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Methodenartikel

Ein schneller Food-Preference-Test in Drosophila

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DOI:

10.3791/62051

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11. Februar 2021

 , 
1Monell Chemical Senses Center, 2Department of Physiology, The Diabetes Research Center, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll für einen Fütterungstest mit zwei Wahlmöglichkeiten für Fliegen. Dieser Fütterungstest ist schnell und einfach zu betreiben und eignet sich nicht nur für kleine Laborforschung, sondern auch für Verhaltensbildschirme mit hohem Durchsatz bei Fliegen.

Zusammenfassung

Um Lebensmittel mit Nährwert auszuwählen und gleichzeitig den Verzehr schädlicher Stoffe zu vermeiden, benötigen Tiere ein ausgeklügeltes und robustes Geschmackssystem, um ihre Lebensmittelumgebung zu bewerten. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist ein genetisch traktierbarer Modellorganismus, der weit verbreitet ist, um die molekularen, zellulären und neuronalen Grundlagen der Lebensmittelpräferenz zu entschlüsseln. Um die Präferenz von Fliegenfutter zu analysieren, ist eine robuste Fütterungsmethode erforderlich. Hier wird ein Fütterungstest mit zwei Wahlmöglichkeiten beschrieben, der streng, kostensparend und schnell ist. Der Assay ist Auf Petri-Schale-basist und beinhaltet die Zugabe von zwei verschiedenen Lebensmitteln mit blauem oder rotem Farbstoff zu den beiden Hälften der Schale ergänzt. Dann werden 70 vorverhungerte, 2-4 Tage alte Fliegen in das Gericht gelegt und dürfen für ca. 90 min zwischen blauen und roten Lebensmitteln im Dunkeln wählen. Auf die Untersuchung des Bauches jeder Fliege folgt die Berechnung des Präferenzindex. Im Gegensatz zu Multiwell-Platten benötigt jede Petrischale nur 20 s zum Füllen und spart Zeit und Mühe. Dieser Fütterungstest kann verwendet werden, um schnell festzustellen, ob Fliegen ein bestimmtes Futter mögen oder nicht mögen.

Einleitung

Trotz dramatischer Unterschiede in der anatomischen Struktur von Geschmacksorganen zwischen Fliegen und Säugetieren sind die Verhaltensreaktionen der Fliegen auf viele Tastantsubstanzen auffallend ähnlich wie die von Säugetieren. Zum Beispiel bevorzugen Fliegen Zucker1,2,3,4,5,6,7,8, Aminosäuren9,10, und niedriges Salz11, die Nährstoffe anzeigen, aber ablehnen bittere Lebensmittel12,13,14,15, die ungenießbar oder giftig sind. In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich Fliegen als ein sehr wertvoller Modellorganismus erwiesen, um das Verständnis vieler grundlegender Fragen im Zusammenhang mit Geschmacksempfinden und Lebensmittelkonsum zu fördern, einschließlich Tastanterkennung, Geschmacktransduktion, Geschmacksplastizität und Fütterungsverordnung16,17,18,19,20. Bemerkenswerterweise haben eine Reihe von Studien gezeigt, dass die Geschmacktransduktion und die neuronalen Schaltkreismechanismen, die der Geschmackswahrnehmung zugrunde liegen, analog zwischen Fruchtfliegen und Säugetieren sind. Daher dient die Fruchtfliege als idealer Versuchsorganismus, der es forschern ermöglicht, evolutionär konservierte Konzepte und Prinzipien aufzudecken, die die Erkennung und den Verzehr von Lebensmitteln im Tierreich regeln.

