Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

في الوقت الحقيقي تقييم النخاع الشوكي Microperfusion في نموذج Porcine من الإقفارية / Reperfusion

Published: December 10, 2020 doi: 10.3791/62047
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 4, 1, 5, 1, 6, 6, 1
1Department of Anesthesiology, Center of Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2University Department for Vascular Surgery and Department of Operative Medicine, Medical University of Innsbruck, 3Department of Medical Biometry and Epidemiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Vascular Medicine, University Heart and Vascular Center Hamburg (UHZ), 5Department of Cardiology, Rostock University Medical Center, 6University Department for Cardiac Surgery, Heart Center Leipzig

Summary

تلعب دوران الحبل الشوكي دورا محوريا في إصابة الحبل الشوكي. معظم الطرق لا تسمح بتقييم في الوقت الحقيقي من دوران الحبل الشوكي، وهو أمر ضروري لتطوير العلاجات الموجهة نحو دوران الأوعية الدقيقة. هنا، نقترح بروتوكول باستخدام الليزر دوبلر تدفق إبرة المسابير في نموذج حيواني كبير من نقص التروية / reperfusion.

Abstract

إصابة الحبل الشوكي هي مضاعفات مدمرة لإصلاح الأبهر. على الرغم من التطورات للوقاية والعلاج من إصابة الحبل الشوكي، لا يزال معدل الإصابة به مرتفعا إلى حد كبير، وبالتالي، يؤثر على نتائج المريض. تلعب الدورة الدموية الدقيقة دورا رئيسيا في تغلغل الأنسجة وإمدادات الأكسجين وغالبا ما يتم فصلها عن الديناميكا الكبيرة. وبالتالي، فإن التقييم المباشر لدوائر الحبل الشوكي الدقيقة أمر ضروري لتطوير العلاجات الموجهة نحو دوران الأوعية الدقيقة وتقييم النهج القائمة فيما يتعلق بدوائر النخاع الشوكي الدقيقة. ومع ذلك ، فإن معظم الأساليب لا توفر تقييما في الوقت الحقيقي لدوائر الحبل الشوكي الدقيقة. الهدف من هذه الدراسة هو وصف بروتوكول موحد لتقييم الأوعية الدقيقة في الحبل الشوكي في الوقت الحقيقي باستخدام مسابير إبرة الليزر دوبلر التي يتم إدخالها مباشرة في الحبل الشوكي. استخدمنا نموذج porcine من نقص التروية / reperfusion للحث على تدهور دوران الأوعية الدقيقة الحبل الشوكي. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت تقنية حقن ميكروسفير فلوري. في البداية، تم تخدير الحيوانات وتهوية ميكانيكيا. بعد ذلك ، تم إجراء إدخال مسبار إبرة الليزر دوبلر ، يليه وضع تصريف السائل النخاعي. تم إجراء استئصال القص المتوسط للتعرض للهرطا التنازلي لأداء اللقط الشرياني الأبهري. تم تحريض الإقفارية / الترطيب عن طريق اللقط الأبهري فوق البطني لما مجموعه 48 دقيقة ، يليه إعادة التروية واستقرار الدورة الدموية. تم إجراء ليزر دوبلر فلوكس بالتوازي مع التقييم الحيوي الكلي. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام تصريف السائل النخاعي الآلي للحفاظ على ضغط النخاع المستقر. بعد الانتهاء من البروتوكول، تم التضحية بالحيوانات، وتم حصاد الحبل الشوكي لتحليل الأمراض النسيجية والغلاف المجهري. ويكشف البروتوكول عن جدوى قياسات التروية الدقيقة في الحبل الشوكي باستخدام مسابير الليزر دوبلر ويظهر انخفاضا ملحوظا أثناء نقص التروية وكذلك الانتعاش بعد التروية. وأظهرت النتائج سلوكا مماثلا لتقييم الغلاف المجهري الفلوري. في الختام، قد يوفر هذا البروتوكول الجديد نموذجا حيوانيا كبيرا مفيدا للدراسات المستقبلية باستخدام تقييم الضخ الدقيق في الحبل الشوكي في الوقت الحقيقي في حالات نقص التروية/إعادة التروية.

Introduction

إصابة الحبل الشوكي الناجمة عن نقص التروية / التروية (SCI) هي واحدة من أكثر المضاعفات المدمرة لإصلاح الأبهر المرتبطة بانخفاض النتيجة1،2،3،4. خيارات الوقاية والعلاج الحالية لSCI تشمل الاستفادة المثلى من المعلمات macrohemodynamic وكذلك تطبيع ضغط السائل النخاعي (CSP) لتحسين ضغط الحبل الشوكي2،5،6،7،8،9. على الرغم من تنفيذ هذه المناورات، لا يزال معدل الإصابة ب SCI يتراوح بين 2٪ و 31٪ اعتمادا على تعقيد إصلاح الأبهر10و11و12.

في الآونة الأخيرة، اكتسبت دوران الأوعية الدقيقة زيادة الاهتمام13،14. Microcirculation هو مجال امتصاص الأكسجين الخلوي وتبادل الأيض وبالتالي، يلعب دورا حاسما في وظيفة الجهاز وسلامةالخلوية 13. ضعف تدفق الدم في الأوعية الدقيقة هو محدد رئيسي لنقص التروية في الأنسجة المرتبطة بزيادة معدل الوفيات15،16،17،18،19. ويرتبط ضعف دوران الأوعية الدقيقة الحبل الشوكي مع انخفاض وظيفة عصبية والنتيجة20،21،22،23. لذلك ، فإن تحسين التخبط الدقيق لعلاج SCI هو نهج واعد للغاية. وقد وصف استمرار الاضطرابات في الأوعية الدقيقة ، على الرغم من التحسين الكلي ،26،27،28،29. يحدث هذا الفقدان في التماسك الديناميكي الدموي بشكل متكرر في ظروف مختلفة بما في ذلك نقص التروية / إعادة التروية ، مع التأكيد على الحاجة إلى التقييم المباشر للدوائر الدقيقة والعلاجات المستهدفة بدوائر صغيرة26و27و30.

حتى الآن، استخدمت دراسات قليلة فقط تحقيقات الليزر دوبلر لتقييم الوقت الحقيقي للسلوك النخاع الشوكي microcirculatory20،31. وقد استخدمت الدراسات القائمة في كثير من الأحيان تقنيات الحقن المجهرية، والتي تقتصر على الاستخدام المتقطع وتحليل ما بعد الوفاة32،33. عدد القياسات المختلفة باستخدام تقنية حقن ميكروسفير محدود بسبب توافر الموجات الدقيقة ذات الأطوال الموجية المختلفة. وعلاوة على ذلك، وعلى النقيض من تقنيات الليزر دوبلر، لا يمكن إجراء تقييم في الوقت الحقيقي للنزيف الدقيق، حيث أن هناك حاجة إلى معالجة وتحليل الأنسجة بعد الوفاة لهذه الطريقة. هنا، نقدم بروتوكول تجريبي للتقييم في الوقت الحقيقي من دوران الحبل الشوكي في نموذج حيواني كبير porcine من نقص التروية / reperfusion.

كانت هذه الدراسة جزءا من مشروع حيواني كبير يجمع بين دراسة عشوائية تقارن تأثير البلورات مقابل الغروانيات على دوران الأوعية الدقيقة في نقص التروية / التخثر بالإضافة إلى دراسة عشوائية استكشافية حول آثار السوائل مقابل الأوعية الدموية على التروية الدقيقة في الحبل الشوكي. تدفق التحقيق 2 نقطة المعايرة وكذلك الضغط تلميح القسطرة المعايرة وقد وصفت سابقا34. بالإضافة إلى البروتوكول المبلغ عنه، تم استخدام الميكروسفيرات الفلورية لقياس الميكروفوسيون الحبل الشوكي، كما هو موضح سابقا، وذلك باستخدام 12 عينة من أنسجة الحبل الشوكي لكل حيوان، مع عينات 1-6 تمثل الحبل الشوكي العلوي و 7-12 تمثل الحبل الشوكي السفلي35،36. تم إجراء حقن ميكروسفير لكل خطوة قياس بعد الانتهاء من تسجيلات ليزر دوبلر والتقييم الحيوي الكلي. تم إجراء تقييم الهستوباثولوجي باستخدام كلاينمان-نقاط كما وصف سابقا37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافقت اللجنة الحكومية المعنية برعاية الحيوانات واستخدامها في مدينة هامبورغ على الدراسة (المرجع رقم 60/17). تلقت الحيوانات الرعاية وفقا ل دليل لرعاية واستخدام المختبر (نشر المعاهد القومية للصحة رقم 86-23 ، المنقحة 2011) وكذلك توصيات FELASA وأجريت التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية وصول24،25. كانت هذه الدراسة تجربة حادة، وتم قتل جميع الحيوانات بالرصاص في نهاية البروتوكول.

