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Methodenartikel

Echtzeit-Beurteilung der Rückenmarksmikroperfusion in einem Schweinemodell der Ischämie/Reperfusion

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DOI:

10.3791/62047

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10. Dezember 2020

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1Department of Anesthesiology, Center of Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2University Department for Vascular Surgery and Department of Operative Medicine, Medical University of Innsbruck, 3Department of Medical Biometry and Epidemiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Vascular Medicine, University Heart and Vascular Center Hamburg (UHZ), 5Department of Cardiology, Rostock University Medical Center, 6University Department for Cardiac Surgery, Heart Center Leipzig

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Mikrozirkulation des Rückenmarks spielt eine zentrale Rolle bei Rückenmarksverletzungen. Die meisten Methoden erlauben keine Echtzeitbewertung der Mikrozirkulation des Rückenmarks, die für die Entwicklung von mikrozirkulationsorientierten Therapien unerlässlich ist. Hier schlagen wir ein Protokoll unter Verwendung von Laser-Doppler-Flow-Nadelsonden in einem großen Tiermodell der Ischämie / Reperfusion vor.

Zusammenfassung

Rückenmarksverletzungen sind eine verheerende Komplikation der Aortenreparatur. Trotz entwicklungen zur Prävention und Behandlung von Rückenmarksverletzungen ist ihre Inzidenz immer noch beträchtlich hoch und beeinflusst daher das Patientenergebnis. Die Mikrozirkulation spielt eine Schlüsselrolle bei der Gewebeperfusion und Sauerstoffversorgung und ist oft von der Makrohämodynamik getrennt. Daher ist die direkte Evaluierung der Rückenmarksmikrozirkulation essentiell für die Entwicklung von mikrozirkulationsgezielten Therapien und die Evaluierung bestehender Ansätze in Bezug auf die Mikrozirkulation des Rückenmarks. Die meisten Methoden bieten jedoch keine Echtzeitbewertung der Mikrozirkulation des Rückenmarks. Ziel dieser Studie ist es, ein standardisiertes Protokoll für die mikrozirkulatorische Auswertung des Rückenmarks in Echtzeit mit Laser-Doppler-Nadelsonden zu beschreiben, die direkt in das Rückenmark eingeführt werden. Wir verwendeten ein Schweinemodell der Ischämie / Reperfusion, um eine Verschlechterung der Mikrozirkulation des Rückenmarks zu induzieren. Zusätzlich wurde eine fluoreszierende Mikrosphären-Injektionstechnik verwendet. Anfangs wurden die Tiere betäubt und mechanisch beatmet. Danach wurde eine Laser-Doppler-Nadelsondeneinführung durchgeführt, gefolgt von der Platzierung der Zerebrospinalflüssigkeitsdrainage. Eine mediane Sternotomie wurde für die Exposition der absteigenden Aorta durchgeführt, um eine Aortenkreuzklemmung durchzuführen. Ischämie/Reperfusion wurde durch supra-zöliakie-Aorten-Kreuzklemmung für insgesamt 48 min induziert, gefolgt von Reperfusion und hämodynamischer Stabilisierung. Der Laser-Doppler-Fluss wurde parallel zur makrohämodynamischen Auswertung durchgeführt. Darüber hinaus wurde eine automatisierte Zerebrospinalflüssigkeitsdrainage eingesetzt, um einen stabilen Zerebrospinaldruck aufrechtzuerhalten. Nach Abschluss des Protokolls wurden Tiere geopfert und das Rückenmark für histopathologische und Mikrosphärenanalysen geerntet. Das Protokoll zeigt die Machbarkeit von Rückenmarks-Mikroperfusionsmessungen mit Laser-Doppler-Sonden und zeigt eine deutliche Abnahme während der Ischämie sowie der Erholung nach reperfusion. Die Ergebnisse zeigten ein vergleichbares Verhalten wie die Fluoreszenzmikrosphärenbewertung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses neue Protokoll ein nützliches Großtiermodell für zukünftige Studien mit Echtzeit-Rückenmarksmikroperfusionsbewertung bei Ischämie/ Reperfusionsbedingungen darstellen könnte.

Einleitung

Eine durch Ischämie/Reperfusion (SCI) induzierte Rückenmarksverletzung ist eine der verheerendsten Komplikationen der Aortenreparatur im Zusammenhang mit einem reduzierten Ergebnis1,2,3,4. Zu den aktuellen Präventions- und Behandlungsmöglichkeiten für SCI gehören die Optimierung makrohämodynamischer Parameter sowie die Normalisierung des Liquordrucks (CSP) zur Verbesserung des Rückenmarksperfusionsdrucks2,5,6,7,8,9. Trotz der Durchführung dieser Manöver liegt die Inzidenz von SCI immer noch zwischen 2% und 31%, abhängig von der Komplexität der Aortenreparatur10,11,12.