Um Geschmacksempfinden bei Fliegen zu untersuchen, ist es wichtig, einen schnellen und strengen Test zu etablieren, um die Lebensmittelpräferenz objektiv zu messen. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Fütterungsmethoden, wie färbebasierte Assays11,12,13,21,22,23, die Fly Proboscis Extension Response Assay24, die Capillary Feeder (CAFE) Assay25,26, Der Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC) Assay27und andere kombinatorische Methoden wurden entwickelt, um die Lebensmittelpräferenz und/oder die Nahrungsaufnahme für Fruchtfliegen28,29,30,31quantitativ zu messen. Eines der beliebten Fütterungsparadigmen ist der auf Farbstoffbasierende Zwei-Wahl-Fütterungstest mit entweder einer Multiwell-Mikrotiterplatte12,21,32 oder, wie hier beschrieben, einer kleinen Petrischale11,22 als Futterkammer. Dieser Test basiert auf der Transparenz des Abdomens der Fliege. Während dieses Testes werden fliegende in die Futterkammer gelegt und mit zwei Nahrungsoptionen gemischt mit rotem Farbstoff oder blauem Farbstoff präsentiert. Sobald der Test abgeschlossen ist, fliegen Abdomen erscheinen rot oder blau, je nachdem, welche Nahrung sie konsumiert haben.

Sowohl die Petri-Schale als auch die Futtertests auf Multiwell-Platte-Farbe sind sehr robust und liefern ungefähr die gleichen Ergebnisse. Mit diesen beiden Assays wurden zahlreiche wichtige Entdeckungen und Durchbrüche gemacht, um die sehr diversifizierten Rezeptoren und Zellen zu entschlüsseln, die für die Erfassung von Nahrungsgeschmack und Lebensmitteltextur11,12,21,22,32,33verantwortlich sind. Im färbenbasierten Assay erfordert ein Versuchsschritt, der viel Zeit und Mühe erfordert, die Zubereitung und Verladung von Lebensmitteln in die Futterkammer. Um die Zubereitungs- und Ladezeit der Nahrung zu reduzieren, wurde dieser Test durch den Austausch der Multiwell-Mikrotiterplatte durch eine kleine Petrischale modifiziert, die in zwei gleiche Fächer unterteilt ist. In der Petri-Schale-basierte Assay, zwei verschiedene Lebensmittel mit blauen oder roten Farbstoff ergänzt werden, um die beiden Hälften der Schale hinzugefügt. Dann werden 70 vorverhungerte, 2-4 Tage alte Fliegen in das Gericht gelegt und dürfen für ca. 90 min zwischen blauen und roten Lebensmitteln im Dunkeln wählen. Anschließend wird der Bauch jeder Fliege untersucht und der Präferenzindex (PI) berechnet.

Dieser Petri-Dish-basierte Zwei-Wahl-Futter-Assay ist erschwinglich, einfach und schnell. Eine Multiwell-Platte benötigt ca. 110 s zu füllen, während jede Petrischale nur 20 s benötigt. Darüber hinaus erfordert die Multiwell-Platte das Pipettieren kleiner Mengen von Lebensmitteln in eine große Anzahl kleiner Brunnen (z. B. 60 oder mehr Brunnen pro Platte), was erhebliche Präzision und Aufmerksamkeit erfordert. Umgekehrt erfordert der Petri-Dish-basierte Assay nur zwei Aktionen pro Platte. Da der Fütterungstest eine große Anzahl von Replikationen umfassen kann, spart der Petri-Dish-basierte Assay eine nicht triviale Menge an Zeit und Mühe. Dieser Assay liefert Ergebnisse, die denen aus dem multiwell-basierten Assay entsprechen und hat sich als erfolgreich bei der Behandlung vieler grundlegender Fragen in der Geschmackswahrnehmung erwiesen, einschließlich Salzgeschmackcodierung11, Geschmackplastizität modifiziert durch Lebensmittelerfahrung22, und die molekulare Basis der Lebensmitteltextur Sensation33. Zusammenfassend ist dieser Petri-Dish-basierte Zwei-Wahl-Assay ein leistungsfähiges Werkzeug, um zu untersuchen, wie Fliegen externe und innere Nährstoffmilieus wahrnehmen, um ein angemessenes Fütterungsverhalten zu entlocken.

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Protokoll

1. Montage der Assaykammern

HINWEIS: Während dieses Protokoll die Verwendung einer 35 mm Petrischale beschreibt(Abbildung 1A), kann der gewünschte Effekt mit jedem wasserdichten, glatten Gefäß erzielt werden, das zerkäut und abgedeckt werden kann.

