In-vitro-Modellierung für neurologische Erkrankungen mit direkter Konvertierung von Fibroblasten in neuronale Progenitorzellen und Differenzierung in Astrozyten

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Neuprogrammierung menschlicher hautabgeleiteter Fibroblasten in induzierte neuronale Vorläuferzellen (iNPCs) und deren anschließende Differenzierung in induzierte Astrozyten (iAs). Diese Methode führt zu einer schnellen und reproduzierbaren Generierung von iNPCs und iAs in großen Mengen.

Zusammenfassung

Die Forschung zu neurologischen Störungen konzentriert sich in erster Linie auf die Auswirkungen von Neuronen auf Krankheitsmechanismen. Die begrenzte Verfügbarkeit von Tiermodellen wirkt sich stark auf die Untersuchung zelltypspezifischer Beiträge zur Krankheit aus. Darüber hinaus spiegeln Tiermodelle in der Regel keine Variabilität in Mutationen und Krankheitskursen wider, die bei menschlichen Patienten beobachtet werden. Reprogrammierungsmethoden zur Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) haben die patientenspezifische Forschung revolutioniert und wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen geschaffen. Die iPSC-Technologie hat jedoch Nachteile wie Zeit, Arbeitsengagement, klonale Selektivität und Verlust epigenetischer Marker. Jüngste Modifikationen dieser Methoden ermöglichen eine direktere Generierung von Zelllinien oder bestimmten Zelltypen, die die klonale Isolation oder einen pluripotenten Stammzellzustand umgehen. Wir haben eine schnelle direkte Konvertierungsmethode entwickelt, um induzierte neuronale Vorläuferzellen (iNPCs) aus Hautfibroblasten zu erzeugen, die retrovirale Vektoren in Kombination mit neuralisierenden Medien verwenden. Die iNPCs können in Neuronen (iNs) Oligodendrozyten (iOs) und Astrozyten (iAs) unterschieden werden. iAs Produktion erleichtert schnelle Arzneimittel- und Krankheitsmechanismus-Tests, da die Differenzierung von iNPCs nur 5 Tage dauert. Darüber hinaus sind iAs einfach zu handhaben und werden in reinen Populationen in großer Zahl erzeugt. Wir entwickelten einen hochreproduzierbaren Co-Kultur-Assay mit Maus-GFP+-Neuronen und Patienten-abgeleiteten iAs, um potenzielle therapeutische Strategien für zahlreiche neurologische und neurodegenerative Erkrankungen zu bewerten. Wichtig ist, dass die iA-Assays auf ein 384-Well-Format skalierbar sind, was die Bewertung mehrerer kleiner Moleküle in einer Platte erleichtert. Dieser Ansatz ermöglicht die gleichzeitige therapeutische Auswertung mehrerer Patientenzelllinien mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund. Die einfache Herstellung und Speicherung von iAs und die Fähigkeit, mehrere Verbindungen in einem Assay zu untersuchen, machen diese Methode anpassungsfähig für die personalisierte Medizin.

Einleitung

Das Verständnis der zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen ist für neurologische Erkrankungen von entscheidender Bedeutung, da sie bei der Entwicklung potenzieller therapeutischer Strategien hilft. Während Tiermodelle in der Vergangenheit der Goldstandard für die Erforschung von Erkrankungen des Nervensystems waren, zeigt die direkte Übersetzung potenzieller Therapien in ein klinisches Umfeld oft einen begrenzten Erfolg^1,2,3. Gründe für die fehlende Übersetzung sind mangelnde Variabilität des genetischen Hintergrunds und Mutationen bei Mäusen, unvollständige Darstellung von Krankheitsphänotypen und Variation der Arzneimittelempfindlichkeit oder -dosing bei menschlichen Patienten, die in ininbred Mausstämmen nicht gut abgebildet sind. Darüber hinaus sind für viele seltene neurologische Erkrankungen keine oder nur wenige Tiermodelle verfügbar. Das Studium von Krankheitsmechanismen direkt in relevanten menschlichen Zelltypen könnte die Forschung erleichtern und die Übersetzung in die Klinik verbessern. Bei ZNS-Erkrankungen sind primäre menschliche Zellen schwer zu bergen und stellen eine sehr begrenzte Quelle dar, da Biopsien invasiv sind oder erst im Endstadium der Krankheit postmortal abgerufen werden können. In den letzten 15 Jahren hat die Entwicklung der zellulären Reprogrammierungstechnologie die Fähigkeit, menschliche neurologische und neurodegenerative Erkrankungen in vitro zu modellieren, rasch erweitert.

Herkömmliche Methoden der Zellreprogrammierung beinhalten die Umprogrammierung von Fibroblasten oder anderen Zelltypen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs), die in der Lage sind, sich aus allen drei Keimschichten⁴in Zelltypen zu differenzieren. Takahashi und Yamanaka waren die ersten, die zeigten, dass die Reexpression von vier Stammzell-Transkriptionsfaktoren ausreicht, um somatische Zellen in iPSCs⁵umzuleiten. iPSCs können dann weiter in bestimmte Zelltypen differenziert werden. Der Nachteil dieses Prozesses ist jedoch, dass es arbeitsintensiv und zeitaufwändig ist, stabile Stammzellklone zu erzeugen und zu isolieren. Somatische Mutationen oder spezifische Aberraden der Mutterzelle werden ebenfalls im Stammzellklon beibehalten und können die Ergebnisse der Studie⁶beeinflussen. Darüber hinaus deuten immer mehr Hinweise darauf hin, dass der Reprogrammierungsprozess zu Stammzellen wertvolle epigenetische Veränderungen löscht, die zelluläre Krankheitsmechanismen^4,7,8beeinflussen könnten. In den letzten Jahren konzentrierten sich die Forscher auf modifizierte Reprogrammierungsmethoden, die eine direktere Generierung verschiedener Zelltypen ermöglichen, während sie den pluripotenten Stammzellzustand^9,10,11,12 (in ^13,14) umgehen. Erste Durchbrüche ergaben in vitro kombinatorische Reprogrammierung von Fibroblasten auf Kardiomyozyten¹⁵, Neuronen¹⁶ und Hepatozyten¹⁷ durch ektopische Expression mehrerer linienspezifischer Transkriptionsfaktoren oder microRNAs¹⁸. Es folgten Studien, die Zellen direkt umprogrammierten, um neurologische Störungen zu modellieren^19,20. Wie bereits erwähnt, haben solche direkten Reprogrammierungs- oder Konvertierungsprotokolle potenzielle Vorteile gegenüber klassischen iPSC-Protokollen, einschließlich Geschwindigkeit und Ablation des klonalen Isolationsschritts. Darüber hinaus deuten Beweise darauf hin, dass diese Protokolle es ermöglichen, eine größere Menge an epigenetischen Informationen über das Alter des Patienten aufrechtzuerhalten, und wahrscheinlich gilt dasselbe für die krankheitsrelevanten Marker^7,8.