ملاحظة: أجريت الدراسة على ستة خنازير ذكرية وأنثى عمرها ثلاثة أشهر (سباق لاندراس الألماني) تزن حوالي 40 كجم. وقد أحضرت الحيوانات إلى مرافق رعاية الحيوانات قبل 7 أيام على الأقل من التجارب وتم إيواؤها وفقا لتوصيات رعاية الحيوان. وقدمت الحيوانات الغذاء والماء الإعلانية libitum، ويتم تقييم حالتها الصحية بانتظام من قبل الطبيب البيطري المسؤول. تم الحفاظ على وقت صيام 12 ساعة قبل التجارب. وأشرف الطبيب البيطري المسؤول على الإجراء التجريبي بأكمله والتعامل مع الحيوانات.

1. تحريض التخدير وصيانة التخدير

  1. للتحريض والحفاظ على التخدير، تطبيب الحيوانات وتخديرها بعمق باستخدام حقن عضلي تليها الحقن الوريدية، إذا لزم الأمر، لأداء التنبيب القصبي. بعد ذلك ، حث والحفاظ على التخدير باستخدام مزيج من عامل التخدير المتطاير مع تطبيق المواد الأفيونية المستمرة تكملها حقنة بولوس الأفيونية إضافية.
  2. إجراء الحقن العضلية من الكيتامين 20 ملغ ·كغ-1,azaperone 4 مغ·كغ-1,وmedazolam 0.1 مغ·كغ-1 للتطبيب المسبق والتخدير.
  3. ضع قسطرة وريدية في وريد الأذن، وآمن التثبيت المناسب، وقيم الأداء الوظيفي عن طريق التطبيق السريع ل 10 مل من المالحة.
  4. ضع الحيوان في وضع ية على بطانية دافئة لمنع فقدان الحرارة.
  5. إنشاء المراقبة الأساسية مع تخطيط القلب (ECG) وقياس النبض لرصد الحالة القلبية الرئوية للحيوانات، وربطها بأجهزة المراقبة الأساسية.
  6. إدارة 15 L·min-1 من الأكسجين عن طريق قناع على شكل خنزير لpreoxygenation.
  7. حقن بولي عن طريق الوريد من 0.1 ملغ ·كجم-1 من 1٪ بروبوفول، إذا لزم الأمر، وإجراء التنبيب القصبي.
  8. تأمين الموضع الصحيح مع نهاية capnography المد والجزر وauscultation، وإدارة 0.1 ملغم • كجم-1 من بانكورونيوم، وضمان التثبيت السليم للأنبوب البطاني.
  9. إنشاء التهوية التي تسيطر عليها وحدة التخزين باستخدام أحجام المد والجزر من 10 مل · كجم-1 وزن الجسم-1، وضغط نهاية منتهية الصلاحية إيجابية من 10 سمH2O ، وجزء صغير من الأكسجين مستوحاة (FiO2)من 0.3 باستخدام آلة التخدير. ضبط تردد جهاز التنفس الصناعي للحفاظ على التوتر ثاني أكسيد الكربون نهاية الانتهاء (etCO2)من 35-45 ملم زئبق.
  10. أدخل أنبوب المعدة، وإجراء شفط سوائل المعدة، وإصلاح الأنبوب بشكل صحيح، وتوصيله إلى كيس جمع. أغلق عيون الحيوان بعناية لمنع جفاف العينين أثناء التخدير.
  11. الحفاظ على التخدير عن طريق التسريب المستمر للفنتانيل (10 ميكروغرام ·كجم-1·h-1)وسيفوففلوران (تركيز منتهي الصلاحية بنسبة 3.0٪، يتم تسليمه بواسطة البخار). ضمان مستوى كاف من التخدير عن طريق المراقبة الدقيقة للعلامات الحيوية ومعلمات التهوية وكذلك عن طريق عدم وجود أي حركات خلال البروتوكول بأكمله ، مع إيلاء اهتمام خاص لمراحل التحفيز الجراحي. إعطاء جرعات إضافية من البولوس الفنتانيل (50 ميكروغرام) إذا كان هناك أي مؤشر على الألم أو الضيق.
    ملاحظة: تأكد من وجود الباحثين الذين يعانون من التخدير الحيواني خلال العملية بأكملها، واستخدام الإشراف من قبل طبيب بيطري من ذوي الخبرة لتأمين التخدير السليم.
  12. إدارة معدل ضخ خط الأساس من 10 مل · كجم-1·ح -1 بلورات متوازنة للتعويض عن فقدان السوائل أثناء التخدير، وإعداد الجراحية، وتنفيذ البروتوكول التجريبي. استخدم سائلا أكثر دفئا لمنع فقدان الحرارة.
  13. تنظيف بلطف جلد الخنزير باستخدام ماء الصابون. استخدم محلول تطهير الجلد الذي يحتوي على بوفيدوني اليود لتقليل تلوث الجلد. استخدم قفازات معقمة للمستحضرات الجراحية. تطبيق 300 ملغ من clindamycin كوقاية مضادة للميكروبات, وتكرار الجرعة بعد 6 ح.

2. التحقيق التنسيب

  1. ضع الحيوان في الموضع الجانبي الأيمن ، وانثني ظهر الحيوان لتوسيع المسافة بين الفقرات.
  2. كشف جراحيا في منطقة paravertebral لإعداد العمليات الشوكية والأقواس الفقرية (الشكل 1A).
  3. ضع القسطرة الوريدية المحيطية 14 G في الحبل الشوكي على مستوى الفقرات الصدرية (Th) 13/14 أو الفقرات القطنية (L) بين قوسين فقريين(الشكل 1B).
  4. إزالة الإبرة، إدراج الليزر / دوبلر إبرة التحقيق على القسطرة الوريد(الشكل 1C)،واختبار جودة إشارة عن طريق الاتصال المعين الثابت والبرمجيات. تأكد من وجود إشارة مستقرة مع نبضات معتدلة.
  5. إصلاح بعناية التحقيق مع الغرز(الشكل 1D)واستخدام الحشو لمنع خلع أو kinking من التحقيق.
  6. لوضع عن طريق الجلد من تصريف السائل النخاعي لقياس والسيطرة على الضغط النخاعي, تحديد مستوى L 4/5 أو L 5/6, ثقب الجلد والفضاء تحت الجلد مع إبرة مقدم, وإزالة إبرة تطعيم.
  7. ضع حقنة مملوءة بالمحلول الملحي على الإبرة ، وادخل الإبرة بعناية مع الضغط المستمر على الحقنة المملوءة بالسوائل.
  8. مرة واحدة يشعر فقدان المقاومة كدليل على موقف فوق الجافية، وإعادة إدخال إبرة تطعيم، وإدخال الإبرة 2-3 ملم أخرى لثقب ماتر دورا وإزالة إبرة تطعيم.
  9. تحقق من الموقف داخل الثكال عن طريق نازف سريع من الخمور واضحة. أدخل الصرف حتى عمق 20 سم، وإرفاق محول لوير قفل، والتحقق من الموقف عن طريق الطموح الدقيق من الخمور.
  10. إصلاح الصرف بعناية مع الغرز، وربطه إلى نظام تصريف السائل النخاعي.
  11. كشف الجمجمة خلف الأذن اليسرى، وإجراء بعناية ثقب الحفر تريبانيشن الجلد باستخدام مرفق الحفر 6 ملم.
  12. إدخال مسبار دوبلر ليزر الثاني مباشرة في الدماغ. إصلاح بعناية التحقيق مع الغرز، واختبار جودة إشارة عن طريق الاتصال المعين الثابت والبرمجيات. مرة أخرى، تأكد من أن هناك إشارة مستقرة مع pulsatility معتدلة.
  13. قطع جميع المسابير، ووضع بعناية الحيوان في موقف supine، وضمان موقف التحقيق لم تتأثر. تأكد من أن ما لا يقل عن 4-5 باحثين يقومون بهذه المناورة.
  14. أعد توصيل المسابير، وأعد التحقق من جودة الإشارة.
  15. ربط قنوات الإخراج من الأجهزة الليزر دوبلر إلى مكبر للصوت والتزامن اقتناء الأجهزة والبرامج لتسجيل بالإضافة إلى ذلك ليزر / دوبلر تدفق في وقت واحد مع إشارات macrohemodynamic.
  16. معايرة تدفق حسب الوحدة (PU) مع معايرة من نقطتين.
    1. اضغط Enter لفتح القائمة وحدد إعداد الإخراج التماثلي.
    2. استخدم عامل التحويل المعروض (5.0 V = 1000 PU) لمعايرة Flux بمعايرة من نقطتين للاستخدام مع برنامج الاستحواذ المتزامن.
    3. حدد العودة للعودة إلى القائمة السابقة، وحدد القياس للمتابعة في القياس.
    4. افتح برنامج الاستحواذ المتزامن. حدد صفر كافة الإدخالات من القائمة الإعداد. قم بتوصيل جميع المدخلات بالأجهزة والتحقيقات المستخدمة.
    5. قم بإجراء معايرة من نقطتين ل Flux بالنقر على القائمة المنسدلة لقناة Flux. حدد معايرة من نقطتين. تعيين تحويل الوحدات إلى تشغيل وتحديد وحدة معالجة BPU كوحدات. للنقطة 1، تعيين 0 V إلى 0 BPU. للنقطة 2، تعيين 5.0 V إلى 1000 BPU. حدد مجموعة وحدات لكافة البيانات والبيانات الجديدة. اضغط على موافق لإغلاق القائمة.
  17. ابدأ تصريف السوائل النخاعية المستمرة بضغط مستهدف يبلغ 10 مم زئبق وحجم تصريف يبلغ 20 مل·ح-1.