  1. Zuerst eine 35 mm Petrischale mit Deckelfolie, indem Sie eine Länge aus Kunststoff (5 mm in der Breite und 3 mm Höhe) auf der Mittellinie mit wasserdichtem Klebstoff fixieren und zwei wasserdichte Fächer bilden. Bestätigen Sie, dass die Dichtung vollständig ist, um Leckagen zu vermeiden, die dazu führen können, dass die beiden Lebensmittelsubstrate gemischt werden.
    HINWEIS: Verwenden Sie dieses Gerät nach der Montage wieder, solange die Dichtung hält.

2. Zubereitung von Hungerfläschchen

  1. Bereiten Sie eine ausreichende Anzahl von leeren Kunststoff-Fliegenfläschchen; dann, lose verdichten ein Stück Tissuepapier an der Unterseite. Komprimieren Sie das Tissuepapier so stark, dass es den Raum füllt, aber nicht so sehr, dass es eine dichte Masse bildet.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass es keine tiefen Spalten oder Falten im Gewebe gibt, da dies dazu führen kann, dass Fliegen gefangen werden.
  2. Fügen Sie der Durchstechflasche 3 ml reines Wasser hinzu, so dass das Gewebe vollständig gesättigt ist, aber es gibt kein stehendes Wasser. Stellen Sie sicher, dass sich an der Wand der Durchstechflasche keine großen Tröpfchen überschüssigen Wassers befinden. Alternativ kann das getränkte Papier durch Die Herstellung einer 1% w/v Agar-Lösung (ohne Saccharose) ersetzt werden, indem 5 ml 1% Agarose zu jeder leeren Durchstechflasche hinzugefügt werden und die Agarose bei Raumtemperatur erstarren kann.

3. Nasser Hunger von Fliegen vor dem Experiment

  1. Initiieren Sie den Hunger 24 h vor dem Zeitpunkt des Experiments. Unter CO 2-Anästhesie fliegen Gruppen von 70, 2-4 Tage alten Fliegen in die vorbereiteten Hungerfläschchen und beschriften jede Durchstechflasche mit dem Genotyp und der Zeit des Hungers.

4. Reagenzien-Setup

  1. Zubereitung von Farbstoffen
    HINWEIS: Vor der Durchführung von Experimenten ist es wichtig, einen vorläufigen Kontrolltest durchzuführen, um die richtigen Konzentrationen von roten und blauen Farbstoffen zu bestimmen.
    1. Für den Kontrolltest, bereiten Sie eine Reihe von Verdünnungen für jeden Farbstoff, und führen Sie die Fütterung Assay mit der gleichen Nahrung mit einer anderen Farbe. Verwenden Sie die Ergebnisse, um Zwei-Färbe-Konzentrationen (eine rote, eine blaue) zu identifizieren, die einen PI von 0 ergibt, wenn keine experimentelle Verbindung hinzugefügt wird (siehe Abschnitt 7).
      HINWEIS: Zum Beispiel wurde die endgültige blaue Farbstoffkonzentration auf 50 m festgelegt und gegen eine Reihe von roten Farbstoffkonzentrationen getestet. Basierend auf der Roten Farbstoff-Dosierungskurve lag die optimale rote Farbstoffkonzentration bei 210 M, was eine minimale Farbverzerrung ergab (Abbildung 1B). Eine höhere rote Farbstoffkonzentration treibt Fliegen dazu, rote Nahrung zu bevorzugen, während eine niedrigere Konzentration Fliegen dazu treibt, blaue Nahrung zu bevorzugen. Verfeinern Sie sorgfältig die blauen oder roten Farbstoffkonzentrationen in Schritten von 1 m, da Unterschiede dieser Größenordnung und größer die experimentellen Ergebnisse beeinflussen können.
  2. Zubereitung von 1% Agarose
    1. Kombinieren Sie 0,5 g Agarose und 50 ml reines Wasser (oder einige davon) in einem Mikrowellen-sicheren Gefäß. Mikrowelle die Agarose-Lösung, bis sie gelöst, rühren Sie es nach Bedarf.
  3. Zubereitung anderer Lebensmittelbestandteile
    1. Lösen Sie jede Lebensmittelkomponente, einschließlich Saccharose und alle experimentellen Verbindungen, in Wasser mit einer 100-fachen oder höheren Konzentration der endgeprüften Konzentration auf.
      HINWEIS: Das Gesamtvolumen jeder Lebensmittelzutat, die 1% Agar zugesetzt wird, sollte 1 ml pro 10 ml geschmolzenem Agar nicht überschreiten. Andernfalls kann die Agarose zu verdünnt sein und nicht entsprechend verfestigen.
  4. Zubereitung von Lebensmittelmedien
    1. Agar, Farbstoff und die gewünschte Versuchsmasse in konischen Polypropylenzentrifugenröhren (15 oder 50 ml) mischen; verwenden Sie Wasser anstelle des experimentellen Tastants in der Kontrollnahrung. Tun Sie dies, während der Agar noch vollständig flüssig ist und gründlich mit einem Wirbelmischer mischen. Bewahren Sie die Schläuche in einem 60 °C-Wasserbad auf, während Sie nicht verwendet werden, um zu verhindern, dass die Agarose aushärtet, bevor sie in Geschirr verteilt wird.
  5. Zubereitung von Gerichten für das Experiment
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Gerichte vollständig trocken sind, bevor Sie beginnen.
    1. Pipette 1 ml rotes experimentelles Nahrungsmedium in eine Seite der Assayschale(Abbildung 1A); für die gewünschte Anzahl von Gerichten wiederholen. Lassen Sie die Agarose abkühlen, bis fest (3-5 min), und dann Pipette 1 ml blaue Kontrollfutter in die andere Seite des Geschirrs(Abbildung 1A). Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem Rot/experimentellen blauen Paar.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Gerichte vollständig eingestellt sind, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Verwenden Sie das Geschirr innerhalb von 30 min.