In jüngster Zeit hat die Mikrozirkulation erhöhte Aufmerksamkeit erregt13,14. Die Mikrozirkulation ist der Bereich der zellulären Sauerstoffaufnahme und des Stoffwechselaustauschs und spielt daher eine entscheidende Rolle für die Organfunktion und die zelluläre Integrität13. Eine Beeinträchtigung des mikrozirkulatorischen Blutflusses ist eine wichtige Determinante der Gewebeischämie im Zusammenhang mit einer erhöhtenMortalität 15,16,17,18,19. Eine Beeinträchtigung der Mikrozirkulation des Rückenmarks ist mit einer verminderten neurologischen Funktion und dem Ergebnis20,21,22,23 verbunden. Daher ist die Optimierung der Mikroperfusion zur Behandlung von SCI ein vielversprechender Ansatz. Persistenz mikrozirkulatorischer Störungen, trotz makrozirkulatorischer Optimierung, wurde beschrieben26,27,28,29. Dieser Verlust der hämodynamischen Kohärenz tritt häufig unter verschiedenen Bedingungen auf, einschließlich Ischämie / Reperfusion, was die Notwendigkeit einer direkten mikrozirkulatorischen Bewertung und mikrozirkulationsorientierter Therapienunterstreicht 26,27,30.

Bisher haben nur wenige Studien Laser-Doppler-Sonden zur Echtzeitbewertung des mikrozirkulatorischen Verhaltens des Rückenmarks verwendet20,31. Bestehende Studien haben häufig Mikrosphäreninjektionstechniken verwendet, die durch intermittierende Anwendung und Post-mortem-Analyse begrenzt sind32,33. Die Anzahl der verschiedenen Messungen mit Mikrosphäreninjektionstechnik ist durch die Verfügbarkeit von Mikrosphären mit unterschiedlichen Wellenlängen begrenzt. Darüber hinaus ist im Gegensatz zu Laser-Doppler-Techniken eine Echtzeitbewertung der Mikroperfusion nicht möglich, da für diese Methode eine postmortale Gewebebearbeitung und -analyse erforderlich ist. Hier stellen wir ein experimentelles Protokoll zur Echtzeitbewertung der Rückenmarksmikrowelle in einem porcinen Großtiermodell der Ischämie/Reperfusion vor.

Diese Studie war Teil eines großen Tierprojekts, das eine randomisierte Studie, in der der Einfluss von Kristalloiden vs. Kolloiden auf die Mikrozirkulation bei Ischämie/Reperfusion verglichen wurde, sowie eine explorative randomisierte Studie über die Auswirkungen von Flüssigkeiten vs. Vasopressoren auf die Mikroperfusion des Rückenmarks kombinierte. Die 2-Punkt-Kalibrierung der Durchflusssonde sowie die Druckspitzenkatheterkalibrierung wurden zuvor beschrieben34. Zusätzlich zu dem berichteten Protokoll wurden fluoreszierende Mikrokugeln für die Messung der Rückenmarksmikroperfusion verwendet, wie zuvor beschrieben, wobei 12 Proben von Rückenmarksgewebe für jedes Tier verwendet wurden, wobei die Proben 1-6 das obere Rückenmark und 7-12 das untere Rückenmark35,36 darstellten. Die Mikrosphäreninjektion wurde für jeden Messschritt nach Abschluss der Laser-Doppler-Aufnahmen und der makrohämodynamischen Auswertung durchgeführt. Die histopathologische Bewertung wurde mit dem Kleinman-Score durchgeführt, wie zuvor beschrieben37.

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Protokoll

Die Studie wurde von der Regierungskommission für die Pflege und Verwendung von Tieren der Stadt Hamburg genehmigt (Aktenzeichen 60/17). Die Tiere wurden gemäß dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (NIH-Publikation Nr. 86-23, überarbeitet 2011) sowie den Empfehlungen und Experimenten der FELASA nach den ARRIVE-Richtlinien24,25gepflegt. Diese Studie war eine akute Studie, und alle Tiere wurden am Ende des Protokolls eingeschläfert.