3. قسطرة التنسيب

  1. كشف كلا الشريانين الفخذي.
  2. Ligate الجزء البعيدة من الشريان الفخذي الأيمن، مؤقتا انسداد التجويف القريبة من الشريان باستخدام حلقة وعاء، وإجراء قطع 2 ملم من السفينة باستخدام مقص بوتس، وإدخال سلك دليل.
  3. إدخال سلك دليل كذلك، وضمان الإدراج خالية من المقاومة وتجنب أي kinking من السلك؛ أدخل القسطرة عبر السلك.
  4. إصلاح القسطرة مع الغرز.
  5. ضمان الوضع الصحيح من خلال الطموح من الدم الشرياني التحقق مع تحليل غاز الدم وقياس إشارة الشريان بعد الاتصال السليم لضغط الدم ورصد عبر القلب والشموعية الثابت والبرمجيات.
  6. ضع مسبار تدفق 5 مم على الشريان الفخذي الأيسر، واختبر جودة الإشارة عن طريق الاتصال بمقياس التدفق.
  7. أغلق كلا الفخذين بالغرز.
  8. كشف الشريان السباتي الأيمن وكذلك الوريد الوريدي الداخلي الأيمن لوضع 8 أغماد مقدم الأب.
  9. لوضع القسطرة، انتقل بنفس الطريقة كما هو موضح في 3.2-3.4.
  10. قم بتوصيل التجويف الجانبي لمغمد مقدم الشريان السباتي بجهاز مراقبة الضغط الأساسي والأجهزة الحرارية الرئوية لقياس ضغط الشرايين.
  11. إدخال القسطرة الضغط تلميح في الشريان الأورطي التصاعدي، والتحقق من الموقف عن طريق الاتصال مكبر للصوت واقتناء متزامن الثابت والبرمجيات.
  12. ضع قسطرة الشريان الرئوي Swan-Ganz عبر الغمد الوريدي في الشريان الرئوي عن طريق نفخ البالون بالهواء على عمق 20 سم وإدراجه برفق حتى يظهر ضغط إسفين في منحنى الديناميكية الدموية. تفريغ البالون وسحب القسطرة إلى الوراء 2 سم. ضمان جودة إشارة مرضية لضغط الشريان الرئوي. ربط الثيرمسترات إلى مراقبة الضغط الأساسي والأجهزة الحرارية الرئوية.
  13. استخدام التوجيه السونوغرافي لوضع عن طريق الجلد من القسطرة الوريدية المركزية 12 Fr. 5-Lumen لإدارة المخدرات وقياس الضغط الوريدي المركزي في الوريد الوريدي الأيمن الخارجي. استخدام نهج الخطوة 6 لوضعالسونوغرافية 38
  14. ربط التجويف البعيدة من القسطرة لضغط الدم ومراقبة عبر القلب والاحادية الثابت والبرمجيات. قم بتبديل جميع الأدوية والتسريبات إلى القسطرة الوريدية المركزية. استخدام التجويف مختلفة للمسكنات والسوائل والكاتيكولامينات، وتجنيب التجويف كبيرة لإدارة الغروانيات أثناء خطوات تحميل الحجم.

4. التحضير الجراحي

  1. إجراء عملية استئصال البطن المصغرة، وتعبئة المثانة، وإدراج قسطرة فولي لتصريف البول، وتضخيم البالون مع المالحة، وإصلاح القسطرة مع خياطة الحقيبة.
  2. قم بتوصيل القسطرة بكيس جمع البول الذي يعرض كمية البول بال مل.
  3. زيادة فيو2 إلى 1.0، وإعادة إدارة 0.1 ملغ·كغ-1 بانكورونيوم عن طريق الوريد.
  4. إجراء عملية استئصال القص المتوسط باستخدام الكتروكويتر للتحضير وصولا الى القص. تشريح القص بلطف من الأنسجة المحيطة بها. إجراء موضع الرجعية من ضغط لمنع الإصابات.
  5. وقف التهوية وتقسيم العظام مع منشار متذبذب. مواصلة التهوية وتقليل FiO2 إلى 0.3. استخدام الكتروكويتر للحد من النزيف، وختم القص مع الشمع العظام.
  6. اعبئ قمة الرئة اليسرى بعناية، وقسم الجزء الجانبي الأيسر من الحجاب الحاجز لتسهيل التعرض الجراحي.
  7. تعريض الشريان الأورطي التنازلي قريبة إلى جذع الاضطرابات الهضمية عن طريق التراجع لطيف من الرئة اليسرى، وضمان التهوية دون عائق وتجنب الصدمات النفسية في الرئة اليسرى (الشكل 2A) وتقسيم الأنسجة المحيطة بها (الشكل 2B). إدارة 7 مل·كغ-1 هيدروكسي إيثيل النشا الغروانية إذا كان هناك حاجة إلى تثبيت الهموديناميك.
  8. ضع رقابة فوقية حول الشريان الأورطي التنازلي لضمان التعرض المناسب(الشكل 2C).
  9. إرفاق مسبار تدفق حول الشريان الأورطي الصدري التنازلي (الشكل 2D). ضمان جودة إشارة السليم عن طريق الاتصال وحدة تدفق واقتناء التزامن الثابت والبرمجيات. استخدم جل الاتصال لتحسين جودة الإشارة إذا لزم الأمر.
  10. إرفاق حلقة وعاء حول الشريان الأورطي تنازلي، distal إلى مسبار تدفق للاحتفال منطقة لقط الصليب الأبهري.

5. التقييم والحصول على البيانات

  1. صفر جميع القسطرة ومستوى القسطرة باستخدام خطوط مملوءة بالسوائل وضعت على مستوى الأذين الأيمن.
  2. وضع إبرة أقطاب تخطيط القلب وربطها إلى اكتساب التزامن الثابت والبرمجيات.
  3. وقد وصف تقييم الترموديل الحراري عبر القلب والاضطراب وكذلك تدفق الأبهر وقياسات الضغط سابقا 34.
  4. لقياس مخرجات القلب باستخدام توليد الحرارة الشريان الرئوي، قم بإجراء 3 حقن مع 10 مل من المالحة الباردة، ولاحظ متوسط القيمة المعروضة من قبل أجهزة المراقبة الأساسية.
  5. بدء تشغيل الليزر دوبلر البرمجيات ببساطة عن طريق الضغط على ابدأ، ووضع علامة لكل خطوة القياس عن طريق وضع علامة بعناية الخطوات M0 إلى M5.