5. Initiierung des Zwei-Wege-Fütterungs-Assays

  1. Vorübergehende Lähmung experimentelle fliegenlinien auf Eis, bis keine offensichtlichen motorischen Aktivitäten wie Fliegen und Klettern beobachtet werden. Sobald die Fliegen immobilisiert sind, umkehren Sie vorsichtig die Durchstechflasche und tippen Sie, um alle Fliegen in die Kontrollkammer zu übertragen.
    HINWEIS: Kälteschock dauert 3-5 min. Eine längere Exposition gegenüber Kälte kann die Physiologie und Gesundheit der Fliege beeinträchtigen und sollte daher vermieden werden.
  2. Legen Sie die Abdeckung schnell auf die Kammer und legen Sie sie beiseite. Sobald alle Fliegen übertragen sind, bewegen Sie alle Kammern in einen dunklen, geschlossenen Raum. Lassen Sie den Test 90 min laufen.
    HINWEIS: Eine dunkle Umgebung minimiert den Einfluss des Sichtweges der Fliege auf das Fütterungsverhalten und entfernt alle Umwelthinweise von außerhalb der Schale.

6. Beenden des Zwei-Wege-Fütterungs-Assays

  1. Nach 90 min sind die Kammern in einen -20 °C Gefrierschrank überführen, um die Fliegen zu opfern. Zählen Sie nach 1 h die Fliegen.
    HINWEIS: Umkehren Sie jede Petrischale, bevor Sie die Schale in den Gefrierschrank legen, um sicherzustellen, dass keine Fliegen auf das Essen eingefroren werden.

7. Zuweisen eines Präferenzindex (PI) zur Bestimmung der Lebensmittelpräferenz

  1. Untersuchen Sie unter einem Standard-Seziermikroskop die Bauchfarbe der Fliegen in jeder einzelnen Schale. Zählen Sie die Fliegen entweder rot, blau oder lila nach der Farbe ihres Bauches (Abbildung 2A). Zählen Sie die Fliege, wenn ihr Bauch mehr als 50% gefärbt ist, was auf eine robuste Fütterung hinweist (Abbildung 2B). Schließen Sie die Fliege aus, wenn ihr Bauch nur einen winzigen Nahrungsfleck enthält, was auf schlechtes Essen hinweist (Abbildung 2C).
  2. Nachdem die Anzahl der Fliegen, die blaue, rote oder sowohl blaue als auch rote Lebensmittel essen, gezählt wurde, verwenden Sie die folgende Gleichung, um jeder Petrischale einen Präferenzindex (PI) zuzuweisen:

PI = (Anzahl der Fliegen, die experimentelle Nahrung essen) - (Anzahl der Fliegen, die Kontrollnahrung essen) / (Anzahl der Fliegen, die experimentelle Nahrung essen) + (Anzahl der Fliegen, die Kontrollnahrung essen) + (Anzahl der Fliegen, die beide essen)

PI > 0 gibt eine Präferenz für die experimentelle Verbindung an, PI < 0 zeigt eine Abneigung gegen die versuchsweise Verbindung an, und PI = 0 zeigt keine Auswirkung der Verbindung auf das Fütterungsverhalten an.