ANMERKUNG: Die Studie wurde an sechs drei Monate alten männlichen und weiblichen Schweinen (Deutsche Landrasse) mit einem Gewicht von etwa 40 kg durchgeführt. Die Tiere wurden mindestens 7 Tage vor den Versuchen in die Tierpflegeeinrichtungen gebracht und gemäß den Tierschutzempfehlungen untergebracht. Die Tiere wurden ad libitum mit Futter und Wasser versorgt und ihr Gesundheitszustand regelmäßig vom zuständigen Tierarzt beurteilt. Vor den Experimenten wurde eine Fastenzeit von 12 h eingehalten. Der gesamte Versuchsablauf und Umgang mit den Tieren wurde vom zuständigen Tierarzt überwacht.

1. Anästhesie-Induktion und Aufrechterhaltung der Anästhesie

  1. Zur Anästhesieinduktion und Aufrechterhaltung der Anästhesie die Tiere prämedizieren und tief sedieren sie mit einer intramuskulären Injektion, gefolgt von intravenösen Injektionen, falls erforderlich, um eine endotracheale Intubation durchzuführen. Danach induzieren und erhalten Sie die Anästhesie durch Verwendung einer Kombination eines flüchtigen Anästhesiemittels mit einer kontinuierlichen Opioidanwendung, die durch eine zusätzliche Opioid-Bolusinjektion ergänzt wird.
  2. Intramuskuläre Injektionen von Ketamin 20 mg·kg-1, Azaperon 4 mg·kg-1und Midazolam 0,1 mg·kg-1 zur Prämedikation und Sedierung durchführen.
  3. Legen Sie einen Venenkatheter in eine Ohrvene, sichern Sie die richtige Fixierung und beurteilen Sie die Funktionalität durch schnelle Anwendung von 10 ml Kochsalzlösung.
  4. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf eine Wärmedecke, um Wärmeverlust zu vermeiden.
  5. Richten Sie eine grundlegende Überwachung mit Elektrokardiographie (EKG) und Pulsoximetrie ein, um den kardiopulmonalen Zustand der Tiere zu überwachen, und schließen Sie sie an die grundlegende Überwachungshardware an.
  6. Verabreichen Sie 15 l·min-1 Sauerstoff über eine schweineförmige Maske zur Voroxygenierung.
  7. Injizieren Sie intravenöse Boli von 0,1 mg·kg-1 von 1% Propofol, falls erforderlich, und führen Sie eine endotracheale Intubation durch.
  8. Sichern Sie die korrekte Platzierung mit End-Tidal-Capnographie und Auskultation, verabreichen Sie 0,1 mg • kg-1 Pancuronium und stellen Sie eine ordnungsgemäße Fixierung des Endotrachealtubus sicher.
  9. Etablieren Sie eine volumengesteuerte Beatmung unter Verwendung von Tidalvolumina von10 ml·kg -1 Körpergewicht-1, einempositiven endspiratorischen Druck von 10 cmH 2 O undeinemAnteil an inspiriertem Sauerstoff (FiO2) von 0,3 mit dem Anästhesiegerät. Stellen Sie die Beatmungsfrequenz ein, um eine endexspiratorische Kohlendioxidspannung (etCO2)von 35-45 mmHg aufrechtzuerhalten.
  10. Führen Sie einen Magenschlauch ein, saugen Sie Magenflüssigkeiten ab, fixieren Sie den Schlauch richtig und verbinden Sie ihn mit einem Auffangbeutel. Schließen Sie vorsichtig die Augen des Tieres, um eine Trockenheit der Augen während der Anästhesie zu verhindern.
  11. Aufrechterhaltung der Anästhesie durch kontinuierliche Infusion von Fentanyl (10 μg·kg-1·h-1) und Sevofluran (3,0% abgelaufene Konzentration, vom Dampf abgegeben). Stellen Sie ein angemessenes Anästhesieniveau durch sorgfältige Beobachtung der Vitalfunktionen und Beatmungsparameter sowie durch das Fehlen von Bewegungen während des gesamten Protokolls sicher, wobei besonderes Augenmerk auf die Phasen des chirurgischen Reizes zu legen ist. Geben Sie zusätzliche Bolusdosen von Fentanyl (50 μg) an, wenn Anzeichen von Schmerzen oder Leiden vorliegen.
    HINWEIS: Stellen Sie die Anwesenheit von Forschern sicher, die während des gesamten Eingriffs Erfahrung in der Tieranästhesie haben, und verwenden Sie die Aufsicht durch einen erfahrenen Tierarzt, um eine ordnungsgemäße Anästhesie sicherzustellen.
  12. Verabreichen Sie eine Baseline-Infusionsrate von 10 ml·kg-1·h-1 balancierten Kristalloiden, um Flüssigkeitsverluste während der Anästhesie, der chirurgischen Vorbereitung und der Durchführung des experimentellen Protokolls auszugleichen. Verwenden Sie einen Flüssigkeitswärmer, um Wärmeverlust zu vermeiden.
  13. Reinigen Sie die Haut des Schweins vorsichtig mit Seifenwasser. Verwenden Sie eine Hautdesinfektionslösung, die Povidon-Jod enthält, um die Hautkontamination zu verringern. Verwenden Sie sterile Handschuhe für chirurgische Vorbereitungen. Tragen Sie 300 mg Clindamycin als antimikrobielle Prophylaxe auf und wiederholen Sie die Dosierung nach 6 h.