6. البروتوكول التجريبي

  1. إجراء قياسات خط الأساس (M0).
  2. أداء الأمثل الهموديناميكي باستخدام حجم تحميل خطوات من 7 مل · كجم-1 هيدروكسيثيل النشا الغروانية. تنفيذ كل حجم تحميل الخطوة أكثر من 5 دقائق باستخدام ضخ الضغط. بعد الانتهاء من كل خطوة تحميل وحدة التخزين، والسماح 5 دقائق للتوازن. بدء تحميل الحجم حتى الزيادة في الناتج القلبي هو <15٪.
  3. تكرار القياسات (M1) بعد الانتهاء من التحسين الديناميكي الدموي.
  4. حث نقص التروية / reperfusion لما مجموعه 48 دقيقة من فوق البطن الشريان الأبهري عبر لقط عن طريق وضع المشبك الأبهري في المنطقة ملحوظ.
  5. تطبيق لقط الأبهر في ترتيب تصاعدي من 1-، 2-، 5-، 10-، و 30 دقيقة فترات لتحسين بقاء الحيوانات خلال بروتوكول الدراسة.
  6. استمر في اللقط عبر الأبهر بعد كل فاصل زمني بعد 5 دقائق كحد أقصى أو بعد تطبيع تدفق الشريان الفخذي.
  7. إجراء انسداد التدفق اليدوي من الوريد الأجوف أدنى لمنع زيادات ضغط الدم من > 100 مم زئبق يعني ضغط الشرايين.
  8. إعطاء حقن البولوس من النورادرينالين أو الإبينفرين خلال مرحلة لقط, إذا لزم الأمر, لمنع انخفاض في متوسط الضغط الشرياني أقل من 40 ملم زئبق.
  9. كرر القياسات في نهاية فترة اللقط 30 دقيقة قبل إعادة التروية (M2).
  10. فتح المشبك تدريجيا لضمان الاستقرار في الدم. أغلق المشبك إذا انخفض ضغط الدم بسرعة كبيرة وسمح بالاستقرار.
  11. إدارة 7 مل· كجم-1 من غرويدات النشا هيدروكسي إيثيل وكذلك حقن بولوس إضافية من 10-20 ميكروغرام من النورادرينالين و / أو الإبينفرين لتحقيق الاستقرار. إدارة 2 مل كجم-1 من بيكربونات الصوديوم 8.4٪ إذا انخفض درجة الحموضة إلى أقل من 7.1. ضمان التكيف السليم لمعدل التنفس لضمان normocapnia.
  12. كرر القياسات 1 ساعة بعد إعادة التروية (M3).
  13. تكرار التحسين الديناميكي الدموي كما هو موضح تحت 6.2، وتكرار القياسات (M4).
  14. إجراء القياسات النهائية 4.5 ساعة بعد تحريض نقص التروية / التروية (M5).

7. القتل الرحيم

  1. إعطاء 40 مليمول من كلوريد البوتاسيوم عن طريق الوريد للقتل الرحيم للحث على الرجفان البطيني والأستول.
  2. إنهاء التهوية وإزالة جميع القسطرة.

8. حصاد الأعضاء

  1. وضع الحيوان في موقف عرضة، وإزالة مسابير إبرة، فضلا عن الصرف الصحي.
  2. كشف العمود الفقري عن طريق شق الجلد وإزالة الأنسجة العضلية باستخدام مشرط والملقط.
  3. استخدم منشارا متذبذبا لتقسيم الباراميديا القوس الفقري على كلا الجانبين ، وإزالة الجزء الظهري من العظام الفقرية عن طريق تحريك العملية الشوكية بعناية جانبيا لتخفيف الاتصالات المتبقية.
  4. استخدم ملقط لرفع الحبل الشوكي بعناية من الزوايا إلى الزوايا القحفية، واستخدم مشرطا لقطع الأعصاب الشوكية لإزالة الحبل الشوكي.
  5. تخزين الحبل الشوكي في 4٪ الفورمالين حتى مزيد من الاستخدام لتقييم الأمراض النسيجية أو القياس الكمي المجهري.

9. التحليل الإحصائي

  1. استخدام البرامج الإحصائية.
  2. ضمان التوزيع الطبيعي عن طريق فحص المدرجات التكرارية ومتغيرات تحويل السجل إذا لزم الأمر.
  3. موضوع المتغيرات المعتمدة تدفق الحبل الشوكي، خرج القلب، ومعدل ضربات القلب، وحجم السكتة الدماغية، والضغط الشرياني الانقباضي، يعني الضغط الشرياني، الضغط الشرياني الانبساطي، الضغط الوريدي المركزي، مقاومة الأوعية الدموية الجهازية - فضلا عن التخبط الدقيق الحبل الشوكي العلوي والسفلي كما تم تقييمها مع المجهريات الفلورية إذا رغبت في ذلك - لتحليل نموذج مختلط خطي عام، وذلك باستخدام GENLINMIXED الروتينية للبيانات المستمرة مع وظيفة وصلة الهوية.
  4. استخدام تعديلات الأساس.
  5. حدد نماذج ذات تأثيرات ثابتة لخط الأساس المتغير ونقطة القياس. النظر في نقطة القياس كتدابير متكررة داخل الحيوانات.
  6. الإبلاغ عن قيم p للآثار الثابتة لنقطة القياس لكل معلمة.
  7. لتحليل الحبل الشوكي الفلورسنت المجهري، استخدم المنطقة (الحبل الشوكي السفلي، الحبل الشوكي العلوي) بالإضافة إلى التأثير الثابت والتفاعل بين المنطقة ونقطة القياس لتقييم التفاعلات بين المناطق ونقطة القياس، والإبلاغ عن القيم p من الآثار الثابتة للتفاعل أيضا.
  8. حساب الوسائل الهامشية المعدلة لخط الأساس مع فاصل ثقة بنسبة 95٪ (CI) لجميع المتغيرات التابعة عند نقاط القياس M1-M5، تليها مقارنات ثنائية عبر اختبارات الفرق الأقل أهمية.
  9. التعبير عن المتغيرات على أنها متوسط (95٪ CI). التعبير عن وزن الحيوان كمعني ± الانحراف المعياري.
  10. تقديم قيم p غير المعدلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد نجت جميع الحيوانات الستة حتى الانتهاء من البروتوكول. وكان وزن الحيوان 48.2 ± 2.9 كجم؛ خمسة كانت ذكورية واحد أنثى وكان إدخال مسبار إبرة الحبل الشوكي وكذلك قياس تدفق الحبل الشوكي ممكنا في جميع الحيوانات.

وترد أمثلة من تسجيلات النخاع الشوكي في الوقت الحقيقي microcirculatory بالاشتراك مع التسجيلات الدماغية microcirculatory و macrohemodynamic خلال الشريان الأبهري عبر لقط للتحريض الإقفاري وكذلك أثناء فك التعتيم و reperfusion في الشكل 3A, الشكل 3B. وأعقب اضطراب تدفق الأبهر التنازلي انخفاض ملحوظ في تدفق الحبل الشوكي، في حين زاد الضغط في الشريان الأبهري الصاعد(الشكل 3A). إعادة التشوه أدت إلى آثار معاكسة (الشكل 3B).

يظهر التحليل الإحصائي للمعلمات الكلية والميكروبية في الجدول 1. تشير الوسائل الهامشية المقدرة بالنموذج المختلط وفترات الثقة الخاصة بها إلى انخفاض ملحوظ في تدفق الحبل الشوكي أثناء نقص التروية. وعلى النقيض من ذلك، زاد التدفق الدماغي بشكل ملحوظ أثناء نقص التروية، كما هو مبين في الوسائل الهامشية المقدرة وفترات ثقتهم. ورافق ذلك زيادة في ضغط الشرايين، ومعدل ضربات القلب، ومقاومة الأوعية الدموية الجهازية، في حين انخفض الناتج القلبي وحجم السكتة الدماغية. وكشف تحليل الفلورسنت المجهري عن انخفاض ملحوظ في تدفق الدم في النخاع الشوكي في الحبل الشوكي السفلي، في حين لم يحدث أي تغيير كبير في الحبل الشوكي العلوي، كما يتضح من الوسائل الهامشية المقدرة وفترات ثقتهم. إعادة التخبط أدى إلى آثار معاكسة. على الرغم من وجود انخفاض آخر في إنتاج القلب وحجم السكتة الدماغية وضغط الشرايين في نهاية البروتوكول ، إلا أن تدفق الحبل الشوكي وكذلك تدفق الدم الدقيق في الحبل الشوكي كانت مستقرة.

تظهر نتائج هذه الدراسة قدرة مسابير إبرة الليزر / دوبلر على اكتشاف التغيرات في الوقت الحقيقي في التروية الدقيقة في الحبل الشوكي. كما هو متوقع، كان الانخفاض في دوران الحبل الشوكي أثناء نقص التروية جذريا مع الحد الأدنى من تدفق الأوعية الدقيقة. حدث تعافي تدفق الحبل الشوكي بعد إعادة التروية. أظهر تغلغل الحبل الشوكي السفلي ، كما تم تقييمه مع الميكروسفيرات الفلورية ، سلوكا مماثلا ، وبالتالي دعم الطريقة. كما هو متوقع، أظهر تغلغل الحبل الشوكي العلوي والتدفق الدماغي سلوكيات مختلفة. وعلى الرغم من استقرار دوران الأوعية الدقيقة في الحبل الشوكي، فقد انخفضت الدورة الدموية الكلية في نهاية البروتوكول، مما يدل على فقدان التماسك الديناميكي الدموي. في حين أن التدفق في الشريان الأورطي التنازلي كان صفرا أثناء نقص التروية ، أدى الارتشاح إلى انتعاش التدفق الأبهري. كشف التحليل النسيجي نخر خفيف من الحبل الشوكي مع كلاينمان عشرات لانخفاض الحبل الشوكي بين 0 و 2 والحبل الشوكي العلوي بين 0 و 1.