8. Reinigung der Assaykammern

  1. Reinigen Sie die Petrischalen umgehend, indem Sie das Nahrungssubstrat herauskratzen und mit duftender Seife und Wasser ausspülen. Die Petrischalen über Nacht in destilliertem Wasser einweichen. Prüfen Sie, ob die Trenndichtung in jeder Schale noch wasserdicht ist, dann lassen Sie die Tellerluft trocknen.
    HINWEIS: Nachdem sichergestellt ist, dass es keine Rest-Agarose- oder Farbstofffärbung gibt, sind die Petri-Gerichte wieder einsatzbereit.

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Ergebnisse

In diesem Test wurde eine 35-mm-Schale in zwei gleiche Futterfächer unterteilt, wobei jede Hälfte der Schale Agarose-Lebensmittel enthält, die entweder mit blauem oder rotem Farbstoff gekoppelt sind (Abbildung 1A). Um die Farbverzerrung auszuschließen, wurden die blauen und roten Farbstoffkonzentrationen sorgfältig verfeinert, um eine ungefähre "0" PI zu ergeben, wenn nur diese beiden Farbstoffe hinzugefügt wurden (Abbildung 1B). Sobald die Petrischale mit getes...

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Diskussion

Diese Methode umfasst mehrere entscheidende Schritte, bei denen Probleme auftreten können. Stellen Sie zunächst sicher, dass Fliegen eine ausreichende Menge an Nahrung aufnehmen, um stabile Daten bereitzustellen. Wenn Fliegen schlecht essen, stellen Sie sicher, dass die Fliegen mindestens 24 h nass verhungert sind und dass die experimentellen Medien mindestens eine minimale Saccharosekonzentration (2 mM) enthalten. Um den Verzehr von Lebensmitteln weiter anzukurbeln, verlängern Sie die Nasshungerzeit über 24 h, abhängig ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte oder konkurrierende finanzielle Interessen.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Tingwei Mi für die Unterstützung bei der Optimierung des Fütterungsassays mit zwei Wahlmöglichkeiten. Sie möchten auch Samuel Chan und Wyatt Koolmees für ihre Kommentare zum Manuskript danken. Dieses Projekt wurde von den National Institutes of Health Grants R03 DC014787 (Y.V.Z.) und R01 DC018592 (Y.V.Z.) und der Ambrose Monell Foundation finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
35 mm PetrischaleFisher Scientific08-772E
AgaroseThomas ScientificC756P56
Durchsichtiger KleberFisher ScientificNC9884114
Konische ZentrifugenröhrchenFisher Scientific05-527-90
SeziermikroskopAmscopeSM-2T-6WB-V331
FCF Brilliant BlueWako Chemical3844-45-9
Fly CO2 Anästhesie-SetupGenesee Scientfic59-114/54-104M
Fliegen-Inkubator mit programmierbarem Tag-/Nacht-ZyklusPowers Scientific Inc.IS33SD
Fliegenschnüre
Glasschale (mikrowellengeeignet)
KimwipesFisher Scientific06-666A
MedienaufbewahrungsflascheFisher Scientific50-192-9998
Trennwand aus Kunststoff, passend für die Schale aus einem Blech, das nicht dicker als 5 mm
Fliegenfläschchenaus KunststoffGenesee Scientific32-116
SaccharoseMillipore SigmaS9378
Sulforhodamin BMillipore SigmaS9012
Schmackhafte Verbindung von Interesse
Vortex-MischerBenchmark ScientificBV1000
WasserbadFisher ScientificFSGPD05
ist

Referenzen

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