2. Platzierung der Sonde

  1. Platzieren Sie das Tier in der rechten Seitenposition und beugen Sie den Rücken des Tieres, um den Raum zwischen den Wirbeln zu erweitern.
  2. Chirurgisch den paravertebralen Bereich zur Vorbereitung von Dornfortsätzen und Wirbelbögen freilegen (Abbildung 1A).
  3. Legen Sie einen vaskulären 14 G peripheren Venenkatheter Paramedian in das Rückenmark auf Höhe des Brustwirbels (Th) 13/14 oder des Lendenwirbels (L) 1/2 zwischen zwei Wirbelbögen (Abbildung 1B).
  4. Entfernen Sie die Nadel, führen Sie die Laser/Doppler-Nadelsonde über den Venenkatheter ein (Abbildung 1C) und testen Sie die Signalqualität durch Verbindung mit der dafür vorgesehenen Hard- und Software. Stellen Sie sicher, dass ein stabiles Signal mit mäßiger Pulsatilität vorliegt.
  5. Befestigen Sie die Sonde vorsichtig mit Nähten (Abbildung 1D) und verwenden Sie eine Polsterung, um eine Dislokation oder ein Knicken der Sonde zu verhindern.
  6. Für die perkutane Platzierung der Zerebrospinalflüssigkeitsdrainage zur Messung und Kontrolle des Zerebrospinaldrucks identifizieren Sie das Niveau von L 4/5 oder L 5/6, punktieren Sie die Haut und den subkutanen Raum mit der Introducer-Nadel und entfernen Sie die Inlay-Nadel.
  7. Legen Sie eine mit Kochsalzlösung gefüllte Spritze auf die Nadel und führen Sie die Nadel vorsichtig mit konstantem Druck auf die flüssigkeitsgefüllte Spritze ein.
  8. Sobald ein Widerstandsverlust als Beweis für die Epiduralposition empfunden wird, führen Sie die Inlay-Nadel wieder ein und führen Sie die Nadel 2-3 mm weiter ein, um die Dura mater zu stechen und die Inlay-Nadel zu entfernen.
  9. Überprüfen Sie die intrathekale Position durch schnelles Tropfen der klaren Flüssigkeit. Führen Sie die Drainage bis zu einer Tiefe von 20 cm ein, befestigen Sie den Luer-Lock-Adapter und überprüfen Sie die Position durch sorgfältiges Absaugen der Flüssigkeit.
  10. Fixieren Sie die Drainage vorsichtig mit Nähten und verbinden Sie sie mit dem Drainagesystem der Zerebrospinalflüssigkeit.
  11. Legen Sie den Schädel hinter dem linken Ohr frei und führen Sie mit einem 6-mm-Bohraufsatz vorsichtig eine Bohrlochtrepanation der Haut durch.
  12. Führen Sie eine zweite Laser-Doppler-Sonde direkt in das Gehirn ein. Befestigen Sie die Sonde vorsichtig mit Nähten und testen Sie die Signalqualität durch Anschluss an die dafür vorgesehene Hard- und Software. Stellen Sie auch hier sicher, dass ein stabiles Signal mit mäßiger Pulsatilität vorliegt.
  13. Trennen Sie alle Sonden, legen Sie das Tier vorsichtig in Rückenlage, um eine nicht betroffene Sondenposition zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass mindestens 4-5 Forscher dieses Manöver durchführen.
  14. Schließen Sie die Sonden wieder an und überprüfen Sie die Signalqualität erneut.
  15. Verbinden Sie die Ausgangskanäle der Laser-Doppler-Hardware mit dem Verstärker und der synchronen Erfassungshardware und -software, um zusätzlich den Laser/Doppler-Fluss gleichzeitig mit makrohämodynamischen Signalen aufzuzeichnen.
  16. Kalibrieren Sie den Flussstrom nach Einheit (PU) mit 2-Punkt-Kalibrierung.
    1. Drücken Sie die Eingabetaste, um das Menü zu öffnen und die Einstellung für den analogen Ausgang auszuwählen.
    2. Verwenden Sie den angezeigten Umrechnungsfaktor (5,0 V = 1000 PU), um Flux mit 2-Punkt-Kalibrierung für die Verwendung mit der synchronen Erfassungssoftware zu kalibrieren.
    3. Wählen Sie "Zurück", um zum vorherigen Menü zurückzukehren, und wählen Sie "Messung", um mit der Messung fortzufahren.
    4. Öffnen Sie die Software für die synchrone Erfassung. Wählen Sie im Menü Setup die Option Null für alle Eingaben aus. Verbinden Sie alle Eingänge mit den verwendeten Geräten und Sonden.
    5. Führen Sie eine 2-Punkt-Kalibrierung für Flux durch, indem Sie auf das Dropdown-Menü des Flux-Kanalsklicken. Wählen Sie 2-Punkt-Kalibrierung. Stellen Sie Einheitenumrechnung auf ein und wählen Sie BPU als Einheiten aus. Für Punkt 1setzen Sie 0 V auf 0 BPU. Für Punkt 2stellen Sie 5,0 V auf 1000 BPU ein. Wählen Sie eingestellte Einheiten für alle und neue Daten aus. Drücken Sie OK, um das Menü zu schließen.
  17. Beginnen Sie mit der kontinuierlichen Zerebrospinalflüssigkeitsdrainage mit einem Zieldruck von 10 mmHg und einem Drainagevolumen von 20 mL·h-1.