Bis heute konzentrierte sich die meiste In-vitro-Forschung zu neurologischen Störungen hauptsächlich auf Neuronen. Es ist jedoch bekannt, dass andere Zelltypen wie Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten eine entscheidende Rolle bei der Krankheitspathologie und dem Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD), Amyotropher Lateralsklerose (ALS), Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit (HD), Multiple Sklerose (MS) und anderen neurologischen Pathologien wie Rett-Syndrom (RTT), Schlafstörungen ( Sucht, Epilepsie, lysosomale Speicherstörungen, Depressionen, Migräne und pathologische Schmerzen^{21,22,23,24,25,26}. Astrozyten sind der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Zentralnervensystem (ZNS) und wurden bis vor kurzem aus pathologischer Sicht weitgehend vernachlässigt⁷. Sie sind heute dafür bekannt, eine entscheidende Rolle bei der Unterstützung fast aller homeostatischen Funktionen des gesunden ZNS zu spielen. Darüber hinaus ist es offensichtlich, dass sie eine wichtige pathologische Wirkung haben und sehr wertvoll sind, um Krankheitsmechanismen zu verstehen und therapeutische Strategien zu bewerten¹⁹.

In der aktuellen Beschreibung beschreiben wir ein Protokoll zur direkten Umwandlung von menschlichen Patienten-Fibroblasten in induzierte neuronale Vorläuferzellen (iNPCs) unter Verwendung retroviraler Vektoren, die die Yamanaka-Reprogrammierungsfaktoren (Klf4, Oct3/4, Sox2 und c-Myc) und die anschließende Exposition gegenüber neuralisierenden Medien exdrücken. Frühere Studien haben verschiedene Kombinationen von Transkriptionsfaktoren für die direkte Umprogrammierung auf Neuronalzellen verwendet (rezensiert in ¹⁴), aber die im beschriebenen Protokoll verwendeten Faktoren sind im Großen und Ganzen entweder als Plasmide für die hauseigene Produktion von viralen Vektoren oder als kommerziell verfügbar erhältliche, um virale Reprogramming-Kits zu verwenden. Die resultierenden iNPCs können weiter in induzierte Neuronen (iNs)²⁷, Oligodendrozyten (iOs)²⁴ und Astrozyten (iAS)¹⁹ differenziert werden, um ihre Rolle bei neurologischen Erkrankungen zu untersuchen. Unser Protokoll beinhaltet keine zeitaufwändige Generierung von iPSCs, die die meisten verfügbaren Protokolle für die Ableitung menschlicher Astrozyten²⁸verwenden. Etwa 98% bis 100% der direkt umprogrammierten iNPCs können sich in GFAP-positive Astrozyten²⁹ differenzieren, verglichen mit nur 2% mit direkter Konvertierungsmethode von Fibroblasten zu Astrozyten³⁰. Kürzlich hat eine vergleichende transkriptomische Studie mit unserer beschriebenen Reprogrammierungsmethode gezeigt, dass iNPCs, die von Spender-Fibroblasten umprogrammiert wurden, alterungsgemäße Merkmale auf transkriptionstrativer und funktioneller Ebene beibehalten können, ähnlich wie bei postmortalen Astrozyten und primären Astrozyten²⁹. Somit ist dieses Umwandlungsprotokoll ein leistungsfähiges Werkzeug, um Krankheitsmechanismen zu untersuchen und neuartige therapeutische Ansätze für altersbedingte neurodegenerative und neurologische Erkrankungen zu bewerten.

Hier beschreiben wir das Protokoll, das verwendet wird, um iNPCs und weitere Differenzierung in iAs zu erzeugen, die am besten für größere kleine molekulare Screening-Assays geeignet sind. Krankheitsmechanismen und Arzneimitteltests mit iAs können mit verschiedenen Methoden wie Kokulturen mit Neuronen oder metabolischen und biochemischen Analysen durchgeführt werden. Der Vorteil dieses Systems ist die Geschwindigkeit und einfache Wartung dieser Zellleitungen im Vergleich zu iPSCs. Darüber hinaus können iNPCs in kleinen Portionen für die iAs-Differenzierung eingefroren werden, was Arzneimitteltests unter konstanten Bedingungen über einen längeren Zeitraum erleichtert. Insgesamt wird ein Vergleich größerer Probenzahlen auf diese Weise möglich, was die Tür öffnet, das therapeutische Potenzial von Verbindungen in einer größeren und repräsentativeren Patientenpopulation zu bewerten.

