Der Fluoreszenz-Leckage-Assay ist eine einfache Methode, die die Untersuchung von Peptid/Membran-Wechselwirkungen ermöglicht, um ihre Beteiligung an mehreren biologischen Prozessen und insbesondere die Fähigkeit von zelldurchdringenden Peptiden zu verstehen, Phospholipide-Doppelschichten während eines direkten zellulären Translokationsprozesses zu stören.
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Methodenartikel
Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zelldurchdringende Peptide (CPPs) sind definiert als Träger, die in der Lage sind, die Plasmamembran zu durchqueren und eine Ladung in Zellen zu übertragen. Eines der wichtigsten gemeinsamen Merkmale, die für diese Aktivität erforderlich sind, ergab sich aus den Wechselwirkungen von CPPs mit der Plasmamembran (Lipide) und insbesondere mit Komponenten der extrazellulären Matrix der Membran selbst (Heparansulfat). Unabhängig von der direkten Translokation oder der endozytoseabhängigen Internalisierung sind Lipiddoppelschichten sowohl auf Der Ebene der Plasmamembran als auch auf der Ebene des intrazellulären Verkehrs (endosomale Vesikel) am Internalisierungsprozess beteiligt. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die verschiedenen Schritte der Formulierung, Reinigung, Charakterisierung und Anwendung eines großen unilamellaren Vesikels (LUVs) beschreibt, um eine mögliche CPP-Membrandestabilisierung / -interaktion zu erkennen und ihre Rolle im Internalisierungsmechanismus zu adressieren. LUVs mit einer Lipidzusammensetzung, die den Plasmamembrangehalt widerspiegelt, werden erzeugt, um sowohl einen Fluoreszenzfarbstoff als auch einen Quencher zu verkapseln. Die Zugabe von Peptiden im extravesikulären Medium und die Induktion von Peptid-Membran-Wechselwirkungen auf den LUVs könnten somit dosisabhängig eine signifikante Erhöhung der Fluoreszenz induzieren, die eine Leckage aufdeckt. Hier werden Beispiele mit den kürzlich entwickelten Tryptophan (W)- und Arginin (R)-reichen amphipathischen Peptiden (WRAPs) geliefert, die eine schnelle und effiziente siRNA-Abgabe in verschiedenen Zelllinien zeigten. Schließlich werden die Art dieser Wechselwirkungen und die Affinität zu Lipiden diskutiert, um die Membrantranslokation und/oder den endosomalen Entweicher zu verstehen und zu verbessern.
Einleitung
Nach ihrer Entdeckung in den neunziger Jahren wurden zelldurchdringende Peptide (CPPs) entwickelt, um eine effiziente zelluläre Lieferung von Ladungen durch die Plasmamembran zu fördern1,2. CPPs sind in der Regel kurze Peptide, im Allgemeinen 8 bis 30 Aminosäuren, die eine Vielzahl von Ursprüngen haben. Sie wurden zunächst als "direkt translozierende" Träger definiert, was bedeutet, dass sie in der Lage waren, die Plasmamembran zu überqueren und eine Ladung in Zellen zu übertragen, unabhängig von einem endozytotischen Weg, weder Energiebedarf noch Rezeptorbeteiligung. Weitere Untersuchungen ergaben jedoch, das....
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Protokoll
1. Vorbereitung großer unilamellarer Vesikel (LUVs)
- Bereiten Sie LUVs für ihre Verwendung als Zellmembran-Nachahmungen für die Fluoreszenzleckage-Assay vor.
- Mischen Sie mit einer Hamilton Glasspritze Phosphatidylcholin (DOPC, 786,11 g/mol), Sphingomyelin (SM, 760,22 g/mol) und Cholesterin (Chol, 386,65 g/mol) im Molverhältnis 4:4:2. Die Lipidlösung wird aus einer Stammlösung jedes Lipids gewonnen, das in einem Methanol/Chloroform-Lösungsmittel (3/1; Volumen/Volumen) bei 25 mg/ml in einem 25-ml-Glas-Rundkolben gelöst ist. Basierend auf 4 μmol DOPC, 4 μmol SM und 2 μmol Chol wird die Lipidlösung aus Stammlösung durch Mischen von 126 μL, 117 μL bzw. 3....
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Ergebnisse
Das Prinzip des Fluoreszenzleckage-Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Im Detail werden große einlamellare Vesikel (LUVs), die einen fluoreszierenden Farbstoff und einen Quencher (kein Fluoreszenzsignal) verkapseln, mit dem biomolekularen Wirkstoff behandelt. Durch die Wechselwirkung des Peptids mit Lipidmembranen, die Membranpermeabilität, Reorganisation oder sogar Ruptur implizieren könnte, werden der Fluoreszenzfarbstoff und der Quencher aus den LUVs fr.......
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Diskussion
Der vorgestellte Fluoreszenzlecktest ist eine einfache und schnelle Methode zur Behandlung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid. Einfach zu machen, ermöglicht es auch einen indirekten Vergleich zwischen verschiedenen membranwechselwirkenden Peptiden oder anderen membraninteragierenden Molekülen. In Bezug auf kritische Schritte des Protokolls, da dieser Assay relative Werte zwischen der Baseline (LUVs allein) und der maximalen Fluoreszenzfreisetzung (Triton-Bedingung) liefert, bewerten wir normaler.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Autoren danken Emilie Josse für die kritische Begutachtung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der Stiftung "La Ligue contre le Cancer", der "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" und dem "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 25-ml-Glaskolben mit rundem Boden | Pyrex | ||
| 8-Aminonaphthalin-1,3,6-trisulfonsäure, Dinatriumsalz (ANTS) | Invitrogen | A350 | Vor Licht schützen |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterin | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (Dioleoylphosphatidylcholin) | Avanti Polar | 850375P | Vor Luft schützen |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µ L Glasspritze | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| Säule für Flüssigkeitschromatographie | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore Polycarbonat-Membran (0,1 µ m Porengröße, 25 mm Durchmesser) | Whatman | 800309 | |
| Küvette aus Polystyrol, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| Polystyrol-Semi-Mikroküvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-Xylol-Bispyridiniumbromid (DPX) | Invitrogen | X1525 | Vor Licht schützen |
| Quarz-Fluoreszenzküvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| Rotavapor-System | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 Harz | Amersham | 17-0042-01 | |
| Natriumazid (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Ultraschallbad USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Vor Luft schützen |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
Referenzen
- Langel, U. Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , CRC Press. (2006).
- Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005). ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