3. Katheterplatzierung

  1. Legen Sie beide Oberschenkelarterien frei.
  2. Ligatieren Sie den distalen Teil der rechten Oberschenkelarterie, verschließen Sie vorübergehend das proximale Lumen der Arterie mit einer Gefäßschleife, führen Sie einen 2 mm langen Schnitt des Gefäßes mit einer Potts-Schere durch und führen Sie den Führungsdraht ein.
  3. Führen Sie den Führungsdraht weiter ein, um ein widerstandsfreies Einführen zu gewährleisten und ein Knicken des Drahtes zu vermeiden. Führen Sie den Katheter über den Draht ein.
  4. Fixieren Sie den Katheter mit Nähten.
  5. Stellen Sie die korrekte Position durch Aspiration des arteriellen Blutes sicher, verifiziert mit Blutgasanalyse und arterieller Signalmessung nach ordnungsgemäßer Verbindung mit dem Blutdruck und transkardiopulmonaler Überwachung Hard- und Software.
  6. Platzieren Sie eine 5-mm-Durchflusssonde auf der linken Oberschenkelarterie und testen Sie die Signalqualität durch Anschluss an den Durchflussmesser.
  7. Schließen Sie beide Leisten mit Nähten.
  8. Legen Sie die rechte Halsschlagader sowie die richtige innere Halsvene frei, um 8 Fr. Introducer-Hüllen zu platzieren.
  9. Bei der Katheterplatzierung ist die gleiche Vorgehensweise wie in den Abschnitten 3.2-3.4 beschrieben vorzugehen.
  10. Verbinden Sie das Seitenlumen der Carotis-Introducer-Hülle mit der grundlegenden Drucküberwachungs- und pulmonalen Thermodilutionshardware für die arterielle Druckmessung.
  11. Führen Sie einen Druckspitzenkatheter in die aufsteigende Aorta ein und überprüfen Sie die Position durch Anschluss an den Verstärker und synchrone Erfassungs hard- und software.
  12. Legen Sie einen Swan-Ganz-Lungenarterienkatheter über die Venenscheide in die Lungenarterie, indem Sie den Ballon mit Luft in 20 cm Tiefe aufblasen und vorsichtig einführen, bis ein Keildruck in der hämodynamischen Kurve zu sehen ist. Entlüften Sie den Ballon und ziehen Sie den Katheter 2 cm zurück. Gewährleisten Sie eine zufriedenstellende Signalqualität des Lungenarteriendrucks. Schließen Sie die Thermistoren an die grundlegende Drucküberwachungs- und pulmonale Thermodilutionshardware an.
  13. Verwenden Sie die sonographische Anleitung für die perkutane Platzierung eines 12 Fr. 5-Lumen Zentralvenenkatheters zur Medikamentenverabreichung und zentralvenösen Druckmessung in die äußere rechte Jugularvene. Verwenden Sie den 6-Stufen-Ansatz für die sonographische Platzierung38
  14. Verbinden Sie das distale Lumen des Katheters mit der Blutdruck- und transkardiopulmonalen Überwachungsfest- und -software. Schalten Sie alle Medikamente und Infusionen auf den zentralen Venenkatheter um. Verwenden Sie verschiedene Lumen für Analgetika, Flüssigkeiten und Katecholamine und sparen Sie das große Lumen für die Verabreichung von Kolloiden während der Volumenbelastungsschritte.