Protokoll

Medien	Reagenz	Zu mischender Betrag	Endkonzentration (%)
Fibroblasten-Medien	DMEM, hohe Glukose, GlutaMAX	500 ml	89
	Fetales Rinderserum	50 ml	10
	Antibiotika-Antimykotik	5 mL	1
Basismedien	DMEM/F12 + Glutamax	500 ml	97
	N-2	5 mL	1
	B-27	5 mL	1
	Antibiotika-Antimykotik	5 mL	1
Konvertierungsmedien	Basismedien	50 ml	99.9
	FGF	1 L	0,02 (20 ng/ml)
	Egf	1 L	0,02 (20 ng/ml)
	Heparin	50 l	0,1 (5 g/ml)
Neurale Vorläuferzelle (NPC) Medien	DMEM/F12 + Glutamax	500 ml	96.9
	N-2	5 mL	1
	B-27	5 mL	1
	Antibiotika-Antimykotik	5 mL	1
	FGF	10 uL	0.002
Astrozyten-Medien	DMEM, hohe Glukose, GlutaMAX	500 ml	89
	Fetales Rinderserum	50 ml	10
	Antibiotika-Antimykotik	5 mL	1
	N-2	1 ml	0.2
Medien müssen nach dem Mischen aller Komponenten gefiltert werden. Konvertierungsmedien (mit Faktoren) müssen jede Woche frisch zubereitet werden.

Tabelle 1. Medienrezepte für alle im Protokoll enthaltenen Zelltypen. Medien sollten gefiltert werden, nachdem alle Komponenten entweder mit einem sterilen Vakuumfiltrationssystem für große Volumina oder Spritzen- und 0,2 Umspritzenfiltern gemischt wurden. Konvertierungsmedien (mit Faktoren) müssen jede Woche frisch zubereitet werden.

1. Direkte Umwandlung von adulten menschlichen Fibroblasten in neuronale Vorläuferzellen

HINWEIS: Eine schematische Zeitleiste dieses Protokolls kann in Meyer (2014)¹⁹überprüft werden.

1. Verwenden Sie primäre menschliche Haut-Fibroblasten, die von Zellbänken oder Hautbiopsien erhalten werden können³¹. Kulturzellen bei 37 °C in einem 5% CO2-Gewebekultur-Inkubator. Durchgangszellen für mindestens 1-2 Passagen nach dem Auftauen vor der Verwendung im Experiment. Sobald die Zellen fertig sind, beschichten Sie einen Brunnen einer 6-Well-Platte mit menschlichem Fibronectin (1:200 in PBS verdünnt) bei Raumtemperatur für 15-20 min.
2. Wenn die Zellen bereit sind, plattiert zu werden, entfernen Sie das Fibronectin aus der Schale und fügen Sie sofort Zelllösung oder 2 ml Fibroblastenmedien hinzu (Tabelle 1) - lassen Sie die Schale nicht vor dem Hinzufügen von Medien austrocknen. Je nachdem, wie schnell die Zellen wachsen, Platte 150.000 (schnell wachsend) - 200.000 (langsam wachsende) Fibroblasten in zwei Brunnen eines menschlichen Fibronectin beschichtet 6-Well-Platte jeweils.
   HINWEIS: Die Zellen sollten etwa 70% konfluent für virale Transduktion sein, um sie noch einige Tage nach der Transduktion in derselben Platte halten zu können. Es kann vorteilhaft sein, an zwei verschiedenen Dichten zu säen, um am nächsten Tag eine Wahl für die Bekehrung zu haben.
3. Am Tag nach der Aussaat die Fibroblasten unter dem Mikroskop überprüfen und die Zelldichte (zwischen 70-85%) überprüfen. und sogar Die Aussaat im gesamten Brunnen für optimale Ergebnisse.
4. Transduce einen gut mit allen vier retroviralen Vektoren (Okt3/4, Klf4, Sox2 und c-Myc) - verwenden Sie eine Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10 für schnell wachsende oder 15 für langsam wachsende Fibroblasten (Transduktionseffizienz sollte 70% oder mehr positive Zellen für jeden Vektor überschreiten). Fügen Sie einem Gesamtvolumen von 1 ml pro Brunnen eine regelmäßige Fibroblasten-Medium-Virus-Mischung hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Gewebekultur-Inkubator. Lassen Sie den zweiten gut unbehandelt und kehren Sie Die Zellen in den Inkubator der Gewebekultur zurück.
   HINWEIS: Retrovirale Vektoren können von einem Anbieter gekauft oder im eigenen Haus hergestellt werden, Protokolle sind online verfügbar³².
5. Am Tag nach der Transduktion die Zellen 1x mit PBS waschen und 1 ml frisches Fibroblastenmedium hinzufügen.
6. Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium in das Konvertierungsmedium. Waschen Sie Zellen 1x mit PBS, um das Rest-Fibroblastenmedium loszuwerden, und fügen Sie dann 1 ml Umwandlungsmedium hinzu. Ändern Sie auch die Medien der unbehandelten Gutmedien in Konvertierungsmedien.
   HINWEIS: Einige morphologische Veränderungen können sogar beobachtet werden, indem die Medien auf den Fibroblasten, die keine retrovirale Vektorbehandlung erhalten haben, geändert werden, so dass ein unbehandelter Brunnen (optional) bei der Bestimmung der Wirkung der viralen Vektoren hilfreich ist. Zellen sollten 2-4 Tage nach dem Wechsel zu Konvertierungsmedien mit dem Morphologiewechsel beginnen.
7. Beobachten Sie Zellen unter dem Mikroskop und beobachten Sie Veränderungen in der Morphologie (Abbildung 1). Zellmedien sollten während des Konvertierungsprozesses (1-2 ml Konvertierungsmedien, Tabelle 1) und für die nachfolgende iNPC-Kultur täglich ersetzt werden. Ändern Sie das Medium, indem Sie sorgfältig 70% des Mediums aus dem Brunnen entfernen und gleichzeitig sicherstellen, dass die Zellen in den verbleibenden 30 % der Medien bedeckt bleiben.
   HINWEIS: Medien mit Wachstumsfaktoren müssen innerhalb von 1 Woche nach der Zubereitung verbraucht werden.
   1. Beobachten Sie zellen und wechseln Sie die Medien täglich (1-2 ml Konvertierungsmedien).
   2. Einige Zelllinien beginnen, lose erhöhte runde Formationen zu bilden, die in Ballstrukturen oder lockeren neuronalen Kugeln wachsen (Ergänzende Figur 1 und ^19,33). Achten Sie darauf, diese Zellen nicht zu lösen. Wenn sich die Kugeln lösen, können sie gesammelt und in einem neuen Fibronectin-beschichteten Brunnen einer 6-Well-Platte wieder aufgetiert werden.
      HINWEIS: Wenn sie von selbst erweitert werden, haben die Zellen eine reduzierte Vielfalt im Vergleich zur Anfangsplatte und können eine deutlich andere Zelllinie darstellen. Wir empfehlen, diese Zellen bei der nächsten Teilungsrunde mit den übrigen umgewandelten Zellen zu kombinieren.
8. Nach ca. 5-6 Tagen in Konvertierungsmedien (bis zu 12 Tage für schwierige Zelllinien) oder wenn Zellen sehr dicht werden, durchgehen sie 1:2 oder maximal 1:3.
   HINWEIS: Es ist sehr wichtig, die Zellen während des gesamten Umwandlungsprozesses bei einer hohen Dichte zu halten.

