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Methodenartikel

Trennung von Follikulärzellen und Oozyten in Denrogarischen Follikel von Zebrafischen

8K Aufrufe

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DOI:

10.3791/62027

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18. April 2021

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1College of Life Sciences, Northwest Normal University, 2State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, 3Department of Bioscience, Tokyo University of Agriculture

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine einfache Methode zur Trennung von Follikelzellen und Eizellen in Zebrafisch-Ovarialfollikel vor, die Untersuchungen der Eierstockentwicklung bei Zebrafischen erleichtern.

Zusammenfassung

Zebrafische sind zu einem idealen Modell geworden, um die Eierstockentwicklung von Wirbeltieren zu untersuchen. Der Follikel ist die Grundeinheit des Eierstocks, die aus Eizellen und umgebenden Follikelzellen besteht. Es ist wichtig, sowohl Follikelzellen als auch Eizellen für verschiedene Forschungszwecke zu trennen, wie z. B. für die Primärkultur von Follikelzellen, die Analyse der Genexpression, die Oozytenreifung und die In-vitro-Fertilisation usw. Die herkömmliche Methode verwendet Zangen, um beide Fächer zu trennen, was mühsam, zeitaufwändig ist und hohe Schäden an der Eizelle hat. Hier haben wir eine einfache Methode etabliert, um beide Fächer mit einer gezogenen Glaskapillare zu trennen. Unter einem Stereomikroskop können Eizellen und Follikelzellen leicht durch Pipettieren in einer gezogenen feinen Glaskapillare getrennt werden (der Durchmesser hängt vom Follikeldurchmesser ab). Im Vergleich zur herkömmlichen Methode hat diese neue Methode eine hohe Effizienz bei der Trennung von Eizellen und Follikelzellen und hat geringe Schäden an den Eizellen. Noch wichtiger ist, dass diese Methode auf Follikel im Frühstadium angewendet werden kann, auch im Stadium der Prävitellogenese. Somit kann diese einfache Methode verwendet werden, um Follikelzellen und Eizellen von Zebrafischen zu trennen.

Einleitung

Zebrafisch ist ein wichtiger Modellorganismus für die Erforschung der Wirbeltierentwicklung und Physiologie. Der Zebrafisch kann als gutes Modell für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Eierstockentwicklungdienen 1,2,3. Viele Merkmale der Eierstockentwicklung sind während der Evolution von Fischen zu Säugetieren sehr erhalten1,2. Ähnlich wie die anderen Wirbeltiere haben Zebrafische Erwachsene asynchrone Eierstöcke, die Eierstockfollikel aller Entwicklungsstadien enthalten4. Der Follikel ist das grundlegende Fortpflanzungselement des Eierstocks. Der Follikel besteht aus der Eizelle, die von einer oder mehreren Schichten somatischer Zellen umgeben ist, die als Follikelzellen bezeichnet werden. Die Entwicklung von Follikel hängt von der bidirektionalen Kommunikation zwischen Eizellen und Follikelzellenab 5. Es ist wichtig, Follikelzellen und Eizellen von Eierstockfollikel für verschiedene Forschungszwecke wie Follikelzellprimärkultur, Genexpressionsanalyse, Eizellenreifung und In-vitro-Fertilisation zu trennen.

Herkömmliche Trennverfahren umfassen die mechanische Trennung durch Zangen und die enzymatische Verdauung6,7,8,9,10. Die mechanische Trennung durch Zangen ist jedoch zeitaufwändig und mühsam. Es wird auch die hohen Schäden an der Oozyte während der Trennung verursachen. Obwohl die Enzymverdauungsmethode einfach zu bedienen ist und eine kurze Zeit erfordert, sollten die Behandlungszeit und die Enzymkonzentration validiert werden, und die Integrität und Überlebensrate der isolierten Eizellen sind nicht ideal. Daher haben wir eine einfache Methode entwickelt, um beide Fächer in verschiedenen Entwicklungsstadien mit gezogenen Glaskapillarrohren zu trennen.

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Protokoll

Alle Verfahren, die in Fischversuchen durchgeführt werden, entsprechen den Vorschriften der Animal Experimentation Ethics Committee der Northwest Normal University.