4. Chirurgische Vorbereitung

  1. Führen Sie eine Mini-Laparotomie durch, mobilisieren Sie die Blase, führen Sie einen Foley-Katheter für die Urindrainage ein, blasen Sie den Ballon mit Kochsalzlösung auf und fixieren Sie den Katheter mit Beutelnähten.
  2. Verbinden Sie den Katheter mit einem Urinsammelbeutel, der die Urinmenge in ml anzeigt.
  3. Erhöhen Sie die FiO2 auf 1,0 und verabreichen Sie erneut 0,1 mg·kg-1 Pancuronium intravenös.
  4. Führen Sie eine mediane Sternotomie durch, indem Sie Elektrokauter zur Vorbereitung auf das Brustbein verwenden. Sezieren Sie das Brustbein vorsichtig vom umgebenden Gewebe. Führen Sie eine retrosternale Platzierung einer Kompresse durch, um Verletzungen zu vermeiden.
  5. Stoppen Sie die Belüftung und teilen Sie den Knochen mit einer oszillierenden Säge. Belüften Sie weiter und reduzieren Sie FiO2 auf 0,3. Verwenden Sie Elektrokauterie, um Blutungen zu reduzieren, und versiegeln Sie das Brustbein mit Knochenwachs.
  6. Mobilisieren Sie vorsichtig die Spitze der linken Lunge und teilen Sie den linken lateralen Teil des Zwerchfells, um die chirurgische Exposition zu erleichtern.
  7. Setzen Sie die absteigende Aorta proximal dem Zöliakiestamm durch sanftes Zurückziehen der linken Lunge aus, um eine ungestörte Beatmung zu gewährleisten und ein Trauma der linken Lunge zu vermeiden (Abbildung 2A) und teilen Sie das umgebende Gewebe (Abbildung 2B). Verabreichen Sie 7 ml·kg-1 Hydroxyethylstärkekolloid, wenn eine hämodynamische Stabilisierung erforderlich ist.
  8. Legen Sie einen Overhold um die absteigende Aorta, um eine ordnungsgemäße Belichtung zu gewährleisten (Abbildung 2C).
  9. Befestigen Sie eine Strömungssonde um die absteigende Thoraxaorta (Abbildung 2D). Sicherstellung der richtigen Signalqualität durch Anschluss an das Durchflussmodul und synchrone Erfassungs hard- und software. Verwenden Sie Kontaktgel, um die Signalqualität bei Bedarf zu verbessern.
  10. Befestigen Sie eine Gefäßschlaufe um die absteigende Aorta, distal zur Strömungssonde, um den Bereich der Aortenkreuzklemmung zu markieren.

5. Bewertung und Datenerfassung

  1. Nullen Sie alle Katheter und Füllstandskatheter mit flüssigkeitsgefüllten Leitungen, die auf der rechten Vorhofebene platziert sind.
  2. Platzieren Sie Nadel-EKG-Elektroden und verbinden Sie diese mit der synchronen Erfassungs-Hard- und Software.
  3. Die Beurteilung der transkardiopulmonalen Thermodilution sowie Aortenfluss- und Druckmessungen wurden zuvor beschrieben 34.
  4. Führen Sie für die Messung des Herzzeitvolumens mit Hilfe der Thermodilution der Lungenarterien 3 Injektionen mit 10 ml kalter Kochsalzlösung durch und notieren Sie sich den Mittelwert, der von der grundlegenden Überwachungshardware angezeigt wird.
  5. Starten Sie die Laser-Doppler-Software, indem Sie einfach Startdrücken, und setzen Sie für jeden Messschritt eine Markierung, indem Sie die Schritte sorgfältig als M0 bis M5kennzeichnen.