2. Konvertierungs- und iNPC-Splitting-Verfahren

1. Zellablösung (z.B. Accutase) aufwärmen und eine entsprechende Anzahl von Brunnen eines 6-Wells mit Fibronectin (1:200 in PBS, 1 ml Beschichtungsvolumen) für 15-20 min bei Raumtemperatur beschichten. Fibronectin Beschichtung kann länger ohne negative Auswirkungen sein, aber sollte darauf geachtet werden, die Beschichtungszeit nicht zu verkürzen.
2. Waschen Sie Zellen sorgfältig mit PBS, ohne Zellen zu lösen (verwenden Sie die Wand des Brunnens, um PBS sanft auf die Zellen aufzutragen). ENTFERNEN Sie PBS vorsichtig mit Pipetten oder durch Aspiration.
3. Fügen Sie 0,5 ml Zellablösung hinzu und brüten 2-3 min bei 37 °C in einem Gewebekultur-Inkubator. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die meisten Zellen gelöst haben. Wenn alle Zellen abgegangen sind, fügen Sie 2 ml frische Umwandlungsmedien und sanft Pipetten nach oben und unten 2-3 mal, um Klumpen zu dissoziieren (falls erforderlich).
4. Sammeln Sie die Zellen in einem 15 ml Rohr und fügen Sie zusätzliche 3 ml Medien hinzu, um die Zellablösung weiter zu verdünnen. Waschen Sie den Brunnen zuerst mit den zusätzlichen Medien, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt wurden.
5. Zentrifuge für 4 min bei 200 x g bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Das Konvertieren von Zellen oder iNPCs ist äußerst empfindlich gegenüber dem Vorhandensein einer Zellablösung in den Medien. Es ist absolut notwendig, das Restenzym durch Zentrifugation und Entzug des Überstandes zu entfernen.
6. Entfernen Sie den Überstand aus dem Zellpellet und setzen Sie die Zellen in 1 ml frischem Medium wieder auf. Sanft Pipette nach oben und unten 2-3 mal, um Zellklumpen zu lösen. Entfernen Sie Fibronectin aus beschichteten 6-Wells und fügen Sie 1 ml frische Medien zu jedem Brunnen sofort (nicht fibronectin trocknen lassen). Für ein Split-Verhältnis von 1:2 0,5 ml der Zellsuspension in einem Brunnen und der andere 0,5 ml in einem zweiten Brunnen hinzufügen.
   1. Kulturzellen bei 37 °C in einem Gewebekultur-Inkubator.
7. Verteilen Sie die Zellen, indem Sie den 6-Brunnen in Nord-Süd-Ost-West-Richtung (nicht kreisförmig) sanft schütteln und in den Inkubator der Gewebekultur geben.
8. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop am nächsten Tag und wechseln Sie die Medien (1-2 ml). Ändern Sie die Medien jeden Tag, bis die Zellen wieder geteilt werden können.
   HINWEIS: An diesem Punkt sollte die Zellproliferation beginnen zu beschleunigen, und Zellen sollten für eine zweite Teilung innerhalb von 2-3 Tagen bereit sein (4 Tage für sehr langsam wachsende Linien).
   1. Bei dieser neuen Spaltung wird ein Bohrkörper von Zellen in Umwandlungsmedien und der andere brunnen in NPC-Medien, die nur FGF in erhöhter Konzentration enthalten, ohne EGF/Heparin (Tabelle 1) gesät.
      HINWEIS: Einige Zelllinien erreichen in Konvertierungsmedien nach etwa 10 Tagen einen stagnierenden Zustand, und der Wechsel zu NPC-Medien könnte beim Zellwachstum helfen. Darüber hinaus haben NPCs eine spezifischere, kleinere Form, wenn sie in NPC-Medien¹⁹angebaut werden. An dieser Stelle sind die iNPCs zur Differenzierung und weiterverwendung sbereit.
9. WechselnSier Medien (1-2 ml) der iNPCs täglich wechseln.
   1. Erweitern Sie NSCs in 10 cm Gerichte, indem Sie zwei oder drei konfluente Brunnen eines 6-Wells kombinieren. Das Medienvolumen für 10 cm Geschirr beträgt in der Regel 12-15 ml.
   2. Bei der nächsten Teilung, erweitern Sie diese Zellen weiter auf drei oder vier 10 cm Gerichte (12-15 ml Medien) für Generationen von einer großen Anzahl von Zellbeständen. 10 cm Gerichte werden in der Regel alle 3-4 Tage je nach Proliferationsrate bei 1:3 oder 1:4 geteilt.

