Dieses Protokoll verwendet einen Immunfluoreszenz-Assay, um PM2,5-induzierteDNA-Schäden in den sezierten Herzen von Zebrafischembryonen nachzuweisen.
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Methodenartikel
Verwendung von Immunfluoreszenz zum Nachweis von PM2,5-induziertenDNA-Schäden in Zebrafisch-Embryoherzen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Exposition gegenüber Feinstaub (PM2,5)in der Umgebung kann zu einer kardialen Entwicklungstoxizität führen, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch unklar. 8-Hydroxy-2'-Desoxygenase (8-OHdG) ist ein Marker für oxidative DNA-Schäden und γH2AX ist ein empfindlicher Marker für DNA-Doppelstrangbrüche. In dieser Studie wollten wir PM2,5-induzierte8-OHdG- und γH2AX-Veränderungen im Herzen von Zebrafischembryonen mit einem Immunfluoreszenz-Assay nachweisen. Zebrafischembryonen wurden mit extrahierbaren organischen Fasern (EOM) aus PM2,5 bei 5 μg/ml in Gegenwart oder Abwesenheit von antioxidativem N-Acetyl-L-Cystein (NAC, 0,25 μM) nach 2 h nach der Befruchtung (hpf) behandelt. DMSO wurde als Fahrzeugsteuerung eingesetzt. Bei 72 HPF wurden Herzen mit einer Spritzennadel aus Embryonen seziert und fixiert und permeabilisiert. Nach der Blockierung wurden die Proben mit primären Antikörpern gegen 8-OHdG und γH2AX untersucht. Die Proben wurden dann gewaschen und mit sekundären Antikörpern inkubiert. Die resultierenden Bilder wurden unter Fluoreszenzmikroskopie beobachtet und mit ImageJ quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass EOM aus PM2,5 die 8-OHdG- und γH2AX-Signale im Herzen von Zebrafischembryonen signifikant verbesserte. NAC, das als reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) -Fänger fungierte, wirkte jedoch dem EOM-induzierten DNA-Schaden teilweise entgegen. Hier stellen wir ein Immunfluoreszenzprotokoll zur Untersuchung der Rolle von DNA-Schäden bei PM2,5-induziertenHerzfehlern vor, das zum Nachweis von umweltchemisch induzierten Proteinexpressionsveränderungen in den Herzen von Zebrafischembryonen angewendet werden kann.
Einleitung
Luftverschmutzung ist heute ein ernstes Umweltproblem, mit dem die Welt konfrontiert ist. Feinstaub (PM2.5),einer der wichtigsten Indikatoren für die Luftqualität, kann eine große Anzahl von Schadstoffen enthalten und in den Blutkreislauf gelangen, was die menschliche Gesundheit ernsthaft schädigt1. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass eine PM2.5-Exposition zu einem erhöhten Risiko für angeborene Herzfehler (KHK) führen kann2,3. Beweise aus Tierversuchen zeigten auch, dass PM2,5 eine abnormale Herzentwicklung bei Zebrafischembryonen und den Nachk....
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Protokoll
Wildtyp-Zebrafische (AB), die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom National Zebrafish Resource Center in Wuhan, China, bezogen. Alle hier beschriebenen Tierverfahren wurden von der Animal Care Institution der Ethikkommission der Soochow University überprüft und genehmigt.
1. PM2.5 Probenahme und Extraktion organischer Verbindungen
HINWEIS: PM2.5 wurde in einem städtischen Gebiet in Suzhou, China, vom 1. bis 7. August 2015 gesammelt, wie zuvorbeschrieben 5.
- Backen Sie 47 mm Quarzmembranfilter in einem 500 °C Schalldämpferofen für 2 h, um die organisc....
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Ergebnisse
Dieser Immunfluoreszenz-Assay ist eine empfindliche und spezifische Methode zur Messung von Proteinexpressionsänderungen in den Herzen von Zebrafischembryonen, die Umweltchemikalien ausgesetzt sind.
In dieser repräsentativen Analyse wurden Embryonen, die in Abwesenheit oder Anwesenheit des Antioxidans NAC pm2,5 ausgesetzt waren, auf das Vorhandensein von Herzfehlbildungen untersucht (Abbildung 1
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Diskussion
Obwohl Zebrafische ein ausgezeichnetes Wirbeltiermodell für die Untersuchung der kardialen Entwicklungstoxizität von Umweltchemikalien sind, ist es aufgrund der geringen Größe des Embryoherzes schwierig, genügend Protein für die Western-Blot-Analyse zu erhalten. Daher präsentieren wir eine empfindliche Immunfluoreszenzmethode zur Quantifizierung der Proteinexpressionsniveaus von DNA-Schadensbiomarkern in den Herzen von Zebrafischembryonen, die PM2,5ausgesetzt sind.
Während der Disse.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der National Nature Sciences Foundation of China (Förderkennzeichen: 81870239, 81741005, 81972999) und The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 8-OHdG Antikörper | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primärer Antikörper |
| Analysenwaage | Sartorius, China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio, Peking, China | SW3015 | Zur Blockierung |
| von DAPI | Abcam, USA | ab104139 | Zur nuklearen Gegenfärbung. |
| DMSO | Solarbio, Peking, China | D8371 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Olympus, Japan | IX73 | Zur Abbildung von Fluoreszenzsignalen/ |
| Ziege Anti-Kaninchen IgG Cy3 | Carlsbad, USA | CW0159 | Sekundärer Antikörper |
| Ziege Anti-Kaninchen IgG FITC | Carlsbad, USA | RS0003 | Sekundärer Antikörper |
| N-Acetyl-L-Cystein (NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbitalschüttler | QILINBEIER, China | TS-1 | |
| Paraformaldehyd | Sigma, China | P6148 | Stellen Sie 4% Paraformaldehyd zur Fixierung her. |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | HyClone, USA | SH30256.01 | 0,1 % Tween in PBS zum Waschen vorbereiten. |
| PM2.5-Probenehmer | TianHong, Wuhan, China | TH-150C | Für 24 Stunden ununterbrochene PM2,5-Probenahme. |
| Zirkulierendes Aquakultursystem | HaiSheng,Shanghai,China | Darin wurde der Zebrafisch gehalten. | |
| Soxhlet-Extraktor | ZhengQiao, Shanghai, China | BSXT-02 | Für die Extraktion organischer Komponenten. |
| Stereomikroskop | Nikon, Kanada | SMZ645 | Für die Herzdissektion von Zebrafischembryonen. |
| Tricain-Methansulfonat (MS222) | Sigma,China | E10521 | Zur Betäubung von Zebrafischembryonen |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γ H2AX Antikörper | Abcam, USA | ab26350 | Primärer Antikörper |
Referenzen
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C.,....
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Nachdrucke und Genehmigungen