6. Experimentelles Protokoll

  1. Führen Sie Baseline-Messungen (M0) durch.
  2. Durchführung der hämodynamischen Optimierung unter Verwendung von Volumenbeladungsschritten von 7 ml·kg-1 Hydroxyethylstärkekolloid. Führen Sie jeden Volumenladeschritt über 5 Minuten mit Druckinfusionen durch. Nach Abschluss jedes Volumenladeschritts 5 Minuten für die Äquilibrierung einplanen. Beginnen Sie mit der Volumenbelastung, bis der Anstieg des Herzzeitvolumens <15% beträgt.
  3. Wiederholungsmessungen (M1) nach Abschluss der hämodynamischen Optimierung.
  4. Induzieren Sie Ischämie / Reperfusion für insgesamt 48 Minuten supra-zöliakie-Aorten-Kreuzklemmung, indem Sie eine Aortenklemme an der markierten Stelle platzieren.
  5. Wenden Sie die Aortenklemmung in aufsteigender Reihenfolge von 1-, 2-, 5-, 10- und 30-minütigen Intervallen an, um das Überleben der Tiere während des Studienprotokolls zu verbessern.
  6. Setzen Sie die Aortenkreuzklemmung nach jedem Intervall nach maximal 5 Minuten oder nach Normalisierung des Flusses der Oberschenkelarterie fort.
  7. Führen Sie einen manuellen Zuflussverschluss der unteren Hohlvene durch, um Blutdruckerhöhungen von > mittleren arteriellen Druck von 100 mmHg zu verhindern.
  8. Verabreichen Sie bei Bedarf während der Klemmphase Bolusinjektionen von Noradrenalin oder Adrenalin, um eine Abnahme des mittleren arteriellen Drucks unter 40 mmHg zu verhindern.
  9. Wiederholen Sie die Messungen am Ende des 30-minütigen Spannintervalls vor der Reperfusion (M2).
  10. Öffnen Sie allmählich die Klemme, um die hämodynamische Stabilität zu gewährleisten. Schließen Sie die Klemme, wenn der Blutdruck zu schnell sinkt und lassen Sie eine Stabilisierung zu.
  11. Zur Stabilisierung werden 7ml·kg-1 Hydroxyethylstärkekolloide sowie zusätzliche Bolusinjektionen von 10-20 μg Noradrenalin und/oder Adrenalin verabreicht. Verabreichen Sie 2 ml kg-1 von 8,4% Natriumbicarbonat, wenn der pH-Wert unter 7,1 fällt. Stellen Sie sicher, dass die Atemfrequenz richtig eingestellt wird, um Normocapnia sicherzustellen.
  12. Wiederholung der Messungen 1 h nach der Reperfusion (M3).
  13. Wiederholen Sie die hämodynamische Optimierung wie unter 6.2 beschrieben, und wiederholen Sie die Messungen (M4).
  14. Führen Sie die abschließenden Messungen 4,5 h nach der Induktion der Ischämie/Reperfusion (M5) durch.

7. Sterbehilfe

  1. Verabreichen Sie 40 mmol Kaliumchlorid intravenös zur Euthanasie, um Kammerflimmern und Asystolie zu induzieren.
  2. Beenden Sie die Beatmung und entfernen Sie alle Katheter.

8. Organraub

  1. Legen Sie das Tier in eine Bauchlage und entfernen Sie die Nadelsonden sowie die Drainage.
  2. Legen Sie die Wirbelsäule durch Hautschnitt und Entfernung von Muskelgewebe mit einem Skalpell und einer Pinzette frei.
  3. Verwenden Sie eine oszillierende Säge, um den Wirbelbogenparamedian auf beiden Seiten zu teilen, und entfernen Sie den dorsalen Teil des Wirbelknochens, indem Sie den Dornfortsatz vorsichtig seitwärts bewegen, um die verbleibenden Verbindungen zu lösen.
  4. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Rückenmark vorsichtig von den kaudalen bis zu den schädelförmigen Enden anzuheben, und verwenden Sie ein Skalpell, um die Spinalnerven zu schneiden, um das Rückenmark zu entfernen.
  5. Lagern Sie das Rückenmark in 4% Formalin bis zur weiteren Verwendung zur histopathologischen Beurteilung oder Mikrosphärenquantifizierung.

9. Statistische Auswertung

  1. Verwenden Sie statistische Software.
  2. Stellen Sie die Normalverteilung sicher, indem Sie bei Bedarf Histogramme und Log-Transformationsvariablen überprüfen.
  3. Die abhängigen Variablen - Rückenmarksfluss, Herzzeitvolumen, Herzfrequenz, Schlagvolumen, systolischer arterieller Druck, mittlerer arterieller Druck, diastolischer arterieller Druck, zentraler Venendruck, systemischer Gefäßwiderstand - sowie Mikroperfusion des oberen und unteren Rückenmarks, wie sie mit fluoreszierenden Mikrosphären bewertet wird, falls gewünscht - allgemeinen linearen Mixed-Model-Analysen unter Verwendung der Routine GENLINMIXED für kontinuierliche Daten mit einer Identitätsverbindungsfunktion.
  4. Verwenden Sie Baseline-Anpassungen.
  5. Geben Sie Modelle mit festen Effekten für variable Baseline und Messpunkt an. Betrachten Sie den Messpunkt als wiederholte Messungen bei Tieren.
  6. Melden Sie p-Werte der festen Effekte für den Messpunkt für jeden Parameter.
  7. Verwenden Sie für die Analyse der fluoreszierenden Mikrosphäre des Rückenmarks zusätzlich die Region (unteres Rückenmark, oberes Rückenmark) als festen Effekt und Interaktion zwischen Region und Messpunkt, um die Wechselwirkungen zwischen Regionen und Messpunkten zu bewerten, und melden Sie p-Werte fester Effekte für die Interaktion.
  8. Berechnen Sie den baselinebereinigten Grenzwert mit einem 95%-Konfidenzintervall (CI) für alle abhängigen Variablen an den Messpunkten M1-M5, gefolgt von paarweisen Vergleichen über Tests mit der geringsten signifikanten Differenz.
  9. Variablen als Mittelwert ausdrücken (95% CI). Geben Sie das Tiergewicht als Mittelwert ± Standardabweichung aus.
  10. Präsentieren Sie unbereinigte p-Werte.

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Ergebnisse

Alle sechs Tiere überlebten bis zum Abschluss des Protokolls. Das Tiergewicht betrug 48,2 ± 2,9 kg; fünf Tiere waren männlich und ein Tier war weiblich. Das Einsetzen der Rückenmarksnadelsonde sowie die Messung des Rückenmarksflusses war bei allen Tieren möglich.

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Diskussion

Die durch Rückenmarksischämie induzierte Rückenmarkslähmung ist eine Hauptkomplikation der Aortenreparatur mit enormen Auswirkungen auf das Patientenergebnis1,2,3,4,10,11,12. Mikrozirkulations-zielgerichtete Therapien zur Vorbeugung und Behandlung von Rückenmarksverletzungen sind am vielvers...

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Offenlegungen

Constantin J.C. Trepte hat einen Ehrenpreis für Vorträge von Maquet erhalten. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte. Diese Studie wurde vom European Society of Anaesthesiology Young Investigator Start-Up Grant 2018 unterstützt.

Danksagungen

Die Autorinnen und Autoren danken Lena Brix, V.M.D, Institut für Tierversuche, Medizinische Hochschule Hannover, sowie Frau Jutta Dammann, Versuchstierpflegeeinrichtung, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Deutschland, für die prä- und perioperative Tierpflege und ihre technische Unterstützung beim Umgang mit Tieren. Die Autoren danken ferner Dr. Daniel Manzoni, Klinik für Gefäßchirurgie, Hôpital Kirchberg, Luxemburg, für seine technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CardioMed DurchflussmessgerätMedistim AS, Oslo, NorwegenCM4000Durchflussmessgerät für Durchflusssonde Oberschenkelarterie
CardioMed Durchflusssonde, 5mmMedistim AS, Oslo, NorwegenPS100051Durchflusssonde Oberschenkelarterie
COnfidenzsonde, Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USAMA16PAUFlow-Probe Aorta
16 mm Liner
DIVA Sevofluran DampfDrä ger Medizin, Lü beck, DeutschlandDampf
Hotline Level 1 FlüssigkeitswärmerSmiths Medical Germany GmbH, Grasbrunn, DeutschlandHL-90-DE-230Flüssigkeitswärmer
Infinity DeltaDrä ger Medizin, Lü beck, DeutschlandBasic Monitoring Hardware
Infinity HemoDrä ger Medizin, Lü beck, DeutschlandGrundlegende Hardware für die Drucküberwachung und pulmonale Thermodilution
LabChart ProADInstruments Ltd., Oxford, UKv8.1.16Synchroner Laser-Doppler, Blutdruck-, EKG- und Blutflusserfassungssoftware
LiquoGuard 7Mö ller Medical GmbH, Fulda, DeutschlandLiquor-Drainagesystem
Millar Micro-Tip Druckkatheter (5F, Single, Curved, 120cm, PU/WD)ADInstruments Ltd., Oxford, UKSPR-350Druckspitzenkatheter Aorta
moor VMS LDFmoor Instruments, Devon, UKAusgewiesene Laser-Doppler-Hardware
moor VMS Research Softwaremoor Instruments, Devon, UKDesignated Laser-Doppler Software
Perivascular Flow ModuleTransonic Systems Inc., Ithaca, NY, USATS 420Flow-Modul für Flow-Probe Aorta
PiCCO 2, Science VersionGetinge AB, Gö teborg, Schwedenv. 6.0Blutdruck- und transkardiopulmonale Überwachung Hard- und Software
PiCCO 5 Fr. 20cmGetinge AB, Gö teborg, SchwedenThermistor-bestückte Arterienleitung 
PowerLabADInstruments Ltd., Oxford, UKPL 3516Synchroner Laser-Doppler, Blutdruck-, EKG- und Blutfluss-Erfassungshardware
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