3. Erzeugung induzierter Astrozyten aus NPCs

1. Um Astrozyten aus frischen iNPCs herzustellen, säen sie iNPCs (in 10 cm fibronectin beschichteten Platten) direkt in 10 ml Astrozytenmedium (Tabelle 1), so dass sie am nächsten Tag etwa 10% konfluenzig sind. Kulturzellen bei 37 °C in einem 5% CO2-Gewebekultur-Inkubator.
   HINWEIS: Die empfohlene Saatdichte beträgt in der Regel 50 l der Zellresuspension einer 10 cm Schale nPCs, sofern sie auf der Grundlage ihres Split-Verhältnisses auf ein endgültiges Volumen verdünnt werden (z. B. 3 ml für einen 1:3-Split, 4 ml für eine 1:4-Teilung usw.).
2. Wechselmedium (10 ml Astrozytenmedien) der iAs drei Tage nach der Beschichtung. Halten Sie die Zellen für 5-7 Tage differenzieren.
   HINWEIS: iAs tolerieren mehrere Passagen nicht gut, daher ist es besser, jedes Mal, wenn Sie die NPCs teilen, frische Astrozyten zu machen.
3. Um experimentel auszusieren, teilen Sie die Astrozyten mit Trypsin oder Zellablösung, wie in den Schritten 2.1-2.7 beschrieben. Die empfohlenen Sädichten sind in Tabelle 2enthalten.

Plattentyp	Astrozyten pro Brunnen
384-well	2500
96-well	10000
24-well	40000
6-gut	150000

Tabelle 2. Empfohlene Sädichte von iAs pro Plattenfläche. Typische Anzahl von iAs, die ausgesät wurden, um eine Monoschicht auf den häufigsten Gewebekulturplatten zu erzeugen.

4. Vorbereitung und Auftauung von Portionen zur Astrozytendifferenzierung von gefrorenen NPC-Beständen (Alternative zu Schritt 3)

HINWEIS: Als Alternative zur Aufrechterhaltung von iNPCs in der Kultur können Astrozyten auch direkt aus einem gefrorenen Bestand hergestellt werden. Dazu werden die iNPCs in kleineren Portionen eingefroren. Tabelle 3 zeigt die vorgeschlagenen Gefrier- und Auftauvolumen für Portionen, die in eine 10 cm große Schale mit 10 ml Astrozytenmedien aufgetaut werden sollen.

Portionsgröße	Zellaufhängung (L)	Einfrieren von Medien (L)	Gesamtvolumen (L)	Tauauf in
4x	400	400	800	Zwei 10-cm-Gerichte
2x	200	200	400	Ein 10-cm-Gericht

Tabelle 3. Anweisungen zum Portionierieren von iNPC zum Generieren von iAs. Anteil der iNPC Suspension und Gefriermedien, um Portionen zu generieren. Beachten Sie, dass die endgültige DMSO-Konzentration 10 % beträgt, wenn die Zellsuspension mit Gefriermedium gemischt wird.

1. Um Astrozyten aus gefrorenen iNPC-Beständen herzustellen, entfernen Sie die Durchstechflasche mit Portionsbestand aus dem Flüssigstickstoffspeicher und tauen Sie schnell bei 37 °C auf. Sobald Zellen aufgetaut sind, wird die Pipettenzelllösung in einem 15 ml-Rohr mit 5 ml Astrozytenmedien aufgetaut.
2. Zentrifuge für 4 min bei 200 x g und Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie in 1 ml frischem Astrozytenmedium.
3. Fügen Sie 9 ml frisches Astrozytenmedium zu einer fibronectin beschichteten 10 cm Schale hinzu und fügen Sie 1 ml Zelllösung hinzu. Sanfte Verteilung von Zellen in Nord-Süd-Ost-West-Bewegung. Kulturzellen bei 37 °C in einem 5% CO2-Gewebekultur-Inkubator.

Ergebnisse

Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle und einfache Generierung von iNPCs direkt aus menschlichen Haut-Fibroblasten mit Retroviren, die die Yamanaka-Faktoren enthalten. Diese Methode ermöglicht es, den Stammzellzustand und die Notwendigkeit einer klonalen Selektion zu umgehen und so klonale Variationen zu vermeiden. Wichtige Schritte, die sie im Auge behalten sollten, während die Zellen den Umwandlungsprozess durchlaufen, sind die Fibroblasten-Saatdichte, der mediale pH-Wert und die optimale Konfluenz der Zellen. Beispiele für optimale Änderungen der Spaltenkonfluency und Morphologie während des Konvertierungsprozesses finden Sie in Abbildung 1.

Abbildung 1. Repräsentative Bilder des Konvertierungsprozesses nach dem Hinzufügen der retroviralen Mischung von Yamanaka-Faktoren. Fibroblasten wurden 24 Stunden später mit Yamanaka-Faktoren gesät und transduziert. Zwei Tage nach dem Virus (DPV) wurden die Medien in Konvertierungsmedien geändert. Zellen wurden in Konversionsmedien kultiviert, bis sie bereit waren, durchzufahren (13 DPV). Die Zellen wurden nach dem Übergang nach dem Eintreffen von 80 % am nächsten Tag (14 DPV) gesät. Nachfolgende Passagen hielten diese Dichte aufrecht, bis neuronale Vorläuferzellen beginnen, sich schnell zu teilen. Die Maßstabsleiste ist 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Nach Abschluss des Konvertierungsprozesses zeigen die NPCs stark reduzierte Expression oder keine Expression von Fibroblastenmarkern und Morphologien und drücken NPC-spezifische Zellmarker aus (Abbildung 2). Darüber hinaus können sie auch zum Generieren verschiedener Zelllinien verwendet werden, z. B. iNs, iOs und iAs.

Abbildung 2. Zellen, die den Konvertierungsprozess durchlaufen, drücken zellspezifische Marker aus. Patienten-Fibroblasten (A), induzierte neuronale Vorläuferzellen (iNPCs (B) und induzierte Astrozyten (iAs (C) Zellen wurden auf Glasabdeckungen in einer 24 gut Gewebekultur behandelten Platte gesät. Die Zellen wurden immungefärbt für: Fibroblasten-spezifische Zellmarker (A), Vimentin (grün) und TE7 (rot), iNPC-spezifische Zellmarker (B), Nestin (rot) und iAs-Zellmarker (C) GFAP (lila) und iNPC-Marker Nestin (grün). Die Maßstabsleiste ist 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Nach unserer Erfahrung sind insbesondere iAs sehr wertvoll für Arzneimittel- und Krankheitsmechanismus-Tests, da sie in reinen Populationen (98% oder mehr GFAP-positive Zellen²⁹) bei reproduzierbaren großen Zahlen erzeugt werden können. iAs können von iNPCs unterschieden werden, indem ein kleines Aliquot von Zellen während der Spaltung oder ein zuvor eingefrorener iNPC-Anteil genommen und direkt in Astrozytenmedien plattiert wird. Wichtige Überlegungen während dieses Prozesses sind die Aufrechterhaltung der anfänglichen Saatdichte der iNPCs (Abbildung 3 und Abbildung 4), da eine hohe Dichte gezeigt hat, dass sie den Differenzierungsprozess behindert ( Abbildung4) und zusätzliche Aufmerksamkeit auf den pH-Wert der Medien zu richten, da die Versauerung sogar gesunde Astrozyten aktivieren kann.