1. Vorbereitungen

  1. Tiere
    1. Verwenden Sie erwachsene weibliche Zebrafische mit einer Körperlänge von 4-6 cm.
      HINWEIS: Wir haben Zebrafische von einem lokalen Markt verwendet.
    2. Halten Sie den Zebrafisch in einem zirkulierenden Wassersystem mit einem 14 h Licht und 10 h dunklen Zyklus bei etwa 28 °C.
    3. Füttern Sie Fisch zweimal täglich mit frisch geschlüpften Solegarnelen.
  2. Gezogene Glaskapillare
    1. Verwenden Sie eine 15 cm Glaskapillare und legen Sie ihren Kopf in einen Alkoholbrenner, um es zu erhitzen. Halten Sie ein Ende der Glaskapillare von Hand und halten Sie das andere Ende mit Zange.
    2. Nach dem Erhitzen 5-10 Sekunden, das Glas auf dem Feuer des Alkoholbrenners werden rot und weich. Dehnen Sie den Kopf der Glaskapillare mit Zangen, um die Kapillaröffnung mit dem erforderlichen Durchmesser zu machen.
      HINWEIS: Der Durchmesser hängt von den Follikeldurchmessern ab: prävitellogene (PV; ca. 0,30 mm Durchmesser), frühe vitellogene (EV; ca. 0,40 mm Durchmesser), mittelvitellogene (MV; ca. 0,50 mm Durchmesser), spät vitellogene (LV; ca. 0,60 mm Durchmesser) und ausgewachsen, aber unreif (FG; ca. 0,65 mm Durchmesser).
    3. Dehnen Sie die Öffnung der Glaskapillare auf den entsprechenden Durchmesser, der etwas kleiner ist als die Größe der abgetrennten Follikel. Die Glaskapillare mit einer Öffnung, die viel größer ist als die Größe der Eierstockfollikel, kann keine Trennung durchführen, aber die viel kleineren würden die Follikel während der Trennung brechen. Üben Sie die Dehnung der Glaskapillare mehrmals.
      HINWEIS: Die Heizzeit hängt von der Größe der Glaskapillare ab. Dehnen Sie die Glaskapillare nicht direkt auf das Feuer des Alkoholbrenners. Es wird die Glaskapillare brechen.
    4. Schneiden Sie die Glaskapillare mit einem Ampullenschneider und brechen Sie die Glaskapillare mit Zangen, um einen glatten Schnitt zu erhalten.
      HINWEIS: Eine scharfe oder gebrochene Öffnung der Glaskapillare würde die Follikel beschädigen.
    5. Mit einem 30 cm Kunststoffrohr eine 1 ml Pipettespitze mit einem Filterelement an einem Ende einlegen, die gezogene Glaskapillare am Ende der Pipette einlegen und eine 200-L-Pipettespitze an einem anderen Ende anschließen.