Figure 1
الشكل 1:وضع الليزر/ دوبلر إبرة التحقيق في الحبل الشوكي. (أ) التعرض الجراحي للهياكل الفقرية. (ب) ثقب الحبل الشوكي باستخدام قسطرة الوريد. (ج) إدخال مسبار الإبرة بعد إزالة الإبرة الملاية. (د) تثبيت مسبار الإبرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Figure 2
الشكل 2: التعرض من الشريان الأورطي تنازلي ووضع تدفق التحقيق وحلقة السفينة. (أ)التعرض من الشريان الأورطي تنازلي بعد تعبئة قمة الرئة اليسرى وتقسيم الجزء الأيسر الجانبي من الحجاب الحاجز. (ب)تقسيم الأنسجة المحيطة للتعرض الجراحي. (ج)وضع الإفراط في الحصول على حول الشريان الأورطي التنازلي لتأمين التعرض الدائري السليم. (د) وضع تدفق التحقيق وكذلك حلقة السفينة حول الشريان الأورطي تنازلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:عينة تسجيلات للإشارات الدورانية الدقيقة والميكارومودينامية أثناء نقص التروية وكذلك إعادة التروية. تسجيلات عينة من تخطيط القلب، والضغط في الشريان الأورطي التصاعدي كما تقاس باستخدام microtip القسطرة، وتدفق في الشريان الأورطي تنازلي كما تقاس باستخدام مسبار التدفق بالموجات فوق الصوتية، والحبل الشوكي، فضلا عن تدفق الأوعية الدقيقة الدماغية كما تقاس باستخدام الليزر / دوبس إبرة دوبلر. (أ) عينة 50 ق أثناء التعريفي نقص التروية عن طريق فوق البطن الشريان الأورطي عبر لقط. (ب) عينة 20 ق أثناء تحريض إعادة التروية عن طريق لطيف إعادة فتح المشبك عبر الأبهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

M1 M2 M3 M4 M5
تدفق الحبل الشوكي 61.35 (41.96-89.70) 6.78 (4.63-9.91) 58.97 (40.33-86.22) 66.05 (45.17-96.57) 59.09 (40.41-86.40)
نقطة قياس التأثير الرئيسي: p < 0.001 مقارنة زوجية M1 ص < 0.001 ص = 0.878 ص = 0.777 ص = 0.886
تدفق دماغي 41.12 (28.17-60.04) 71.73 (49.13-104.73) 60.34 (41.33-88.10) 59.91 (36.93-78.71) 49.82 (34.12-72.74)
نقطة قياس التأثير الرئيسي: p = 0.023 مقارنة زوجية M1 p = 0.001 p = 0.045 ص = 0.173 ص = 0.341
النخاع الشوكي ميكروبيرفوسيون (مل / دقيقة / غرام) الحبل الشوكي العلوي 0.071 (0.058-0.087) 0.063 (0.052-0.078) 0.088 (0.072-0.11) 0.082 (0.067-0.100) 0.083 (0.068-0.102)
مقارنة زوجية M1 p = 0.420 ص = 0.146 ص = 0.344 ص = 0.281
نقطة قياس التأثير الرئيسي: p < 0.001
الحبل الشوكي السفلي 0.079 (0.065-0.097) 0.031 (0.026-0.039) 0.111 (0.090-0.136) 0.089 (0.073-0.110) 0.105 (0.086-0.129)
نقطة قياس التفاعل · منطقة الحبل الشوكي: p < 0.001 مقارنة زوجية M1 ص < 0.001 p = 0.021 p = 0.400 p = 0.051
إخراج القلب (ل / دقيقة) 4.15 (3.69-4.61) 3.13 (2.67-3.60) 3.30 (2.84-3.76) 3.67 (3.20-4.13) 2.67 (2.00-2.93)
نقطة قياس التأثير الرئيسي:: p < 0.001 مقارنة زوجية M1 ص < 0.001 p = 0.007 p = 0.125 ص < 0.001
معدل ضربات القلب (bpm) 74.42 (53.70-95.15) 131.09 (110.36-151.82) 88.92 (68.19-109.65) 80.62 (59.89-101.35) 99.38 (78.65-120.11)
نقطة قياس التأثير الرئيسي: p = 0.002 مقارنة زوجية M1 ص < 0.001 p = 0.314 ص = 0.666 p = 0.092
حجم السكتة الدماغية (مل) 55.50 (49.20-61.81) 25.33 (19.03-31.64) 37.00 (30.69-43.31) 45.33 (39.03-51.64) 27.17 (20.86-33.47)
نقطة قياس التأثير الرئيسي: p < 0.001 مقارنة زوجية M1 ص < 0.001 ص < 0.001 p = 0.004 ص < 0.001
الضغط الشرياني الانقباضي يصعد الشريان الأورطي (مم زئبق) 94.36 (85.20-103.52) 122.05 (112.89-131.20) 76.72 (67.56-85.88) 88.36 (79.20-97.52) 73.36 (64.20-82.52)
نقطة قياس التأثير الرئيسي: p < 0.001 مقارنة زوجية M1 ص < 0.001 p = 0.006 ص = 0.321 p = 0.002
متوسط ضغط الشرياني التصاعدي الشرياني (مم زئبق) 78.18 (68.68-87.67) 107.29 (97.80-116.78) 59.08 (49.58-68.57) 70.38 (60.89-79.87) 58.35 (48.85-67.84)
نقطة قياس التأثير الرئيسي: p < 0.001 مقارنة زوجية M1 ص < 0.001 p = 0.005 p = 0.217 p = 0.004
ضغط الشريان الانبساطي يصعد الشريان الأورطي (مم زئبق) 59.20 (49.41-69.00) 93.76 (83.97-103.56) 45.18 (35.38-54.98) 52.48 (42.69-62.28) 45.33 (35.54-55.13)
نقطة قياس التأثير الرئيسي: p < 0.001 مقارنة زوجية M1 ص < 0.001 p = 0.038 p = 0.302 p = 0.040
مقاومة الأوعية الدموية الجهازية (dyn x sec x cm-5) 1421.13 (1236.94-1632.74) 208089.94 (181128.10-239085.87) 1335.36 (1162.29-1534.21) 1412.62 (1229.54-1622.97) 1807.46 (1573.21-2076.60)
نقطة قياس التأثير الرئيسي: p < 0.001 مقارنة زوجية M1 ص < 0.001 p = 0.407 p = 0.938 p = 0.005
تدفق (ل / دقيقة) الشريان الأورطي التنازلي 3.27 (0.96-5.58) 0 3.27 (0.96-5.58) 3.54 (1.23-5.85) 4.54 (2.32-6.85)
نقطة قياس التأثير الرئيسي: p = 0.003 مقارنة زوجية M1 p = 0.998 ص = 0.844 ص = 0.381

الجدول 1: التغيرات في البارامترات الدينامية أثناء البروتوكول. يتم إعطاء القيم كوسائل هامشية تقديرية معدلة خط الأساس مع فترات ثقة 95٪. يتم إعطاء القيم P غير المعدلة من اختبارات F للآثار الرئيسية لنقطة القياس لكل معلمة وكذلك تأثيرات التفاعل بين المنطقة ونقطة القياس للتشويش الدقيق للنخاع الشوكي العلوي والسفلي. كما يتم عرض قيم p غير المعدلة للمقارنات الثنائية لنقاط القياس الفردية مع M1. نقاط القياس هي: M1 = تحسين الهموديناميكية قبل نقص التروية / reperfusion، M2 = أثناء نقص التروية، M3 = 1 ساعة بعد إعادة التروية M4 = تحسين الموديناميك بعد الإقفارية / reperfusion، M5 = 4.5 ساعة بعد تحريض الإقفارية / reperfusion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SCI الناجم عن نقص التروية في الحبل الشوكي هو أحد المضاعفات الرئيسية لإصلاح الأبهر مع تأثير هائل على نتائج المريض1،2،3،4،10،11،12. العلاجات الموجهة نحو سرعة دوران الأوعية الدقيقة لمنع وعلاج SCI هي الأكثر واعدة. يوفر البروتوكول طريقة قابلة للاستنساخ لتقييم الأوعية الدقيقة في الحبل الشوكي في الوقت الحقيقي ويوفر القدرة على تقييم آثار النهج العلاجية الجديدة على دوران الأوعية الدقيقة في الحبل الشوكي في ظل ظروف نقص التروية / إعادة التروية.

