektrometrie-Bildgebung. Das schnappgefrorene Gewebe wird im Kryostaten kryrosektioniert und auf einem ITO-Objektträger montiert. → Der Objektträger mit Gewebeschnitten wird mit einer feinen Matrixschicht mit einem automatischen Matrixsprüher beschichtet. → Massenspektren werden vom MALDI-TOF MSI-Instrument an einem Raster von 20-200um gesammelt. → Die Daten werden analysiert und die Bilder werden mit der fortschrittlichen MALDI MSI-Datenanalysesoftware generiert. Maßstabsleiste: 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2. Repräsentativer Output mit ausgewählten m/z-Spektren aus der Massenspektrometrie bei 50 μm lateraler Auflösung. (A) Eine Heatmap zeigt die räumliche Verteilung spezifischer Metabolitenspezies, die aus jedem 100-Dalton-m/z-Intervall über die drei bei P1, P21 und P60 identifizierten Entwicklungsmeilensteine ausgewählt wurden. (B) Die räumliche Verteilung repräsentativer Metaboliten bei P1, P21 und P60, einschließlich: Hypoxanthin, N-Acetyl-L-Asparaginsäure, Arachidonsäure und verschiedene Lipidspezies wie Lysophosphatidylethanolamin (LPE), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylinositol (PI). Maßstabsleiste, 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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