2. Trennung von Zebrafisch-Oozyten und Follikelzellen in verschiedenen Stadien

  1. Zerlegung des Zebrafisch-Ovarial
    1. Füllen Sie einen Eiskübel bis 4/5 voll mit Güllee und fügen Sie genügend Fischwasser hinzu, um Gülleis schweben zu lassen. Warten Sie 2-5 Minuten, überprüfen Sie die Wassertemperatur und stellen Sie sicher, dass die Temperatur zwischen 2-4 °C liegt.
    2. Anästhesisieren Sie erwachsene Weibchen, indem Sie Fische mindestens 2-5 Minuten in das Eiswasser legen, bis fische die Kiemenbewegung stoppen. Enthaupten Sie den Fisch, indem Sie das Rückenmark mit einer scharfen Schere abtrennen, um den Tod zu gewährleisten.
    3. Legen Sie den Fisch mit Zange auf die Sezierenplatte.
    4. Verwenden Sie sezierende Schere wie folgt zu schneiden. Sezieren Sie von der Kloake zu den Kiemen entlang der Mittellinie des Bauches. Von der Rückseite der Kloake schneiden. Von der vorderen Spitze auf die dorsale Seite schneiden. Entfernen Sie vorsichtig die Haut und Muskeln auf einer Seite des Körpers. Setzen Sie die inneren Organe aus und nehmen Sie den gesamten Eierstock mit Zangen heraus.
    5. Die Eierstöcke sofort in ein 100 mm großes Kulturgericht geben, das 60% Leibovitz's L-15 (L-15) Medium enthält.
  2. Isolierung von Eierstockfollikel
    HINWEIS: Das Staging-System, das wir angenommen haben, basiert auf der ursprünglichen Definition von Selman et al.4.
    1. Isoliert die Follikel verschiedener Stadien manuell mit einem Paar feiner Zangen, wie zuvor beschrieben8.
    2. Gruppieren Sie die Ovarialfollikel in die folgenden Stadien: PV-, EV-, MV-, LV- und FG-Stufen.
  3. Trennung von Follikelzellen und Eizelle von Ovarialfollikel
    1. Die Eierstockfollikel in verschiedenen Stadien in eine saubere Petrischale geben, die 60% L-15 Medium enthält.
    2. Mit der gezogenen Glaskapillare aus Schritt 1.2 die Follikel in die Glaskapillare 2-3 cm saugen und ausblasen.
      HINWEIS: Wenn der Öffnungsdurchmesser der Glaskapillaren angemessen ist, kann der Follikel durch Einmaleinatmen von der Oozyte getrennt werden.
      1. Wenn die follikelzellige Zellschicht fest an der Oozyte befestigt ist, wiederholen Sie 2-3 Mal, um eine vollständige Trennung zu erreichen. Vermeiden Sie mehrere Versuche, einen Follikel durch eine kleinere Kapillare zu zwingen, was den Follikel beschädigen würde.
        HINWEIS: Beim Einatmen und Ausblasen fällt die Follikelschicht ab und trennt sich von der Oozyte, und schließlich werden Follikelzellen und denudierte Eizellen getrennt (Abbildung 1).
    3. Pool die denuded, aber intakte Eizellen und sammeln Sie die überlebenden denuded Eizellen für weitere Assays.
    4. Um zu untersuchen, ob die Follikelzellen von intakten Follikel getrennt wurden, färben Sie die intakten Follikel und die abgetrennten Eizellen mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
      1. Fixieren Sie die Proben in 4% gepuffertem Paraformaldehyd bei Raumtemperatur (RT) für 1 h. Mehrmals mit PBS waschen.
      2. Stain von DAPI bei RT für 30 min. Mehrmals mit PBS gewaschen. Anzeigen und Fotografieren mit einem Fluoreszenzmikroskop (z.B. Leica DFC7000 T).
    5. Um die abgeschlossene Trennung zu bestätigen, fixieren Sie die intakten Follikel und getrennten Eizellen in 4% gepuffertem Paraformaldehyd über Nacht bei 4 °C und betten Sie das Gefriermedium (z. B. Leica) bei -25 °C ein.
      1. Schneiden Sie die festen Gewebe auf einem Mikrotom, und montieren Sie auf Glasrutschen.
      2. Waschen Sie die Abschnitte in PBS und visualisieren Sie die Zellkerne mit DAPI. Sehen und fotografieren Sie auf einem Fluoreszenzmikroskop.

3. In-vitro-Reifung (IVM) und In-vitro-Fertilisation (IVF)

HINWEIS: Das Verfahren von IVM von IVF wurde wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen 11,12,13befolgt.

  1. Bereiten Sie frische reifung Medium (+DHP Medium) vor Eierstock-Sektion von erwachsenen Zebrafisch Weibchen. Um das frische Reifungsmedium vorzubereiten, fügen Sie 9 ml des L-15-Mediums von Leibovitz, pH 9,0, auf 15 ml konische Rohre hinzu. Fügen Sie 10 l von 17-20-Dihydroxy-4 Pregne-3-ein (DHP) (5 mg/ml), 490 l dH2O und 500 l mit 10% Rinderserumalbumin (BSA) hinzu.
  2. Bereiten Sie Hanks Lösung und E3-Lösung im Voraus vor. Bereiten Sie Hanks' Lösung vor, wie von Baars et al.14beschrieben. E3 medium: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4und 1-5% Methylenblau vorbereiten.
  3. Durchführen Sie die Zerlegung des Zebrafisch-Ovarials und die Isolierung der Eierstockfollikel wie in Schritt 2.
  4. Sammeln Sie ausgewachsene Bühnenfollikel und verwenden Sie als unreife Eizellen. Für jeden erwachsenen weiblichen Zebrafisch können mindestens 150-200 ausgewachsene Bühnenfollikel isoliert werden. Wählen Sie die intakten und gesunden Follikel für IVM.
  5. Inkubieren Sie die ausgewachsenen Bühnenfollikel in +DHP Medium in 12-Well-Platten, regelmäßig überprüfen, um sicherzustellen, dass die Eizellen intakt bleiben. Entfernen Sie alle Lysing-Oozyten mit einer Pasteur-Pipette.
    HINWEIS: Während der Eizellenreifung werden die Eizellen zunehmend durchscheinend. Ein Großteil der Eizellen wird nach der Behandlung von DHP für 2 h durchscheinend. Dies kann unter einem Sezierenvonmikroskop mit Durchlichtoptik beobachtet werden.
  6. Entfernen Sie die äußersten Follikelzellen aus jeder ausgereiften Oozyte, wie in Schritt 2.3 beschrieben.
  7. Die denuded Oozyten auf eine Petrischale mit ein paar Tropfen Kulturmedium übertragen und zur Düngung überführen.
  8. Bereiten Sie die frische Spermienlösung mit Hoden vor, die von mindestens drei Männchen in 500 L der Hanks-Lösung seziert wurden. Setzen Sie die Spermienlösung auf Eis, wo sie ihre Befruchtungskraft bis zu 2-3 h halten kann.
  9. Fügen Sie 100 L Spermienlösung zu denuded & gereiften Eizellen auf einer Petrischale hinzu. Fügen Sie vorsichtig die Spermienlösung unter die Eier, und wirbeln Sie die Spermien und Eier zusammen mit einer Pipette Spitze.
  10. Sofort 1 ml E3-Mittellösung hinzufügen, um die Eier zu aktivieren und mit einer Pipettespitze wieder sanft Eier und Spermien zu wirbeln.
  11. Nach ca. 1 Minute Nachdüngung (mpf) die Platte mit E3-Mittellösung überfluten. Eine vollständige Chorionenexpansion kann innerhalb von 10-15 mpf beobachtet werden.
  12. Wählen Sie zwischen 35-45 mpf die Embryonen aus, die sich einer symmetrischen Spaltung in das 2-Zell-Stadium unterziehen und daher befruchtet werden. Entfernen Sie Embryonen, die sich keiner Zellspaltung unterziehen.
  13. Lassen Sie Embryonen in der Petrischale bei 28 °C entwickeln, mit einem Grenzwert von 80 Embryonen pro 10 cm Platte. Sehen und fotografieren Sie die Embryoentwicklung.