هناك بعض الخطوات المنهجية الحاسمة في هذا النموذج التجريبي. لمنع فقدان الحيوانات ، يجب أن يكون الباحثون من ذوي الخبرة في تقنيات التخدير (غرز تصريف السوائل النخاعية ، والوصول إلى الأوعية الدموية السونوغرافية والعلاج الدموي أثناء التعرض الأبهري ، واللقط الشرياني الأبهري ، والتشويق) وكذلك في التقنيات الجراحية (استئصال القص ، والتعرض للأوعية ، والتعرض الجراحي للبرطا التنازلي). إدخال مسبار إبرة الحبل الشوكي يتطلب الخبرة والمعرفة العميقة بالتشريح والمهارات التقنية السليمة. ومع ذلك ، من خلال تجربتنا ، فإن منحنى التعلم حاد إلى حد كبير ، وسيحقق معظم الباحثين ذوي الخبرة النجاح في وقت قصير ، على الرغم من أنه يجب تجنب محاولات متعددة لمنع إصابات الحبل الشوكي التي يمكن أن تؤثر على المنهجية.

خطوة حاسمة أخرى هي التغيير من الجانب الأيمن إلى موقف سوبين لمنع خلع أو تلف مسبار إبرة الحبل الشوكي. لهذه المناورة، ينصح 4-5 أشخاص، الحشو السليم لموقع الإدراج أمر ضروري، وينبغي توخي الحذر الدقيق عدم خلع التحقيق. التعرض للهرطا تنازلي يتطلب بعض الخطوات الحاسمة كذلك. يجب تعبئة قمة الرئة اليسرى للسماح بالتراجع اللطيف للرئة اليسرى لفضح المجال الجراحي. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تشريح الجزء الجانبي الأيسر من الحجاب الحاجز لتسهيل التعرض. أثناء التحضير الأبهري ، هناك حاجة إلى التواصل الأمثل بين أولئك الباحثين الذين يجرون الجراحة وأولئك الذين يقدمون التخدير والإدارة الديناميكية الدموية لضمان الاستقرار الكافي لأمراض القلب والامرونة. أثناء اللقط عبر الأبهر ، يوصى بالضغط اليدوي للكافا الوريدية السفلية لتقليل الإرجاع الوريدي. دون هذه المناورة، قد تحدث زيادات شديدة في الحمل الذي يمكن أن يؤدي إلى إصابة عضلة القلبالضارة 39،40.

وينبغي إجراء إعادة التروية بحذر مع السوائل، فاسوبريسورس، و inotropes جاهزة للاستخدام. أثناء إعادة التروية ، تحدث تغييرات جذرية قد تؤدي إلى انخفاض ضغط الدم الشديد ، وarrythmias القلب ، وفشل الدورة الدموية41. ومع ذلك ، فإن المراقبة الحذرة للسلوك الهمودي ، والبدء الفوري للتدخلات ، وكذلك استخدام أداء منظم ولطيف خلال هذه المرحلة الحرجة يمكن أن تمنع فقدان الحيوانات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام فترات تصاعدية من اللقط عبر الأبهر، تليها فترات زمنية لتحسين التجديد، كما هو مستخدم في البروتوكول، يحفز آثار ما قبل التكييف الإقفارية التي تعزز الاستقرار الديناميكي الدموي أثناء إعادة التروية42،43.

يوفر النموذج القدرة على مراقبة دوران الحبل الشوكي بالإضافة إلى تقييم الدوران الكلي. بسبب فقدان التماسك الديناميكي الدموي كثيرا ما ينظر في الجراحة عالية الخطورة والمرضى الذين يعانون من أمراض خطيرة، والتقييم المباشر لدوائر الحبل الشوكي الدقيق ضروري13،30. وغالبا ما تستخدم دوران الأوعية الدقيقة تحت اللسان لتحل محل التقييم المباشر microcirculatory في الجهاز منالفائدة 44. ومع ذلك ، فقد تبين الانفصال بين دوران الأوعية الدقيقة تحت اللسان والأعضاء الحيوية ، مما يؤكد على قيمة التقييم المباشر للميكروسيلورات في الحبل الشوكي ، كما هو مستخدم في النموذج التجريبي45. وأخيرا، فإن النموذج لديه ميزة الرصد في الوقت الحقيقي لتدفق دم الحبل الشوكي بالمقارنة مع تقييم الفلورسنت المجهري، والذي يحد منه الاستخدام المتقطع وتحليل ما بعد الوفاة46. يمكن رؤية تأثير التقييم في الوقت الحقيقي على أفضل وجه عند النظر إلى تسجيلات المثال أثناء نقص التروية وكذلك تحريض التروية ، مما يظهر تغيرات سريعة في التروية الدقيقة في الحبل الشوكي. ومع ذلك ، ينبغي النظر إلى أن إدخال مسبار الليزر دوبلر في الحبل الشوكي يمكن أن يؤدي إلى إصابات صغيرة ، ولكنها كبيرة ، في الحبل الشوكي.

وبما أن سلامة الحبل الشوكي يمكن أن تؤثر على المعلمات الديناميكية الدموية ، فقد يكون هذا عيبا في الطريقة. ومع ذلك ، فإن استخدام تقنيات الليزر دوبلر لتقييم microperfusion الحبل الشوكي قد استخدمت سابقا47،48،49،50. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أننا لم نلاحظ التغيرات في الديناميكا الدموية بعد إدخال المسبار، لم نتمكن من استبعاد الآثار الديناميكية الدموية الناجمة عن هذه الطريقة. وتجدر الإشارة إلى أن التعديلات في الديناميكا الدموية قد تكون ناجمة أيضا عن استخدام حقن الغلاف المجهري، والتي من شأنها، مع ذلك، أن تكون ذات أهمية طفيفة في الحيوانات الكبيرة51. وعلاوة على ذلك، قد تتأثر الوظيفة الحسية أو الحركية بإدخال المسبار، وبالتالي، ينبغي إجراء استخدام التقييم الحسي أو الحركي المحتمل بحذر بالاقتران مع تقييم الليزر دوبلر.

وفي هذا الصدد، قد تكون تقنية الحقن المجهري مفيدة. وبالإضافة إلى ذلك، لا ينبغي استخدام التقنيات للتجارب المزمنة؛ ومع ذلك، هذا ينطبق أيضا على الحقن المجهرية، والتي تقتصر على التجارب الحادة لأنها تعتمد على تحليل الأنسجة بعد الوفاة. أجريت معظم الدراسات باستخدام تقنيات الليزر دوبلر في الحيوانات الصغيرة47،48،49،50 هنا ، ونحن نصف تقنية للاستخدام في الخنازير ، كنموذج حيواني كبير ، والتي يمكن أن تسهل الترجمة إلى الدراسات السريرية. تتغلب تقنية تقديم الباراميديا على مشكلة العمليات الشوكية الكبيرة في الخنازير ، مما يعقد الوضع السليم لمسابير الحبل الشوكي. وعلاوة على ذلك، فإن هذه التقنية لديها ميزة أن استئصال الأمينيك أو إزالة الأنسجة دورا ليست هناك حاجة، ومنع فقدان مستمر للخمور. كما ضغط السائل النخاعي له تأثير هائل على الحبل الشوكي التشوش32, النموذج لديه ميزة قياس وتحسين ضغط السائل النخاعي بالإضافة إلى التروية الدقيقة الحبل الشوكي وسوف تعالج تأثير ضغط السائل النخاعي على النخاع الشوكي microperfusion في المشاريع المستقبلية.

البروتوكول لديه بعض القيود التي ينبغي ذكرها. تختلف القيم المطلقة لتدفق الحبل الشوكي بشكل كبير بين الحيوانات بسبب الاختلافات في موضع المسبار الدقيق وقرب أوعية الحبل الشوكي الأكبر. لذلك، يجب إجراء تعديلات الأساس عند مقارنة القيم. ومع ذلك، فإن الاختلافات داخل الفرد بين نقاط القياس متسقة للغاية طالما يتم توخي الحذر الدقيق لتجنب تحركات مسبار الإبرة أثناء البروتوكول. وعلاوة على ذلك، لم تصمم هذه الدراسة كدراسة مقارنة بين الليزر دوبلر وطرق الميكروسفير الفلورية. وبالنظر إلى عدد الحيوانات، لم نقوم بتحليل الارتباط بين هاتين الطريقتين.