Abbildung 3. Repräsentative Bilder des iAs-Generierungsprozesses von iNPCs. iNPCs werden in Astrozytenmedien (Tabelle 1) mit geringer Aussaatdichte gesät. Eine gute Saatdichte beträgt am ersten Tag nach der Aussaat (DPS) etwa 10% (links); Diese Dichte kann jedoch an die Wachstumsrate der Zellen angepasst werden. Typische iAs Morphologie kann nach 5 DPS (Mitte) beobachtet werden. In einigen Fällen kann eine abnorme Astrozytenmorphologie mit langen, stacheligen Erweiterungen beobachtet werden. Diese Änderung ist ein Hinweis auf die Astrozytenaktivierung und kann sekundär zu Krankheitszustand oder falschen Kultivierungstechniken sein (rechts). Die Maßstabsleiste ist 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4. die iNPC-Saatdichte wirkt sich auf die IAs-Differenzierungseffizienz aus. Kontroll-iNPC-Linien wurden in Astrozytenmedien mit niedriger (A) und hoher (B) Dichte gesät, um die Auswirkungen der Saatdichte auf die Differenzierung zu demonstrieren. 5 DPS, die Linie mit niedriger Dichte exprimierte astrozytenspezifische Marker, während die High-Density-Linie eine Mischung aus iNPC- und iAs-Markern mit einer markierten iNPC-ähnlichen Morphologie zeigt. Die Maßstabsleiste ist 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1. Zusätzliche Zahlen des Umwandlungsprozesses nach Zugabe der retroviralen Mischung von Yamanaka-Faktoren. Bilder des Konvertierungsprozesses bei 12 DPV (1 Tag vor passage) und 19 DPV (6 Tage nach Passage). Beachten Sie den Unterschied in der Morphologie zwischen Zellen vor und nach dem Durchgang, bei 12 DPV-Zellen haben eine kugelartige Strukturmorphologie. Nach einer Passage und mehreren Tagen auf Konvertierungsmedien (Tabelle 1) beginnen Zellen, eine NPC-ähnliche Morphologie anzuzeigen. Die Maßstabsleiste ist 200 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Zusammenfassend ist die direkte Umwandlung eine schnelle und einfache Methode, um induzierte neuronale Vorläuferzellen aus Patientenhaut-Fibroblasten zu erzeugen. Diese Methode ist vorteilhaft wegen ihrer Geschwindigkeit sowie der großen Anzahl von Zellen, die leicht zu warten sind. Darüber hinaus deuten immer mehr Hinweise darauf hin, dass direkte Reprogrammierungsmethoden weniger epigenetische Markierungen entfernen als klassische iPSC-Reprogrammierungstechnologie, wodurch die Krankheitsumgebung intakter bleibt^4,7,8. Die Differenzierung von iNPCs zu Astrozyten ist sehr geradlinig und auch zwischen mehreren unabhängigen Laboratorien sehr reproduzierbar^19,29,33. iNPCs können in kleinen Portionen eingefroren und direkt zu Differenzierungszwecken aufgetaut werden, was dazu beiträgt, die Variation zwischen den Experimenten zu reduzieren, da die Durchgangszahlen ähnlich gehalten werden können. Astrozyten spielen bei vielen neurologischen Erkrankungen eine entscheidende Rolle bei der Krankheitsprogression und sind daher ein interessanter Zelltyp, mit dem man arbeiten kann. Die Astrozyten können für mechanistische Studien, Stoffwechselstudien oder Arzneimitteltest-Assays verwendet werden und werden in der Regel als Monolayer angebaut. Darüber hinaus können Astrozyten in Co-Kultur-Systemen mit Maus- oder menschlichen Neuronen kombiniert werden, um den Einfluss von Astrozyten auf das neuronale Überleben und die Morphologie zu bewerten, die beide gute Auslesungen für Arzneimitteltests sind³⁴.

Um dieses Protokoll erfolgreich nutzen zu können, müssen einige Punkte und mögliche Einschränkungen im Auge behalten werden. Die menschlichen Hautfibroblasten zum Beispiel variieren stark in ihrer Zellteilungsrate sowie der Reaktion auf virale Vektoren. Da es sich nicht um standardisierte Zelllinien handelt, sind sie so variabel wie die Menschheit selbst, jede Linie ist anders. Wie bei vielen Umprogrammierungsmethoden ist es einfacher, Fibroblasten neu zu programmieren, die eine moderate bis schnelle Zellteilungsrate haben, im Vergleich zu Zellen, die sich kaum replizieren. Die Replikationsrate kann durch die Hautbiopsiequalität und die Verarbeitung selbst, durch die Durchgangsnummer der Fibroblasten sowie die Handhabung beeinflusst werden. Bei der Arbeit mit primären Haut-Fibroblasten ist es wichtig, die Zellen nicht zu dicht werden zu lassen, um eine Induktion der Seneszenz zu vermeiden. Wenn die Fibroblasten nicht gut wachsen, ist es am besten, einen neuen Bestand oder einen niedrigeren Durchgang zu versuchen, obwohl in einigen Fällen auch die Krankheit selbst eine Rolle spielen könnte. Die Zellteilung kann manchmal durch die Verwendung von 15% oder 20% FBS in den Fibroblastenmedien im Vergleich zu den Standard 10% verbessert werden.

Die Qualität der Reprogrammierung viraler Vektoren ist von großer Bedeutung für den Erfolg. In unseren Händen waren retrovirale Vektoren effizienter als lentivirale Vektoren oder andere nicht integrierende Viren; Dies könnte jedoch von der Qualität und Reinheit des viralen Vektors abhängen. Kommerzielle retrovirale Vektor-Kits geben in der Regel die virale Vektorkonzentration und oft auch eine Vielzahl von Infektionen für eine bestimmte Zelllinie an. Es ist wichtig zu bedenken, dass primäre Fibroblasten von der Zelllinie abweichen, die von den Unternehmen verwendet wird, um die virale Vektoraufnahme zu bestimmen. Darüber hinaus ist auch bei der Bestellung des gleichen kommerziellen Kits, Variation zwischen Chargen üblich. Darüber hinaus variiert die Aufnahme viraler Vektoren auch zwischen Fibroblasten-Zelllinien. Einige Linien könnten empfindlicher sein und daher transduzierte Zellen sterben, während andere Zelllinien resistenter gegen virale Aufnahme sein könnten. Daher kann die Bestimmung der Transduktionseffizienz für eine bestimmte Zelllinie wichtig sein, insbesondere wenn die Zelllinie langsam wächst oder frühere Konvertierungsversuche fehlgeschlagen sind. In unseren Händen ist der beste Weg, um zu beurteilen, wie viel von einem bestimmten retroviralen Vektor für die Umwandlung benötigt wird, eine immunfluoreszierende Färbung mit mehreren Verdünnungen des viralen Vektors durchzuführen. Die Anzahl der Zellen, die das Transgen für jeden Vektor exemiten, kann dann mit dem Ziel einer Transduktionseffizienz von 70% oder höher gezählt werden. Nach unserer Erfahrung können ähnliche MOIs für die meisten Zelllinien verwendet werden, jedoch kann der MOI bei Bedarf angepasst werden.

Während des Konvertierungsprozesses ist es wichtig, die Zellen nicht zu früh aufzuteilen. Die Zeit, bis die Zellen aufgeteilt werden können, hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der primären Zelllinie und ihrer Eigenschaften, der Qualität des verwendeten viralen Vektors und der Medienqualität. Wichtig ist, dass die Erfolgsrate der Umwandlung viel höher ist, wenn die Zellen bei hoher Dichte gehalten werden. Selbst wenn die Zellen beginnen, die Morphologie zu ändern, ist es besser, die Zellen im ersten Gut länger zu lassen, als sie vorzeitig zu teilen. Wenn die Teilung zu früh erfolgt, kann die Konvertierung in ihrem Fortschritt anhalten und die Zellen dazu bringen, sich wieder zu fibroblastenähnlicher Form und Verhalten zu unterscheiden. Darüber hinaus kann eine zu frühe Verdünnung zu längeren Zellkörpern führen als die kleinen und kompakten Zellkörper der zuvor beobachteten NPCs. Daher sollten die ersten Splits immer konservativ sein; es ist besser, die Zellen mit einem 1:1 oder 1:2-Split zu dicht zu halten, als sie zu sehr zu verdünnen. Nach der anfänglichen Teilung wird mit einem gewissen Zelltod gerechnet. Bemerkenswert ist, dass die Zellen am ersten Tag nach der Spaltung immer schlechter (flacher) aussehen, was normal ist. Die besten Urteile über die Zellform sollten 2-3 Tage später getroffen werden. Wichtig ist, dass auch die Qualität der Wachstumsfaktoren und Medienkomponenten entscheidend ist. Es ist wichtig, kleine Mengen von Medien mit Wachstumsfaktoren vorzubereiten, so dass die vollständig vorbereiteten Medien nur für maximal 5-7 Tage verwendet werden. Halten Sie die Medien nicht bei Raumtemperatur oder 37 °C für längere Zeit. Schnell verwenden und kühlen, sobald der Medienwechsel durchgeführt wird. Darüber hinaus kann es besonders bei Zelllinien helfen, die gegen Umwandlungen resistenter sind, die Medienmenge bei 1 ml statt 2 ml niedrig zu halten. Wenn die Zellen die Medien schnell verbrauchen, was durch eine Änderung der Medienfarbe rot zu gelb (Versauerungsrate) beobachtet werden kann, stellen Sie die Lautstärke des Mediums auf bis zu 2 ml ein. Schneller Medienkonsum ist ein positives Zeichen und wird häufig in späteren Phasen der Konversion bei gleichzeitig erhöhter Proliferation beobachtet.

NPCs sind auch sehr empfindlich auf das Vorhandensein von Accutase in den Medien und es ist sehr wichtig, die Accutase-Inkubationszeit kurz zu halten. Wir empfehlen eine Inkubationszeit von 2-4 Minuten, überprüfen Zellen häufig unter dem Mikroskop, um zu sehen, wenn sie sich gelöst haben. Es ist wichtig, die Zellen nach der Spaltung zu zentrifugieren, um den Enzymmix aus den Medien zu entfernen. Es ist auch wichtig, die Durchgangszahl im Auge zu behalten, da sich Zelllinien bei erweiterter Kultivierung ändern können, was zu einer Änderung von Expressionsprofilen führt. Daher ist es wichtig, viele Zellbestände in frühen Passagen einzufrieren. Zellen sollten in 10% DMSO und 90% NPC-Medien eingefroren und langfristig in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Aufgrund des Mangels an Serum in diesem Medium ist es wichtig, ein langsames Einfrieren mit Gefrierkammern zu gewährleisten und einmal über Nacht eingefroren, sofort in flüssigen Stickstoff zu übertragen. Während in diesem Protokoll keine klonale Selektion durchgeführt wird, ist es möglich, dass erweiterte Kultivierung und Passierung zu einer natürlichen Selektion einer ersten Zellpopulation mit günstigem Wachstum und Überlebensrate führt. Daher ist es wichtig, passage number und handling im Auge zu behalten, wenn Experimente durchgeführt werden. Wir bevorzugen niedrigere Passagen für Experimente zu verwenden, wenn möglich, überschreiten wir nicht die Passierung der Zelllinien für mehr als 20 Mal. Da NPCs schnell wachsen, kann eine große Anzahl von Beständen an niedrigeren Durchgängen für Experimente eingefroren werden. Zelllinien mit besonders hohen Wachstumsraten sind einem höheren Risiko einer Medienversauerung ausgesetzt. Wenn also Zelllinien mit unterschiedlicher Geschwindigkeit wachsen, muss die Menge der Medien möglicherweise basierend auf der Proliferation angepasst werden. Wenn die Zellen kontinuierlich in stark versauerten Medien gelassen werden, kann es die Gesundheit sowohl der Kontroll- als auch der Krankheitszelllinien beeinflussen. Dies bewirkt, dass selbst gesunde Astrozyten reaktiv werden, was ihre Verwendung in weiteren Differenzierungen und Experimenten beeinflusst.