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Ergebnisse

Diese Methode kann verwendet werden, um Follikelzellen und Eizellen in verschiedenen Stadien der Eierstockfollikelentwicklung bei Zebrafischen zu trennen. Abbildung 1 zeigt die Trennung von Zebrafisch-Oozyten und Follikelzellen von Eierstockfollikel mit einem Kapillarglasrohr (Abbildung 1). Um zu untersuchen, ob die Follikelzellen von intakten Follikel getrennt waren, wurden die intakten Follikel und die abgetrennten Eizellen aus verschiedenen Follikelstadien vo...

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Diskussion

Wir beschreiben hier eine neuartige Methode zur einfachen und schnellen Trennung von Follikelzellen und Eizellen von Zebrafisch-Ovarialfollikel. Diese Methode hat gegenüber der herkömmlichen Methode mehrere Vorteile. Dazu gehört vor allem die stark erhöhte Trennungsfreundlichkeit mit hoher Effizienz und Wirksamkeit, da nur eine einzige und externe Manipulation erforderlich ist. Dieser Punkt erhöht die Anwendbarkeit für Forscher, die nicht gut in der mikroskopischen Anatomie sind. Nach unserer Erfahrung kann man Follikelz...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Forschungsarbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 und 31560334] unterstützt, einem Gastwissenschaftlerprojekt, das vom China Scholarship Council und dem Fundus des State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05] unterstützt wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
17α,20β-DHPCayman16146-5 (5 mg)
24-Well-PlatteCorning3524
AmpullenschneiderAS ONE5-124-22 1 Beutel (100 Stück)
Wasserfreies Na2HPO4Kaixin Chemical500 g
SalzgarneleHongjie250 g
CaCl2Beichen Fangzheng500 g
KulturschaleBiosharpBS-90-D (10PCS/PK)
DAPISolarbioS2110 (25mL)
PräpariermikroskopZEISSStemi 305
PräparierzangeVETUSHRC30
PräparierschereKefu160 mm 
Fluoreszenz-Stereomikroskop LeicaM205C
GlaskapillareIWAKIIK-PAS-5P (200 Stück/PACKUNG)
Hoechst 33342SolarbioC0031 (1 mg)
KClBeichen Fangzheng500 g
KH2PO4Kaixin Chemical500 g
Leibovitz' s L-15 mediumGibco41300-039 (10fach; 1L)
MgSO4• 7H2OBeichen Fangzheng500 g
MikropipettenspitzenAxygenMCT-150-C
NaClBeichen Fangzheng500 g
NaHCO3Beichen Fangzheng500 g
Penicilia-StreptomyciaGibco#15140122 (100 mL)
StereomikroskopZEISSEntdecken.v20

Referenzen

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