على الرغم من أن كلا الأسلوبين أظهرت سلوكا مماثلا مع تخفيضات كبيرة أثناء نقص التروية والتعافي بعد إعادة التروية لكليهما ، يجب معالجة مقارنة الطرق باستخدام دراسات مصممة بشكل صحيح في المستقبل. ومع ذلك، فإن استخدام المجهريات بالإضافة إلى تمكين تقييم السلوكيات المختلفة للنخاع الشوكي العلوي والسفلي microperfusion. بالإضافة إلى ذلك ، كشف التحليل النسيجي فقط نخر الحبل الشوكي المعتدل مقارنة بنماذج أخرى من نقص التروية في الحبل الشوكي37. قد يؤدي إطالة مدة نقص التروية وكذلك حذف تدابير ما قبل التكييف إلى تغييرات أكثر حدة قد يرغب فيها بعض الباحثين. على الرغم من أننا قمنا بتقييم التغيرات الهسثولوجية الخفيفة فقط، إلا أن هذا قد يكون مختلفا مع فترة أطول من نقص التروية. وفي هذا الصدد، قد تكون فترة أطول بعد الإقفارية/التروية قبل إنهاء البروتوكول قد أدت أيضا إلى تغييرات في الهسهولوجيا أكثر حدة. ومع ذلك، مكن البروتوكول الاستقرار الديناميكي الدموي بعد ساعة واحدة من إعادة التشوه دون الحاجة إلى تطبيق إنوتروب إضافي أو حتى مستمر أو فاسوبريسور.

من أجل تقييم التدخلات الديناميكية الدموية المختلفة، يوفر هذا النموذج الظروف المثلى. على الرغم من أننا استخدمنا تحسين السوائل كمثال على التدخل الديناميكي الدموي ، إلا أنه يمكن تقييم طرق أخرى بهذه الطريقة. في حين أن هذا البروتوكول يوفر تقييم الأوعية الدقيقة في نموذج من نقص التروية / إعادة التروية ، فإن مدة نقص التروية تحد من تقييم النهج العلاجية أثناء نقص التروية قبل إعادة التروية. وعلاوة على ذلك، خلال نقص التروية، حدث اختلاف في التغيرات في الدورة الدموية (على سبيل المثال، ارتفاع ضغط الدم، وانخفاض ضغط الدم، عدم انتظام دقات القلب، بطء القلب، فضلا عن arrythmias القلب). ويؤثر الانسداد اليدوي للتدفق الداخلي كذلك على المتغيرات الدينامية الدموية خلال هذه المرحلة. لذلك ، لا ينصح البروتوكول لتقييم النهج العلاجية أثناء نقص التروية قبل إعادة التروية. ومع ذلك، يمكن الجمع بين الإعدادات التجريبية الأخرى، مثل استخدام تقنيات الانسداد أو الربط، مع ليزر الحبل الشوكي / تقييم مسبار إبرة دوبلر، كما هو موضح في هذا البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

قسطنطين ج.C. تريبتي حصل على جائزة فخرية للمحاضرات التي ألقاها ماكيت. جميع المؤلفين الآخرين يعلنون عدم وجود تضارب في المصالح. تم دعم هذه الدراسة من قبل الجمعية الأوروبية لعلم التخدير منحة بدء التحقيق الشاب لعام 2018.