Für die Astrozytendifferenzierung ist es wichtig, die Zellen bei niedriger Dichte zu halten, da eine hohe Dichte die Zellen daran hindert, sich zu differenzieren, und sie sich mit höheren Raten ausbreiten. Daher muss die Saatdichte für jede Zelllinie abhängig von ihrer Proliferationsrate angepasst werden. Wir empfehlen, verschiedene Sädichten auszuprobieren und Färbungen/RT-PCR mit Astrozytenmarkern durchzuführen, um eine angemessene Differenzierung zu gewährleisten. Die Qualität von IAs kann zusammen mit gesunden Kontrollen mit Co-Kultur-Assays mit Neuronen bewertet werden. Sofern Krankheitspathologie nicht zu einem reaktiven Phänotyp führt, sollten Neuronen in Kontakt mit iAs für mehrere Tage lebensfähig bleiben. Die Astrozytenmorphologie kann zwischen den einzelnen Zelllinien stark variieren und kann auch durch den Phänotyp der Krankheit beeinflusst werden. Darüber hinaus können sie bei Krankheiten, bei denen Astrozyten stark betroffen sind, einen reaktiven Phänotyp mit großen, längigen Erweiterungen aufweisen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100 mm x 2 mm Stilschale, mit Zellkultur behandelt, pyrogenes	Corning	430167	Gewebekultur
15 ml Zentrifugenröhrchen mit konischem Schraubverschluss, Copolymer Polypropylen	USA Scientific	1475-1611	Wird zum Heben und Zentrifugen von Zellen
verwendet 50 ml konische Zentrifugenröhrchen	USA Scientific	1500-1811	Medienvorbereitung
Antibiotisch-Antimykotisch (100X)	Gibco	15240062	Antibiotikum mit antimykotischer Wirkung zur Medienvorbereitung
B-27  Nahrungsergänzungsmittel (50X), serumfreies	Invitrogen	17504044	Für NPC und Basismedien
Kryogene Fläschchen  1,2 ML	Corning	CLS430658-500EA	Zum Einfrieren von Zellbeständen
DMEM, hoher Glukosespiegel, GlutaMAX  Ergänzung, Pyruvat	Gibco	10569010	Für Fibroblasten- und Astrozytenmedien
DMEM/F-12, GlutaMAX  Ergänzung	Gibco	10565042	Für NPC und Basismedien
DMSO	Sigma	D2438-50ML	Zum Einfrieren von Zellbeständen
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	14190136	Im Protokoll als PBS bezeichnet. Zur Fibronektinverdünnung und Zellwäsche
EZ Retrovirus iPSC Reprogrammierungskit	ALSTEM	RF101	Retrovirus mit den Yamanaka-Faktoren. Viren können auch im eigenen Haus hergestellt werden.
Fötales Rinderserum, zertifiziert	Gibco	16000-036	Im Protokoll als FBS bezeichnet. Für Fibroblasten- und Astrozytenmedien
Fisherbrand Sterilspritzen zum Einmalgebrauch	Fisher	14-955-461	Filtermedien (50 ml)
Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut des Schweins	Sigma	H3149-10KU	Im Protokoll als Heparin bezeichnet. Wird in Konversionsmedien verwendet. Pulver in Reinstwasser verdünnt. Endkonzentration von 5000X
humanem Plasma-Fibronektin-gereinigtem Protein	Millipore Sigma	FC010-10MG	Im Protokoll als Fibronektin bezeichnet, wird in einer Verdünnung von 1:200 für die Beschichtung verwendet.
Isopropanol (technische Qualität)	Fisher Scientific	S25372A	Zum Einfrieren von Zellbeständen
Mr. Frosty	Thermo Fisher	5100-0001	Zum Einfrieren von Zellbeständen
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	Für Astrozyten, NPC und Basismedien
Rekombinantes humanes EGF	Preprotech	AF-100-15	Im Protokoll als EGF bezeichnet und in Umwandlungsmedien verwendet. Pulver, verdünnt in PBS, Endkonzentration von 1 mg/ml, gelagert in kleinen gefrorenen Aliquoten
Rekombinantes humanes FGF-basisches	Preprotech	100-18B	Im Protokoll als FGF bezeichnet, wird in NPC und Konversionsmedien verwendet. Pulver, verdünnt in PBS, Endkonzentration von 1 mg/ml, gelagert in kleinen gefrorenen Aliquoten
StemPro Accutase Zelldissoziationsreagenz	Gibco	A1110501	Im Protokoll als Accutase bezeichnet. Wird zum Heben während des Umwandlungsprozesses und von NPCs verwendet.
Stericup Quick Release-GP Steriles Vakuumfiltrationssystem	Millipore Sigma	S2GPU05RE	Medienfiltration
Gewebekulturplatte, 6 Well, flacher Boden mit niedrigem Verdampfungsdeckel	Fisher	08-772-1B	Gewebekultur
Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot	Invitrogen	25300062	Lifting von Fibroblasten und Astrozyten
Whatman Puradisc 25 Spritzenfilter, 0,2 μ m, PES steril	Millipore Sigma	80-2502	Filtermedien (50mL)