Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Summary

Bakers Hefe mitochondriales Genom kodiert acht Polypeptide. Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, sie alle zu beschriften und anschließend als separate Bänder zu visualisieren.

Abstract

Mitochondrien sind essentielle Organellen von eukaryotischen Zellen, die aerobe Atmung können. Sie enthalten kreisförmige Genom- und Genexpressionsapparate. Ein mitochondriales Genom der Bäckerhefe kodiert acht Proteine: drei Untereinheiten der Cytochrom-C-Oxidase (Cox1p, Cox2p und Cox3p), drei Untereinheiten der ATP-Synthase (Atp6p, Atp8p und Atp9p), eine Untereinheit des Ubiquinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktivase-Enzyms, Cytochrom b (Cytb) und mitochondrialem ribosomalem Protein Var1p. Der Zweck der hier beschriebenen Methode ist es, diese Proteine gezielt mit ³⁵S Methionin zu kennzeichnen, sie durch Elektrophorese zu trennen und die Signale als diskrete Bänder auf dem Bildschirm zu visualisieren. Das Verfahren umfasst mehrere Schritte. Zunächst werden Hefezellen in einem Galaktose-haltigen Medium kultiviert, bis sie das späte logarithmische Wachstumsstadium erreichen. Als nächstes blockiert die Cycloheximid-Behandlung die zytoplasmatische Translation und erlaubt ³⁵S-Methionin-Einarbeitung nur in mitochondriale Translationsprodukte. Anschließend werden alle Proteine aus Hefezellen extrahiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Schließlich wird das Gel getrocknet und mit dem Speicherphosphor-Bildschirm inkubiert. Der Bildschirm wird auf einem Phosphorimager gescannt, der die Bänder enthüllt. Die Methode kann angewendet werden, um die Biosyntheserate eines einzelnen Polypeptids in der Mitochondrie eines mutierten Hefestamms mit dem Wildentyp zu vergleichen, der für die Untersuchung von mitochondrialen Genexpressionsdefekten nützlich ist. Dieses Protokoll liefert wertvolle Informationen über die Übersetzungsrate aller Hefe mitochondrialen mRNAs. Es erfordert jedoch mehrere Kontrollen und zusätzliche Experimente, um richtige Schlussfolgerungen zu ziehen.

Introduction

Mitochondrien sind die Organellen, die tief in den Stoffwechsel einer eukaryotischen Zelle involviert sind. Ihre Elektronentransferkette versorgt die Zelle mit ATP, der wichtigsten energetischen Währung, die in mehreren biochemischen Bahnen verwendet wird. Außerdem sind sie an Apoptose, Fettsäure- und Hämsynthese und anderen Prozessen beteiligt. Dysfunktion der Mitochondrien ist eine bekannte Quelle der menschlichen Krankheit¹. Es kann aus Mutationen in nuklearen oder mitochondrialen Genen resultieren, die strukturelle oder regulatorische Komponenten der Organellen kodieren². Bakers Hefe Saccharomyces cerevisiae....

Protocol

1. HefekulturVorbereitung

1. Streifen Hefe aus den gefrorenen Stockkulturen auf frischen Tellern mit dem entsprechenden Medium. Legen Sie die Platten in einen Kultur-Inkubator bei 30 °C für 24-48 h.
   HINWEIS: Lassen Sie die temperaturempfindlichen Mutanten bei der freizügigen Temperatur wachsen.
2. Hefekulturen in 2 ml YPGal-Medium (2% Pepton, 1% Hefeextrakt, 2% Galaktose) aus dem frischen Streifen in 15 ml-Röhrchen impfen und über Nacht bei 200 U/min bei 30 °C aufregen.
3. Messen Sie die optische Dichte der Kultur bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD₆₀₀).
4. Nehmen Sie das Volumen von 0,2 Absorptionseinheiten in sterilen Röhre....

Results

Nach dem oben beschriebenen Protokoll haben wir mitochondriale Übersetzungsprodukte aus zwei S. cerevisiae Stämmen zugewiesen: den wilden Typ (WT) und eine mutierte Lagerlöschung des AIM23-Gens (AIM23 ),die mitochondrialen Translationinitiationsfaktor 3 (Tabelle 1)⁸kodieren. Mitochondriale Übersetzungsprodukte wurden in SDS-PAAG9 radioaktiv gekennzeichnet und getrennt. Die Proben wurden alle 2,5 min vor der Sättigung gesammelt, um einen Zeitkurs.......

Discussion

Untersuchungen der Genexpression spielen einen zentralen Teil der modernen Biowissenschaften ein. Es wurden zahlreiche Methoden entwickelt, die Einblicke in diesen komplexen Prozess geben. Hier beschrieben wir die Methode, die den Zugang zur Proteinbiosynthese in der Bäckerhefe S. cerevisiae mitochondria ermöglicht. Es wird in der Regel angewendet, um die Übersetzungseffizienz der mRNAs in Mitochondrien des mutierten Hefestamms im Vergleich zum Wildtyp zu vergleichen, um auf die Folgen der untersuchten Mutation .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamid	Sigma-Aldrich	A9099
Ammoniumpersulfat	Sigma-Aldrich	A3678
Bakteriologischer Agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Zelldichtemessgerät CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
MARKE Standard Einwegküvetten	Sigma-Aldrich	Z330361
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Cycloheximid	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galaktose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glukose	Sigma-Aldrich	G7021
digitaler Blockheizer	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionin, 500µ Ci (18,5 MBq), stabilisierte wässrige Lösung	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Zentrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Lagerung Phosphor Siebe	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-Methionin	Sigma-Aldrich	M9625
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenbisacrylamid	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Pepton aus Fleisch, bakteriologisch	Millipore	91249
Phenylmethansulfonylfluorid	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Netzteil	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochlorid aus Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 Phosphor-Imager	GE Healthcare
Trizma Basis	Sigma-Aldrich	93352
Vakuumbeheizter Geltrockner	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Hefeextrakt	Sigma-Aldrich	Y1625