Acknowledgments

ويود المؤلفان أن يشكرا لينا بريكس، V.M D، معهد بحوث الحيوان، كلية هانوفر الطبية، وكذلك السيدة جوتا دامان، مرفق بحوث رعاية الحيوانات، المركز الطبي الجامعي هامبورغ - إيبيندورف، ألمانيا، على توفير الرعاية الحيوانية قبل الجراحة ومتغلغلة ومساعدتهم التقنية في التعامل مع الحيوانات. كما يود المؤلفان أن يشكرا الدكتور دانيال مانزوني، قسم جراحة الأوعية الدموية، هوبيتال كيرشبيرغ، لكسمبرغ، على مساعدته التقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CardioMed Flowmeter Medistim AS, Oslo, Norway CM4000 Flowmeter for Flow-Probe Femoral Artery
CardioMed Flow-Probe, 5mm Medistim AS, Oslo, Norway PS100051 Flow-Probe Femoral Artery
COnfidence probe,  Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA MA16PAU Flow-Probe Aorta
16 mm liners
DIVA Sevoflurane Vapor Dräger Medical, Lübeck, Germany Vapor
Hotline Level 1 Fluid Warmer Smiths Medical Germany GmbH, Grasbrunn, Germany HL-90-DE-230 Fluid Warmer
Infinity Delta Dräger Medical, Lübeck, Germany Basic Monitoring Hardware
Infinity Hemo Dräger Medical, Lübeck, Germany Basic Pressure Monitoring and Pulmonary Thermodilution Hardware
LabChart Pro ADInstruments Ltd., Oxford, UK v8.1.16 Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Software
LiquoGuard 7 Möller Medical GmbH, Fulda, Germany Cerebrospinal Fluid Drainage System
Millar Micro-Tip Pressure Catheter (5F, Single, Curved, 120cm, PU/WD) ADInstruments Ltd., Oxford, UK SPR-350 Pressure-Tip Catheter Aorta
moor VMS LDF moor Instruments, Devon, UK Designated Laser-Doppler Hardware
moor VMS Research Software moor Instruments, Devon, UK Designated Laser-Doppler Software
Perivascular Flow Module Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA TS 420 Flow-Module for Flow-Probe Aorta
PiCCO 2, Science Version Getinge AB, Göteborg, Sweden v. 6.0 Blood Pressure and Transcardiopulmonary Monitoring Hard- and Software
PiCCO 5 Fr. 20cm Getinge AB, Göteborg, Sweden Thermistor-tipped Arterial Line 
PowerLab ADInstruments Ltd., Oxford, UK PL 3516 Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Hardware
QuadBridgeAmp ADInstruments Ltd., Oxford, UK FE 224 Four Channel Bridge Amplifier for Laser-Doppler and Invasive Blood Pressure Aquisition
Silverline Spiegelberg, Hamburg, Germany ELD33.010.02 Cerebrospinal Fluid Drainage
SPSS statistical software package  IBM SPSS Statistics Inc., Armonk, New York, USA v. 27 Statistical Software
Twinwarm Warming System Moeck & Moeck GmbH, Hamburg, Germany 12TW921DE Warming System
Universal II Warming Blanket Moeck & Moeck GmbH, Hamburg, Germany 906 Warming Blanket
VP 3 Probe, 8mm length (individually manufactured) moor Instruments, Devon, UK Laser-Doppler Probe
Zeus Dräger Medical, Lübeck, Germany Anesthesia Machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Etz, C. D., et al. Contemporary spinal cord protection during thoracic and thoracoabdominal aortic surgery and endovascular aortic repair: a position paper of the vascular domain of the European Association for Cardio-Thoracic Surgerydagger. The European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 47 (6), 943-957 (2015).
  2. Schraag, S. Postoperative management. Best Practice & Research Clinical Anaesthesiology. 30 (3), 381-393 (2016).
  3. Cambria, R. P., et al. Thoracoabdominal aneurysm repair: results with 337 operations performed over a 15-year interval. Annals of Surgery. 236 (4), 471-479 (2002).
  4. Becker, D. A., McGarvey, M. L., Rojvirat, C., Bavaria, J. E., Messe, S. R. Predictors of outcome in patients with spinal cord ischemia after open aortic repair. Neurocritical Care. 18 (1), 70-74 (2013).
  5. McGarvey, M. L., et al. The treatment of spinal cord ischemia following thoracic endovascular aortic repair. Neurocritical Care. 6 (1), 35-39 (2007).
  6. Fukui, S., et al. Development of collaterals to the spinal cord after endovascular stent graft repair of thoracic aneurysms. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 52 (6), 801-807 (2016).
  7. Augoustides, J. G., Stone, M. E., Drenger, B. Novel approaches to spinal cord protection during thoracoabdominal aortic interventions. Current Opinion in Anesthesiology. 27 (1), 98-105 (2014).
  8. Bicknell, C. D., Riga, C. V., Wolfe, J. H. Prevention of paraplegia during thoracoabdominal aortic aneurysm repair. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 37 (6), 654-660 (2009).
  9. Feezor, R. J., Lee, W. A. Strategies for detection and prevention of spinal cord ischemia during TEVAR. Seminars in Vascular Surgery. 22 (3), 187-192 (2009).
  10. Heidemann, F., et al. Incidence, predictors, and outcomes of spinal cord ischemia in elective complex endovascular aortic repair: An analysis of health insurance claims. Journal of Vascular Surgery. , (2020).
  11. Rizvi, A. Z., Sullivan, T. M. Incidence, prevention, and management in spinal cord protection during TEVAR. Journal of Vascular Surgery. 52 (4), Suppl 86-90 (2010).
  12. Wortmann, M., Bockler, D., Geisbusch, P. Perioperative cerebrospinal fluid drainage for the prevention of spinal ischemia after endovascular aortic repair. Gefasschirurgie. 22, Suppl 2 35-40 (2017).
  13. Saugel, B., Trepte, C. J., Heckel, K., Wagner, J. Y., Reuter, D. A. Hemodynamic management of septic shock: is it time for "individualized goal-directed hemodynamic therapy" and for specifically targeting the microcirculation. Shock. 43 (6), 522-529 (2015).
  14. Moore, J. P., Dyson, A., Singer, M., Fraser, J. Microcirculatory dysfunction and resuscitation: why, when, and how. British Journal of Anaesthesia. 115 (3), 366-375 (2015).
  15. De Backer, D., Creteur, J., Preiser, J. C., Dubois, M. J., Vincent, J. L. Microvascular blood flow is altered in patients with sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (1), 98-104 (2002).
  16. De Backer, D., Creteur, J., Dubois, M. J., Sakr, Y., Vincent, J. L. Microvascular alterations in patients with acute severe heart failure and cardiogenic shock. American Heart Journal. 147 (1), 91-99 (2004).
  17. Sakr, Y., Dubois, M. J., De Backer, D., Creteur, J., Vincent, J. L. Persistent microcirculatory alterations are associated with organ failure and death in patients with septic shock. Critical Care Medicine. 32 (9), 1825-1831 (2004).
  18. Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
  19. Donati, A., et al. From macrohemodynamic to the microcirculation. Critical Care Research and Practice. 2013, 892710 (2013).
  20. Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine. 32 (18), Phila Pa 1976 1955-1962 (2007).
  21. Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine. 37 (22), Phila Pa 1976 1376-1382 (2012).
  22. Han, S., et al. Rescuing vasculature with intravenous angiopoietin-1 and alpha v beta 3 integrin peptide is protective after spinal cord injury. Brain. 133, Pt 4 1026-1042 (2010).
  23. Muradov, J. M., Ewan, E. E., Hagg, T. Dorsal column sensory axons degenerate due to impaired microvascular perfusion after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 249, 59-73 (2013).
  24. Guillen, J., , FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51, 311-321 (2012).
  25. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. Osteoarthritis Cartilage. 20, 256-260 (2012).
  26. Ospina-Tascon, G., et al. Effects of fluids on microvascular perfusion in patients with severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36 (6), 949-955 (2010).
  27. Pottecher, J., et al. Both passive leg raising and intravascular volume expansion improve sublingual microcirculatory perfusion in severe sepsis and septic shock patients. Intensive Care Medicine. 36 (11), 1867-1874 (2010).
  28. De Backer, D., Ortiz, J. A., Salgado, D. Coupling microcirculation to systemic hemodynamics. Current Opinion in Critical Care. 16 (3), 250-254 (2010).
  29. van Genderen, M. E., et al. Microvascular perfusion as a target for fluid resuscitation in experimental circulatory shock. Critical care medicine. 42 (2), 96-105 (2014).
  30. Ince, C. Hemodynamic coherence and the rationale for monitoring the microcirculation. Critical care. 19, Suppl 3 8 (2015).
  31. Kise, Y., et al. Directly measuring spinal cord blood flow and spinal cord perfusion pressure via the collateral network: correlations with changes in systemic blood pressure. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 149 (1), 360-366 (2015).
  32. Haunschild, J., et al. Detrimental effects of cerebrospinal fluid pressure elevation on spinal cord perfusion: first-time direct detection in a large animal model. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 58 (2), 286-293 (2020).
  33. Wipper, S., et al. Impact of hybrid thoracoabdominal aortic repair on visceral and spinal cord perfusion: The new and improved SPIDER-graft. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 158 (3), 692-701 (2019).
  34. Kluttig, R., et al. Invasive hemodynamic monitoring of aortic and pulmonary artery hemodynamics in a large animal model of ARDS. Journal of Visualized Experiments. (141), e57405 (2018).
  35. Detter, C., et al. Fluorescent cardiac imaging: a novel intraoperative method for quantitative assessment of myocardial perfusion during graded coronary artery stenosis. Circulation. 116 (9), 1007-1014 (2007).
  36. Wipper, S., et al. Distinction of non-ischemia inducing versus ischemia inducing coronary stenosis by fluorescent cardiac imaging. International Journal of Cardiovascular Imaging. 32 (2), 363-371 (2016).
  37. Etz, C. D., et al. Spinal cord blood flow and ischemic injury after experimental sacrifice of thoracic and abdominal segmental arteries. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 33 (6), 1030-1038 (2008).
  38. Saugel, B., Scheeren, T. W. L., Teboul, J. L. Ultrasound-guided central venous catheter placement: a structured review and recommendations for clinical practice. Critical care. 21 (1), 225 (2017).
  39. Marty, B., et al. Partial inflow occlusion facilitates accurate deployment of thoracic aortic endografts. Journal of Endovascular Therapy. 11 (2), 175-179 (2004).
  40. Matyal, R., et al. Monitoring the variation in myocardial function with the Doppler-derived myocardial performance index during aortic cross-clamping. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 26 (2), 204-208 (2012).
  41. Miller, R. D. Miller'sanesthesia. 8th Edition. , Elsevier. Philadelphia. (2015).
  42. Martikos, G., et al. Remote ischemic preconditioning decreases the magnitude of hepatic ischemia-reperfusion injury on a swine model of supraceliac aortic cross-clamping. Annals of Vascular Surgery. 48, 241-250 (2018).
  43. Lazaris, A. M., et al. Protective effect of remote ischemic preconditioning in renal ischemia/reperfusion injury, in a model of thoracoabdominal aorta approach. Journal of Surgical Research. 154 (2), 267-273 (2009).
  44. Ince, C., et al. Second consensus on the assessment of sublingual microcirculation in critically ill patients: results from a task force of the European Society of Intensive Care Medicine. Intensive Care Medicine. 44 (3), 281-299 (2018).
  45. Edul, V. S., et al. Dissociation between sublingual and gut microcirculation in the response to a fluid challenge in postoperative patients with abdominal sepsis. Annals of intensive care. 4, 39 (2014).
  46. Schierling, W., et al. Sonographic real-time imaging of tissue perfusion in a porcine haemorrhagic shock model. Ultrasound in Medicine and Biology. 45 (10), 2797-2804 (2019).
  47. Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat. Journal of Visualized Experiments. (135), e56243 (2018).
  48. Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Meliorating microcirculatory with melatonin in rat model of spinal cord injury using laser Doppler flowmetry. Neuroreport. 27 (17), 1248-1255 (2016).
  49. Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Melatonin prevents blood vessel loss and neurological impairment induced by spinal cord injury in rats. Journal of Spinal Cord Medicine. 40 (2), 222-229 (2017).
  50. Phillips, J. P., Cibert-Goton, V., Langford, R. M., Shortland, P. J. Perfusion assessment in rat spinal cord tissue using photoplethysmography and laser Doppler flux measurements. Journal of Biomedical Optics. 18 (3), 037005 (2013).
  51. Glenny, R. W., Bernard, S. L., Lamm, W. J. Hemodynamic effects of 15-microm-diameter microspheres on the rat pulmonary circulation. Journal of Applied Physiology. 89 (1985), 499-504 (2000).

Tags

الطب، العدد 166، إصابة الحبل الشوكي، نقص تروية الحبل الشوكي، تخثر الحبل الشوكي، العلاج الحراري، دوران الأوعية الدقيقة، ضغط السائل النخاعي، ليزر دوبلر
في الوقت الحقيقي تقييم النخاع الشوكي Microperfusion في نموذج Porcine من الإقفارية / Reperfusion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Behem, C. R., Friedheim, T., Wipper, … More

Behem, C. R., Friedheim, T., Wipper, S. H., Pinnschmidt, H. O., Graessler, M. F., Gaeth, C., Holthusen, H., Rapp, A., Suntrop, T., Haunschild, J., Etz, C. D., Trepte, C. J. C. Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion. J. Vis. Exp. (166), e62047, doi:10.3791/62047 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter