Summary
Vi beskriver tekniken av en ny DNA-tjudrade T7 RNA polymeras för att reglera in vitro transkription reaktioner. Vi diskuterar stegen för proteinsyntes och karakterisering, validerar proof-of-concept transkriptionell reglering och diskuterar dess tillämpningar inom molekylär databehandling, diagnostik och molekylär informationsbehandling.
Abstract
DNA-nanoteknik möjliggör programmerbar självmontering av nukleinsyror i användarförskrivna former och dynamik för olika tillämpningar. Detta arbete visar att begrepp från DNA-nanoteknik kan användas för att programmera den enzymatiska aktiviteten hos det fagerbaserade T7 RNA-polymeraset (RNAP) och bygga skalbara syntetiska genregleringsnätverk. För det första konstrueras en oligonukleotid-tjudrade T7 RNAP genom uttryck av en N-terminalt SNAP-märkt RNAP och efterföljande kemisk koppling av SNAP-taggen med en bensylguanin (BG)-modifierad oligonukleotid. Därefter används nukleinsyrasträngförskjutning för att programmera polymeras transkription på begäran. Dessutom kan hjälp nukleinsyraaggregat användas som "artificiella transkriptionsfaktorer" för att reglera interaktionerna mellan dna-programmerade T7 RNAP med dess DNA-mallar. Den här reglerings mekanismen för in vitro-transkription kan implementera en mängd olika krets beteenden som digital logik, feedback, kaskad och multiplexering. Composability av denna gen reglerande arkitektur underlättar design abstraktion, standardisering och skalning. Dessa funktioner kommer att möjliggöra snabb prototyping av in vitro genetiska enheter för applikationer som bioavkänning, sjukdomsdetektering och datalagring.
Introduction
DNA-databehandling använder en uppsättning designade oligonukleotider som medium för beräkning. Dessa oligonukleotider programmeras med sekvenser för att dynamiskt montera enligt användarspecificerad logik och svara på specifika nukleinsyraingångar. I proof-of-concept studier består utdata av beräkningen vanligtvis av en uppsättning fluorescerande märkta oligonukleotider som kan detekteras via gelelektrofores eller fluorescensplatta läsare. Under de senaste 30 åren har alltmer komplexa DNA-beräkningskretsar demonstrerats, såsom olika digitala logikkaskader, kemiska reaktionsnätverk och neurala nätverk1,2,3. För att hjälpa till med beredningen av dessa DNA-kretsar har matematiska modeller använts för att förutsäga funktionaliteten hos syntetiska genkretsar4,5, och beräkningsverktyg har utvecklats för ortogonal DNA-sekvensdesign6,7,8,9,10 . Jämfört med kiselbaserade datorer inkluderar fördelarna med DNA-datorer deras förmåga att interagera direkt med biomolekyler, fungera i lösning i avsaknad av en strömförsörjning, liksom deras övergripande kompaktitet och stabilitet. Med tillkomsten av nästa generations sekvensering har kostnaden för att syntetisera DNA-datorer minskat under de senaste två decennierna i en takt snabbare än Moores lag11. Tillämpningar av sådana DNA-baserade datorer börjar nu dyka upp, till exempel för sjukdomsdiagnos12,13, för att driva molekylär biofysik14och som datalagringsplattformar15.
Figur 1: Mekanism för tå-medierad DNA-strängförskjutning. Fästet, δ, är en fri, obunden sekvens på en partiell duplex. När en kompletterande domän (δ*) introduceras på en andra del, fungerar den fria δ domänen som ett tåfäste för hybridisering, vilket gör det möjligt för resten av strängen (ɑ*) att långsamt förskjuta sin konkurrent genom en zipping / unzipping reversibel reaktion som kallas strandmigrering. När längden på δ ökar minskar ΔG för den främre reaktionen och förskjutningen sker lättare. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Hittills använder majoriteten av DNA-datorer ett väletablerat motiv inom området dynamisk DNA-nanoteknik som kallas tåmedierad DNA-strängförskjutning (TMDSD, figur 1)16. Detta motiv består av en delvis dubbelsträngad DNA-duplex (dsDNA) som visar korta "tågrepp" överhäng (dvs. 7- till 10 nukleotider (nt)). Nukleinsyra "ingångs" strängar kan interagera med de partiella duplexes genom tåfästet. Detta leder till förskjutning av en av strängarna från den partiella duplexen, och denna befriade sträng kan sedan fungera som inmatning för nedströms partiella duplex. Således möjliggör TMDSD signalkaskad och informationsbehandling. I princip kan ortogonala TMDSD-motiv fungera självständigt i lösning, vilket möjliggör parallell informationsbehandling. Det har förekommit ett antal variationer på TMDSD-reaktionen, såsom tå-medierad DNA-strängutbyte (TMDSE)17, "läckagefria" tågrepp med dubbellånga domäner18, sekvens-omaka tågrepp19och "handfäste"-medierad strandförskjutning20. Dessa innovativa designprinciper möjliggör mer finjusterade TMDSD-energier och dynamik för att förbättra DNA-datorprestanda.
Syntetiska genkretsar, såsom transkriptionsgenkretsar, kan också beräknas21,22,23. Dessa kretsar regleras av protein transkriptionsfaktorer, som aktiverar eller undertrycker transkription av en gen genom att binda till specifika regulatoriska DNA-element. Jämfört med DNA-baserade kretsar har transkriptionskretsar flera fördelar. För det första har enzymatisk transkription en mycket högre omsättningshastighet än befintliga katalytiska DNA-kretsar, vilket genererar fler kopior av utdata per enda kopia av indata och ger ett effektivare sätt att förstärka signalen. Dessutom kan transkriptionskretsar producera olika funktionella molekyler, såsom aptamerer eller budbärar-RNA-kodning (mRNA) kodning för terapeutiska proteiner, som beräkningsutgångar, som kan utnyttjas för olika tillämpningar. En stor begränsning av nuvarande transkriptionskretsar är dock deras brist på skalbarhet. Detta beror på att det finns en mycket begränsad uppsättning ortogonala proteinbaserade transkriptionsfaktorer, och de novo design av nya protein transkription faktorer förblir tekniskt utmanande och tidskrävande.
Figur 2: Abstraktion och mekanism för polymeraskomplexet "tjuder" och "bur". En bur som består av en "faux" T7 promotor med ett tjuder-komplement överhäng gör det möjligt att hybridisera till tjuder och blockera transkriptionsaktiviteten. c) När operatören (a*b*) är närvarande binder den till tåfästet på oligonukleotidtjudern (ab) och förskjuter b* -området i buret, vilket gör det möjligt att göra transkription. Denna siffra har ändrats från Chou och Shih27. Förkortningar: RNAP = RNA-polymeras. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Detta dokument introducerar en ny byggsten för molekylär databehandling som kombinerar funktionerna i transkriptionskretsar med skalbarheten hos DNA-baserade kretsar. Denna byggsten är en T7 RNAP kovalent fäst med en endasträngad DNA-tjuder (figur 2A). För att syntetisera denna DNA-bundna T7 RNAP smältes polymeraset till en N-terminal SNAP-tagg24 och rekombinant uttryckt i Escherichia coli. SNAP-taggen reagerades sedan med en oligonukleotid som funktionaliserades med BG-substratet. Oligonukleotidtjudern gör det möjligt att placera molekylära gäster i närheten av polymeraset via DNA-hybridisering. En sådan gäst var en konkurrenskraftig transkriptionsblockerare kallad en "bur", som består av en "faux" T7-promotor DNA-duplex utan gen nedströms (figur 2B). När buret är bundet till RNAP via dess oligonukleotidtjuder, stannar det polymerasaktivitet genom att konkurrera ut andra DNA-mallar för RNAP-bindning, vilket gör RNAP i ett "OFF" -tillstånd (figur 2C).
För att aktivera polymeraset till ett "ON" tillstånd utformades T7 DNA-mallar med enkelsträngade "operatörsdomäner" uppströms T7-promotorn för genen. Operatordomänen (dvs. domän a *b* figur 2C) kan utformas för att förskjuta buret från RNAP via TMDSD och placera RNAP proximalt till genens T7-promotor och därmed initiera transkription. Alternativt utformades DNA-mallar där operatörssekvensen kompletterade hjälpkärnornas syrasträngar som kallas "artificiella transkriptionsfaktorer" (dvs. TFA- och TFB-strängar i figur 3A). När båda delarna introduceras i reaktionen monteras de på operatörsplatsen, vilket skapar en ny pseudokontrigant domän a *b*. Den här domänen kan sedan förskjuta buret via TMDSD för att initiera transkription (figur 3B). Dessa strängar kan levereras antingen exogent eller produceras.
Bild 3: Selektiv programmering av polymerasaktivitet genom en trekomponents switchaktivator. a) När transkriptionsfaktorerna (TFA och TFB) förekommer binder de till arrangörens operatörsdomän uppströms och bildar en pseudo enkelsträngad sekvens (a*b*) som kan förskjuta buren genom tåmedierad DNA-förskjutning. (B) Denna a * b * domän kan förskjuta buret via TMDSD för att initiera transkription. Denna siffra har ändrats från Chou och Shih27. Förkortningar: TF = transkriptionsfaktor; RNAP = RNA-polymeras; TMDSD = tå-medierad DNA-strängförskjutning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Användningen av nukleinsyrabaserade transkriptionsfaktorer för transkriptionell reglering in vitro möjliggör skalbar implementering av sofistikerade krets beteenden som digital logik, feedback och signal kaskad. Man kan till exempel bygga logiska grindkaskader genom att designa nukleinsyrasekvenser så att transkriptionerna från en uppströms gen aktiverar en nedströmsgen. En applikation som utnyttjar kaskad och multiplexering som möjliggörs av denna föreslagna teknik är utvecklingen av mer sofistikerade molekylära datorkretsar för bärbar diagnostik och molekylär databehandling. Dessutom kan integrering av molekylär databehandling och de novo RNA syntes kapacitet möjliggöra nya applikationer. Till exempel kan en molekylär krets utformas för att upptäcka en eller en kombination av användardefinierade RNAs som ingångar och utdata terapeutiska RNAs eller mRNAs kodning funktionella peptider eller proteiner för point-of-care medicinska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Buffertberedning
OBS: Proteinreningsbuffertberedning kan ske vilken dag som helst; här gjordes det innan experimenten påbörjades.
- Förbered lys-/jämviktsbuffert som innehåller 50 mM tris(hydroximetyl)aminometan (Tris), 300 mM natriumklorid (NaCl), 5% glycerol och 5 mM β-mercaptoethanol (BME), pH 8. Tillsätt 1,5 ml 1 M Tris, 1,8 ml 5M NaCl, 1,5 ml glycerol, 25,2 ml avjoniserat vatten (ddH2O) i ett 50 ml centrifugrör och tillsätt 10,5 μL av 14,2 M BME strax före användning.
OBS: Tris kan orsaka akut toxicitet; undvik därför att andas sitt damm och undvik hud- och ögonkontakt. BME är giftigt och får endast användas i en rökhuv. Det är viktigt att lägga till BME sist, strax före resuspension och celllys. Se tabell 1 för lysbuffertformel. - Förbered tvättbuffert (pH 8) som innehåller 50 mM Tris, 800 mM NaCl, 5% glycerol, 5 mM BME och 20 mM imidazol. Tillsätt 1,5 ml 1 M Tris, 4,8 ml 5 M NaCl, 1,5 ml glycerol och 22,2 ml ddH2O i ett 50 mL centrifugrör. Tillsätt 7 μL 14,2 M BME och 200 μL 2 M imidazol till 20 ml av ovanstående lösning.
OBS: Använd personlig skyddsutrustning för att förhindra akut toxicitet på grund av imidazol. Det är viktigt att tillsätta BME och imidazol sist, precis innan proteinet tvättas ur kolonnen. Se tabell 2 för tvättbuffertformel. - Förbered elutionsbuffert (pH8) som innehåller 50 mM Tris, 800 mM NaCl, 5% glycerol, 5 mM BME och 200 mM imidazol. Tillsätt 0,5 ml 1 M Tris, 1,6 ml 5 M NaCl, 0,5 ml glycerol och 6,4 ml ddH2O till ett 15 mL centrifugrör. Tillsätt 3,5 μL 14,2 M BME och 1 ml 2 M imidazol till 10 ml av ovanstående lösning.
OBS: Det är viktigt att tillsätta BME och imidazol sist, precis innan proteinet elutings ur kolonnen. Se tabell 3 för elutionsbuffertformel. - Förbered 2x lagringsbuffert (som ska blandas 1:1 med glycerol) som innehåller 100 mM Tris, 200 mM NaCl, 40 mM BME och 2 mM etylendiamintetraakuletsyra (EDTA), 0,2% av en icke-jonisk tensid (se tabellen över material). Förbered 50 ml av lagringsbufferten genom att tillsätta 5 ml 1 M Tris, 2 ml 5 M NaCl, 42,56 ml ddH2O, 200 μL 0,5 M EDTA, 100 μL av det icke-joniska tensidet till ett 50 ml centrifugrör. Blanda tills lösningen är homogen, filtrera lagringsbufferten genom ett 0,2 μm sprutfilter och tillsätt 140,8 μL BME till ovanstående lösning före användning.
OBS: För att undvika akut toxicitet på grund av EDTA, undvik att andas dammet och undvik hud- och ögonkontakt. Det är viktigt att tillsätta BME sist och blanda hela lagringsbufferten 1:1 med glycerol, precis innan det renade proteinet lagras. Se Tabell 4 för lagringsbuffertformel.
2. Kulturtillväxt över natten: Dag 1
- Förbered 1 000x kanamycin lager genom att lösa upp 500 mg kanamycin i 10 ml ddH2O.
OBS: Använd personlig skyddsutrustning för att förhindra akut toxicitet på grund av kanamycin. - Tillsätt 20 μL av 1 000x kanamycinbuljong till 20 ml lysogen buljong. Använd en steril pipettspets, peta en förvandlad BL21 E. coli glycerolbuljong och vaccinera sedan kulturen genom att införa spetsen i tillväxtmediebuljongen.
Bild 4: Plasmid karta för SNAP T7 RNAP. Plasmiden kodar en T7 RNAP som innehåller en N-terminal histidin tagg (6x His) och SNAP-tag domän (SNAP T7 RNAP) under en lac repressor (lacI) på en pQE-80L ryggrad. Andra funktioner inkluderar kanamycinresistens (KanR) och kloramfenicolresistens (CmR) gener. Förkortning: RNAP = RNA-polymeras. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
OBS: Plasmiden kodar en T7 RNAP som innehåller en N-terminal histidin tagg och en SNAP-tagg domän (SNAP T7 RNAP), samt en kanamycin resistensgen under en pQE-80L ryggrad (figur 4)25.
- Tillsätt återigen 20 μL av 1000x kanamycinbuljong till en separat odlingskolv som innehåller 20 ml lysogen buljong och inkubera den som en kontroll.
- Inkubera de två proverna (från steg 2.2 och 2.3) över natten i 12-18 timmar vid 37 °C, samtidigt som de roterar vid 10 × g.
3. Celltillväxt och induktion: Dag 2
- Inokulera 400 ml lysogen buljong innehållande 400 μL kanamycinbestånd med 4 ml av tillväxtkulturen över natten från steg 2,4. Inkubera odlingskolvarna vid 37 °C, samtidigt som de roterar vid 10 × g.
- När kulturen har nått en optisk densitet (OD) vid 600 nm ~ 0,5, ta ut 1 ml prov från tillväxtkolven som en kontroll. Förvara kontrollprovet vid 4 °C.
- Inducera cellerna med isopropyl β-D-1-tiogalactopyranoside (IPTG) genom att tillsätta 40 μL 1M IPTG per 100 ml kultur för att uppnå en slutlig koncentration på 0,4 mM IPTG. Inkubera provet i 3 timmar vid 37 °C, rotera vid 10 × goch snurra sedan den inducerade kulturen vid 8 000 × g i 10 minuter för att pelletera cellerna. Ta bort supernatanten och förvara pelleten vid -20 °C tills den används vidare.
OBS: För att undvika akut toxicitet på grund av IPTG, undvik att andas dammet och undvik hud- och ögonkontakt. Om det behövs kan du pausa experimentet här och fortsätta nästa dag.
4. Celllys, proteinrening: Dag 3
- Återanvänd den lagrade cellpelleten med 10 ml lysbuffert på is och snurra försiktigt för att säkerställa att hela pelleten återanvänds. Pipettera sedan 1 ml prov i tio 1,5 ml rör som hålls på is.
- Sonikera varje prov vid en amplitudinställning på "1", pulserad i 2 s med en 50% arbetscykel under en period av 30 s. Före och efter varje prov, rengör ultraljudsbehandlingsspetsen med 70% etanol och ddH2O. Håll alla prover på is under och efter ultraljudsbehandling.
OBS: Håll 70% etanol borta från värme och öppen eld. - Jämvikt en nickelladdad nitrilotriacetic syra (Ni-NTA) reningsspinnkolonn till en arbetstemperatur på 4 °C. Placera/förvara kolonnen vid 4 °C och förvara den på is under användning.
- Centrifugera de tio 1 ml-proverna vid 15 000 × g i 20 min vid 4 °C. Rör försiktigt ut supernatanten som innehåller rekombinant RNAP utan att störa pelleten. Använd vid behov ytterligare jämviktsbuffert för att justera den totala volymen till ≥ 6 ml.
- Ta försiktigt bort den nedre fliken från Ni-NTA-spinkolumnen för att möjliggöra flöde genom kolumnen. Placera kolonnen i ett centrifugrör och förvara den på is.
OBS: Använd ett 50 ml centrifugrör med 3 mL Ni-NTA-spinnpelarna. - Centrifugera kolonnen vid 700 × g och 4 °C i 2 minuter för att ta bort lagringsbufferten. Balansera kolumnen genom att lägga till 6 ml ekvilibreringsbuffert i kolumnen. Låt bufferten komma in i hartsbädden helt.
- Ta bort jämviktsbufferten från kolonnen genom centrifugering vid 700 × g och 4 °C i 2 min. Innan du lägger till det förberedda cellextraktet i kolumnen, placera en nedre kontakt på kolonnen för att undvika att förlora någon produkt. Tillsätt sedan cellextraktet i kolonnen och blanda på en orbital shaker mixer i 30 min vid 4 °C.
- Ta bort den nedre kontakten från kolonnen och placera kolonnen i ett 50 ml centrifugrör märkt flöde genom. Centrifugera kolonnen vid 700 × g i 2 min för att samla upp flödet genom.
- Tillsätt 6 ml tvättbuffert till kolonnen för att tvätta hartset. Centrifugera kolonnen vid 700 × g i 2 minuter för att samla fraktionen i ett nytt centrifugrör märkt tvätt 1. Upprepa detta steg ytterligare två gånger för totalt 3 separata fraktioner och samla fraktionerna i separata centrifugrör(tvätta 2 och tvätta 3).
- Tillsätt 3 ml elutionsbuffert för att elute de his-märkta proteinerna från hartset. Centrifugera kolonnen vid 700 × g i 2 minuter för att samla fraktion i ett nytt centrifugrör märkt eluat 1. Upprepa detta steg ytterligare två gånger för totalt 3 separata fraktioner och samla fraktionerna i separata centrifugrör(eluera 2 och eluera 3).
- Kombinera älvorna och utför avsaltning för att ta bort salter från proteinlösningen.
- Pipett 15 ml 0,05 % v polysorbat 20 över en centrifugalfilterenhet på 100 kDa. Centrifugera vid 4 000 × g i 40 minuter och kassera genomströmningen.
- Använd det belagda filtret för att koncentrera eluaterna 1, 2 och 3 (9 ml totalt protein eluat + 6 ml lagringsbuffert) till ~1 500 μL. Centrifugera filtret vid 3 220 × g i 20 minuter och försiktigt pipettera membranet för att förhindra utfällning.
- Späd ut provet till 15 ml med lagringsbuffert. Utför ett buffertutbyte med lagringsbufferten 1:1 000 genom att upprepa steg 4.11.2 ytterligare två gånger.
- Kvantifiera det renade proteinet genom att mäta fraktionens absorbans vid 280 nm. Töm spektrofotometern med lagringsbuffert (2x lagringsbuffert vid 4 °C). Blanda försiktigt provet av de kombinerade eluaterna och mät dess absorbans.
OBS: Utför tre separata avläsningar vid 1x, 10x och 50x utspädningar av proteinprovet till genomsnitt och kvantifiera proteinet. Späd ut prover i lagringsbufferten. - Justera proteinproverna till 100 μM med hjälp av 2x lagringsbuffert. Späd ut det justerade provet 1:1 volymmässigt med 100% glycerol. Förvara den resulterande proteinlösningen vid -80 °C.
5. Natrium dodecylsulfat-polyakrylamid gel elektrofores (SDS-PAGE) analys av proteinprodukt: Dag 3
- Kör en SDS-PAGE gel för proteinanalys. Blanda 9 μL av provet med 3 μL 4x litium dodecylsulfat (LDS) proteinbelastningsfärgämne. Värm proverna vid 95 °C i 10 min.
- Ladda proverna på en 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel setup. Ladda proteinstegen i brunn 1, sedan med prover (från vänster till höger): genomströmning, tvätta 1, tvätta 2, tvätta 3, elution 1, elution 2, elution 3 och total avsaltad elution.
OBS: Tabell 5 innehåller en provladdningstabell för SDS-PAGE-gelen. - Kör de laddade gelproverna i 2-(N- morpholino) etanesulfonsyra (MES) buffert i 35 min vid 200 V. Skölj gelén i en ren bricka tre gånger i 10 minuter vardera med 200 ml ddH2O, med skonsam omrörning för att avlägsna eventuella SDS från gelmatrisen.
OBS: Använd personlig skyddsutrustning för att undvika akut toxicitet på grund av MES. - Färga gelén med 20 ml Coomassie blå och inkubera gelén över natten vid rumstemperatur med mild omrörning. De-stain gelén två gånger i 1 h vardera med 200 ml ddH2O med mild omrörning på en orbital shaker.
OBS: Om du tvättar gelén under en längre tid eller ofta byter ut vattnet ökar känsligheten. Dessutom kommer placering av en vikt delikat torka vävnad i behållaren för att absorbera överskott av färg att påskynda avfärgningsprocessen.
6. Funktionell verifiering av SNAP T7 RNAP via in vitro-transkription
OBS: Detta protokoll använder DNA-mall, som kodar för den fluorescerande Broccoli RNA-aptameren och tillåter användning av fluorescens för att övervaka kinetiken av transkription på en fluorescensplatta läsare.
- Ställ in tre IVT-reaktioner (in vitro transcription) för att jämföra aktiviteten hos SNAP T7 RNAP med wild-type (WT) T7 RNAP från en kommersiell källa och en buffertkontroll. Justera volymen för varje reaktion till 20 μL.
- Förbered SNAP T7 RNAP IVT-reaktionen genom att blanda 2 μL 10x transkriptionsbuffert, 0,4 μL 25 mM ribonukleosidetrifosfat (rNTP) blandning, 5 μL 500 nM DNA-mall, 2 μL 500 nM SNAP T7 RNAP och 10,6 μL ddH2O.
- Förbered WT RNAP IVT-reaktionen genom att blanda 2 μL 10x transkriptionsbuffert, 0,4 μL 25 mM rNTP-blandning, 5 μL 500 nM DNA-mall, 2 μL WT T7 RNAP och 10,6 μL ddH2O.
- Förbered buffert-endast IVT reaktionen genom att blanda 2 μL 10x transkriptionsbuffert, 0,4 μL 25 mM rNTP blandning, 5 μL 500 nM DNA-mall och 12,6 μL ddH2O.
OBS: Tillsätt RNAP sist, håll proverna på is tills det introduceras. Tabell 6, tabell 7och tabell 8 innehåller IVT-reaktionsformlerna.
- Övervaka transkriptionskinetiken på en fluorescensplatta i 2 timmar med 2 min intervall vid 37 °C med en excitationsvåglängd på 470 nm och en emissionsvåglängd på 512 nm.
7. Beredning av BG-modifierade oligonukleotider: Dag 1
- Lös upp oligonukleotid med 3'-aminmodifiering i ddH2O till en slutlig koncentration på 1 mM. Märk den här S1.
- Blanda 25 μL 1 M natriumbikarbonat (NaHCO3),284 μL 100% dimetylsulfoxid (DMSO), 125 μL S1 (olinucleotidlager) och 66 μL 50 mM av BG- N-hydroxysuccinimid (NHS) ester (BG-GLA-NHS) utspädd med DMSO, justera volymen på 5 ×0 mM av BG- N-hydroxysuccinimid (NHS) ester (BG-GLA-NHS) utspädd med DMSO
OBS: Håll DMSO borta från värme och låga eftersom det är en brännbar vätska. Tabell 9 innehåller reaktionsformeln för BG-konjugationen till oligonukleotid.
- Blanda 25 μL 1 M natriumbikarbonat (NaHCO3),284 μL 100% dimetylsulfoxid (DMSO), 125 μL S1 (olinucleotidlager) och 66 μL 50 mM av BG- N-hydroxysuccinimid (NHS) ester (BG-GLA-NHS) utspädd med DMSO, justera volymen på 5 ×0 mM av BG- N-hydroxysuccinimid (NHS) ester (BG-GLA-NHS) utspädd med DMSO
8. Etanol/aceton nederbörd av BG-oligonucleotide konjugat: Dag 2
- Centrifugera produkten i steg 7.1.1. vid 13 000 × g i 5 min. Överför försiktigt supernatanten till ett nytt rör och kassera eventuell fälld BG. Dela upp reaktionen i två lika stora 250 μL alikvoter för att förhindra spill och utför följande steg på båda alikvoterna.
- Tillsätt 1/10av volymen 3 M natriumacetat (25 μL), följt av 2,5x volymen i 100% etanol (625 μL). Inkubera vid -80 °C i 1 h.
OBS: Använd personlig skyddsutrustning vid hantering av både natriumacetat (kan orsaka irritation i ögon, hud, matsmältnings- och andningsorgan) och etanol (extremt brandfarlig, orsakar irritation vid kontakt). Om det behövs, pausa experimentet här och fortsätt nästa dag. - Placera rören i centrifugen och markera ytterkanten. Centrifugera rören vid 17 000 × g i 30 min vid 4 °C.
OBS: Oligonukleotidpelleten kommer att visas på rörets markerade kant. - Utan att störa pelleten, kassera supernatanten. Fyll på med 750 μL kyld 70% etanol och snurra vid 17 000 × g i 10 min vid 4 °C.
- Utan att störa pelleten, kassera supernatanten. Fyll på med 750 μL 100% aceton och snurra vid 17 000 × g i 10 min vid 4 °C.
OBS: Använd personlig skyddsutrustning vid hantering av aceton eftersom det är extremt brandfarligt och orsakar irritation vid kontakt. - Med rörlocket öppet, lufttorka i 5 minuter för att avlägsna överflödig aceton genom avdunstning. Lös upp oligonukleotid i 250 μL 1x Tris-EDTA (TE) buffert för att producera en ~850 μM BG-oligonukleotidlösning.
- Upprepa steg 8.2 till 8.6 och lös upp i 70 μL 1x TE-buffert. Märk den här S2.
9. BG-oligonucleotide sanering via gelfiltreringskromatografi
- Suspendera matrisen genom att kraftigt invertera kolumnerna flera gånger; ta bort det övre locket och knäpp av den nedre spetsen av kolonnen. Placera kolonnen i ett 1,5 ml centrifugrör och centrifugera röret vid 1 000 × g i 1 min vid rumstemperatur. Kassera den eluterade bufferten och uppsamlingsröret.
OBS: Det är viktigt att förhindra vakuumbildning. Använd förberedda kolumner omedelbart. - Placera de packade kolonnerna i rena 1,5 ml centrifugrör. Tillsätt 300 μL 1x TE-buffert i mitten av kolonnbädden och centrifugera vid 1 000 × g i 2 minuter för att byta ut buffertlösningen. Kassera återigen den eluterade bufferten och uppsamlingsröret.
- Placera de buffertutbytta kolonnerna i rena 1,5 ml centrifugrör. Applicera upp till 75 μL prov i mitten av sängen. Snurra på 1 000 × g i 4 min.
OBS: Stör inte sängen eller rör inte kolonnens sidor; Gelmediets högsta punkt ska peka mot den yttre rotorn. - Samla eluatet från uppsamlingsröret, eftersom det innehåller den renade nukleinsyran. För att kvantifiera provet, mät dess absorbans vid 260 nm; etiketten S3.
OBS: Notera banlängden som används i mätningen och beräkna koncentrationen med hjälp av Beer-Lambert-lagen.
10. Denatureringssida analys av BG-oligonucleotide konjugat
- Gjut en 18% Tris-borate-EDTA (TBE)-Urea PAGE gel. Lös upp 4,8 g UREA, 4,5 ml 40 % akrylamid (19:1) och 1 ml 10x TBE i 2,8 ml ddH2O; tillsätt 5 μL tetrametylletylendiamin (TEMED) och blanda noggrant. Upprepa med 100 μL 10% ammoniumpersulfat (APS). Häll lösningen i en tom gelkassett och låt polymerisation i 40 min.
OBS: Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av karbamid (orsakar irritation i ögon och hud), akrylamid (giftig och cancerframkallande) och TEMED (giftigt, brandfarligt, frätande). Tabell 10 innehåller reaktionsformeln för en 18% TBE-UREA polyakrylamidgel. - Mikrovågsugn 500 ml TBE-buffert (0,5x) i 2 min och 30 s eller till ~70 °C och häll i en gelapparat. Förbered formamid (denaturerande) lastfärg som innehåller 95% formamid + 1 mM EDTA och bromofenolblå. Blanda lastfärgen med varje prov och ladda blandningen på polyakrylamidgelen.
OBS: Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av formamid eftersom den är cancerframkallande. Tabell 11 innehåller ett provgelladdningsbord. - Kör gelén vid 270 V i 35 minuter, eller tills färgfronten migrerar till slutet. Placera gelén i en gellåda och fläcka med cyaninfärg för nukleinsyror i 15 minuter vid rumstemperatur före avbildning.
OBS: Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av cyaninfärg eftersom det är brännbart.
11. Konjugation av oligonukleotid till SNAP T7 RNAP och PAGE-analys
- Förbered reagenserna för analytisk koppling av BG-oligonucleotide till SNAP T7 RNAP: gör 9 utspädningar av enkelsträngad DNA(ssDNA) oligo med ddH2O för att skapa oligo:RNAP-förhållanden från 5:1 till 1:5. Späd ut proteinlagret till 50 μM.
Exempelförhållanden finns i tabell 12. Dessa förhållanden beräknas med en RNAP-koncentration på 50 μM. - För varje utspädning av ssDNA-oligo, gör 10 μL av reaktionsblandningen som innehåller 2 μL SNAP-buffert, 4 μL BG-oligonukleotid och 4 μL SNAP T7 RNAP.
Tabell 13 innehåller reaktionsformler för SNAP-taggens märkningsreaktion.- Förbered ytterligare två kontrollprover: 1) en RNAP-kontroll genom att ersätta BG-oligonukleotid med ddH2O; 2) en DNA-kontroll genom att ersätta SNAP T7 RNAP med ddH2O (för den lägsta oligonukleotidkoncentrationen av SNAP T7 RNAP). Inkubera alla prover vid rumstemperatur i 1 h och håll på is tills det behövs.
- Ställ in elva 10 μL-reaktioner genom att tillsätta 2 μL av varje prov till 4 μL SNAP-buffert och 2 μL proteinbelastningsfärgämne och värm vid 70 °C i 10 minuter. Ladda 2 μL av varje prov på 4-12% Bis-Tris proteingel och utför gelelektrofores på is vid 200 V i 35 min.
OBS: Tabell 14 innehåller reaktionsformler för gelladdningsproverna.- Tvätta SDS av via 3x vattenutbyte på en shaker, varje tvätt varar 10 min vardera. Fläcka med cyaninfärg för nukleinsyror i 15 minuter före avbildning. Färga gelén igen med 20 ml Coomassie blå fläck i 1 h. De-stain med ddH2O för 1 h (eller över natten) före avbildning.
OBS: I gelén kommer en av reaktionerna att producera den mest tjudrade polymerasen tillsammans med den minsta mängden överskottsfri BG-oligonukleotid; Detta är det optimala förhållandet.
- Tvätta SDS av via 3x vattenutbyte på en shaker, varje tvätt varar 10 min vardera. Fläcka med cyaninfärg för nukleinsyror i 15 minuter före avbildning. Färga gelén igen med 20 ml Coomassie blå fläck i 1 h. De-stain med ddH2O för 1 h (eller över natten) före avbildning.
- Förbered reagenser för den preparativa skalkopplingen BG-oligonucleotide till SNAP T7 RNAP. Utför kopplingsreaktionen med det optimala förhållandet som finns i den analytiska skalan.
OBS: Minimera proteinexponeringen för rumstemperatur genom att placera proteinet på is när det inte används.
12. Rening av oligonukleotid-tjudrade SNAP-T7 med hjälp av jonutbyteskolumner
- Följ tillverkarens instruktioner för rörinställning om det avviker från instruktionerna som anges här. Förbered en reningsbuffert med pH högre än proteinets isoelektriska punkt.
OBS: För exemplet protein i detta protokoll användes en reningsbuffert på 10 mM natriumfosfatbuffert (pH 7).- Förbered 1 000 μL elutionsbuffert innehållande slutliga koncentrationer på 50 mM Tris och 0,5 M NaCl. Blanda 50 μL av 1 M Tris, 100 μL 5 M NaCl och 850 μL ddH2O.
OBS: Tabell 15 innehåller reaktionsformeln för elutionsbufferten.
- Förbered 1 000 μL elutionsbuffert innehållande slutliga koncentrationer på 50 mM Tris och 0,5 M NaCl. Blanda 50 μL av 1 M Tris, 100 μL 5 M NaCl och 850 μL ddH2O.
- Placera en kolonn i ett 2 ml centrifugrör och tvätta med reningsbuffert vid 2 000 × g i 15 minuter, eller tills all buffert har eluterats. Ignorera den eluterade bufferten.
- Späd varje prov med reningsbuffert vid ett 3:1 reningsbuffert:provförhållande och lasta provet i kolonnen 400 μL åt gången. Snurra på 2 000 × g i 10 minuter, eller tills all buffert har eluterats. Samla in genomströmningen och märka den som genomströmning.
- Tillsätt 400 μL reningsbuffert i mitten av kolonnen. Snurra på 2 000 × g i 15 minuter, eller tills all buffert har eluterats. Samla genom flödet och märk det som tvätt 1. Upprepa två gånger till för tvätt 2 och tvätta 3.
- Tillsätt 50 μL elutionsbuffert i mitten av kolonnen. Snurra på 2 000 × g i 5 minuter, eller tills all buffert har eluterats. Samla in genomströmningen och märk den som eluat 1. Upprepa två gånger till för eluat 2 och eluera 3.
- Pool eluates 1, 2 och 3 (märk detta totala eluat), lämnar en liten bråkdel av varje eluat för gelén och mäter absorbans vid 260 nm (A260) och 280 nm (A280). Efter mätningen, tillsätt glycerol vid ett 1:1-förhållande och förvara vid -20 °C tills vidare användning.
- Använd en centrifugalfilterenhet (0,5 mL; 30 kDa) för att buffertväxla totalt eluat med 2x lagringsbuffert (~1:100) (märk denna produkt). Mät A260/280 igen. Tillsätt glycerol vid ett 1:1-förhållande och förvara vid -20 °C tills vidare användning.
- Ladda varje eluat: genomströmning, tvätta 1-3, totalt eluat och produkt i en 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel, tillsammans med en proteinstege. Kör vid 200 V i 35 min, eller tills färgfronten migrerar till slutet.
13. Demonstration av kontroll på begäran av tjudrade RNA-polymerasaktivitet
- Förbered 5x glödgningsbuffert innehållande 25 mM Tris, 5 mM EDTA och 25 mM magnesiumklorid (MgCl2). Blanda 2,4 μL av varje mall (1 μM) med 5 μL glödgningsbuffert och 14,2 μL ddH2O för att bilda 25 μL 1 μM dsDNA-bur. Inkubera denna lösning vid 75 °C i 2 min. På samma sätt glödgning av promotorns och malakitgrön aptamer-DNA-mallens känsla och antisensesträngar. Förbered en 1mM lösning av malakitgrön oxalat.
OBS: Tabell 16 innehåller reaktionsformeln för 5x glödgningsbuffert, tabell 17 innehåller reaktionsformeln för glödgning av två ssDNA-mallar. - Inkubera den tjudrade SNAP T7 RNAP med dsDNA-buret i ett 1:5 molarförhållande vid rumstemperatur i 15 min till en slutlig koncentration av 500 nM RNAP. Håll på is tills det behövs.
- Förvärm plattläsaren till 37 °C. Ställ in tre 25 μL IVT-reaktioner på is
- Ställ in en reaktion som innehåller den inburade SNAP T7RNAP med transkriptionsfaktorer för nukleinsyra. Blanda 2,5 μL 10x IVT-buffert, 1 μL 25 mM rNTP-blandning, 1 μL 1 mM malakitgrön, 2,5 μL av RNAP-burblandningen, 2,5 μL vardera av 1 μM transkriptionsfaktor A och B oligonukleotidsträngaroch 3 μL 1 mM malachit green aptamer i 1 mM transkriptionsfaktor A och B olinukleotidsträngar och 3 μL av 1 mM malachit green aptamer
- Ställ in en reaktion som innehåller den inburade SNAP T7RNAP utan transkriptionsfaktorer för nukleinsyra. Blanda 2,5 μL 10x IVT-buffert, 1 μL 25 mM rNTP-blandning, 1 μL 1 mM malakitgrön, 2,5 μL av RNAP-burblandningen och 3 μL 1 mM malakitgrön aptamermall i 15 μL ddH2O.
- Ställ in en reaktion som endast innehåller buffert. Blanda 2,5 μL 10x IVT-buffert, 1 μL 25 mM rNTP-blandning, 1 μL 1 mM malakitgrön och 3 μL 1 mM malakitgrön aptamermall i 17,5 μL ddH2O.
TABELL 18 innehåller en allmän referens för transkriptionsreaktionerna in vitro.
- Överför varje reaktion till en 384-brunnsplatta. Övervaka transkription av malakitgrön aptamer på en fluorescensplatta läsare för 2 h vid 37 °C och med 610 nm excitation och 655 nm utsläpp. När du är klar, håll plattan på is tills det behövs.
- Mikrovåg 0,5x TBE-buffert i 2 min 30 s eller till ~70 °C. Kör RNA-produkterna i varje brunn i en denaturerande 12% TBE-Urea polyakrylamidgel i den uppvärmda 0,5x TBE-bufferten vid 280 V i 20 minuter, eller tills färgfronten når änden. Färga gelén med cyaninfärgning nukleinsyra fläck i 10 min på en orbital shaker innan imaging.
OBS: Tabell 19 innehåller reaktionsformeln för en denaturerande 12% TBE-Urea PAGE gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5: SDS-PAGE analys av SNAP T7 RNAP uttryck och in vitro transkription analys. (A) SNAP T7 RNAP protein rening analys, SNAP T7 RNAP molekylvikt: 119.4kDa. FT = genomströmning från kolonnen, W1 = elutionsfraktioner av tvättbuffert som innehåller föroreningar, E1-3 = elutionsfraktioner som innehåller renad produkt och DE = 10x utspädd total avsaltad elution. 4-12% prefabricerad Bis-Tris proteingel, fläck: Coomassie blå, rinnande buffert: MES-buffert, villkor: 200 V för 35 min. (B) En in vitro transkriptionsanalys utfördes på SNAP T7 RNAP-proteinet genom att mäta produktionen av en fluorescerande aptamer över tiden. Transkription kinetik övervakades på en fluorescens platt läsare för 2 h vid 2 min intervaller vid 37 °C med excitation våglängd vid 470 nm och utsläpp våglängd vid 512 nm. Förkortningar: RNAP = RNA-polymeras; MES = 2-(N-morpholino) etanesulfonsyra; SDS-PAGE = natrium dodecylsulfat polyakrylamid gel elektrofores. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Framgångsrikt uttryck och rening av det rekombinanta SNAP T7 RNAP-proteinet bekräftades med hjälp av SDS-PAGE (figur 5A). Bandet för SNAP T7 RNAP förväntas till cirka 119 kDa, i överensstämmelse med molekylvikterna för den vilda T7 RNAP och SNAP-taggen är 99 kDa respektive 20 kDa. His-tag rening förfarandet beskrivs här producerade totalt sju fraktioner, bestående av en genomflödesfraktion (FT), tre tvättfraktioner (W1, W2 och W3) och tre elueringsfraktioner (E1, E2 och E3). Dessutom ingår vanligtvis en alikvot av proteinet efter buffertutbyte och uppkoncentration (DE). Som ses i figur 5Auppträdde det mest framträdande bandet på cirka 119 kDa i elutionfraktionerna, vilket tyder på framgångsrikt proteinuttryck. Majoriteten av genomströmnings- och tvättfraktionerna innehöll råa cell lysates. En mindre del av cellen lysates överförs till eluering fraktioner, vilket tyder på att strängare tvättar behövde utföras, även om detta kan minska utbytet av protein produkten. Förutom det huvudsakliga SNAP T7 RNAP bandet observerades ett andra, mindre framträdande band på cirka 20 kDa, som tillskrevs trunkerade SNAP-tag protein. Baserat på bandintensiteten var denna biprodukt betydligt lägre i koncentration jämfört med SNAP T7 RNAP. Det kan avlägsnas genom en extra omgång av storlek-exkludering kromatografi eller diafiltrering med 100 kDa molekylvikt cut-off filter. Efter SDS-PAGE validerades den enzymatiska aktiviteten med hjälp av en in vitro-transkriptionsreaktion (figur 5B). En T7 DNA-mall som kodar en fluorescerande RNA-aptamer (t.ex. malakitgrön26)användes, vilket möjliggör övervakning av RNA-produktionskinetik med hjälp av en fluorescensplattaläsare, samt jämförelse av transkriptionskinetik mellan olika partier eller mönster av polymeraser.
Figur 6: SID-analys av BG-oligonucleotide konjugation och rening. BG konjugerades på 3'-änden av oligonukleotid genom standardamin kemi. BG-funktionella oligonucleotide konjugat renades från överflödiga biprodukter med hjälp av en storlek uteslutning kromatografi spin kolumn och analyseras på en denaturing 18% TBE-Urea PAGE efter cyanin färga nukleinsyra fläck. En DNA-stege med ultralåg räckvidd användes i denna gel. S1 = oligonukleotid, S2 = förrening BG-oligo, S3 = efterrening BG-oligo. Förkortningar: PAGE = polyakrylamidgelelektrofores; BG = bensylguanin; TBE = Tris-borate-EDTA; EDTA = tetraatiksyra från etylendiamin. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
BG-funktionaliserade oligonukleotider framställdes med hjälp av standardaminreaktiv tvärbindningskemi (dvs. reagerande BG-GLA-NHS estrar med amin-modifierade oligonukleotider). Framgångsrik koppling verifierades via 18% denaturering TBE-Urea PAGE (figur 6). Jämfört med den oförändrade oligonukleotid (S1) ökar tillsatsen av BG-moiety till oligonukleotid dess molekylvikt och gör att den BG-modifierade oligo (S3) färdas långsammare i gelén. Användningen av en hög procent denatureringsgel är nödvändig för att observera denna enstaka nukleotidskillnad. DenatureringsSIDAN analys är också användbart för att karakterisera batch-till-batch variabilitet i konjugation effektivitet, eftersom både konjugerad och okonjugerad oligonukleotid kan lösas som separata band på gelén. Om produkten innehåller en betydande mängd okonjugerad oligonukleotid får en andra omgång kemisk koppling appliceras för att driva reaktionen till slutförande.
Figur 7: SDS-PAGE analys av T7 RNAP-oligonucleotide konjugation och rening. En BG-modifierad oligonukleotid konjugeras till en T7 RNAP via SNAP-tagg. Konjugaterna renades från överskott av oligonukleotider med hjälp av starka katjonutbyte spin kolonner, innan de analyserades av SDS-PAGE färgade med både (A) cyanin färg färga nukleinsyra fläck och (B) Coomassie blå fläck. Både en proteinstege och en 10-bp DNA stege användes i denna gel. FT = genomströmning från kolonnen, W1-W3 = elutionsfraktioner av reningsbuffert som innehåller föroreningar, E = poolade elutionsfraktioner som innehåller renad produkt, P = renad produkt efter filtreringsbuffertutbyte och uppkoncentration, C = SNAP T7 RNAP endast som kontroll. Denna siffra har ändrats från Chou och Shih27. Förkortningar: RNAP = RNA-polymeras; SDS-PAGE = natrium dodecylsulfat polyakrylamid gel elektrofores. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Efter produktionen av SNAP T7 RNAP och BG-modifierad oligonukleotid var syntesen av DNA-bundet RNAP en enkel blandningsreaktion med en kruka. Den resulterande DNA-bundna T7 RNAP renades från överskott av BG-oligonukleotider med hjälp av en stark katjonutbytesspinnkolonn och analyserades genom att denaturera SDS-PAGE (figur 7). Precis som med det his-tag-reningssystem som beskrivs i ett tidigare stycke analyserades totalt sju fraktioner, inklusive det första genomflödet (FT), tre tvättfraktioner (W1 till W3), de poolade elueringsfraktionerna (E), den koncentrerade produkten (P) och en kontroll som innehåller okonjugerad T7 RNAP (C). För att verifiera framgångsrik konjugation, var gelén först färgade med cyanin färgämne för nukleinsyra, följt av Coomassie blå för proteinet. Som kan observeras i den cyaninfärgade gelen (figur 7A)innehöll den ursprungliga FT mestadels överskottet av BG-oligonukleotid, liksom en liten del av det DNA-bundna polymeraset (dvs. RNAP-oligo) som inte binder till katjonutbyteshartset.
Tvättfraktionerna innehöll en serie svagare band av BG-oligonucleotides (W1-W3) längst ner på gelén. Detta tyder på framgångsrikt avlägsnande av överskott av oligonukleotid. De poolade elutionfraktionerna (E) innehöll endast det enda bandet RNAP-oligo som orsakades av bindningen av cyaninfärgen till oligonukleotidtjudret. Om körfält E innehåller band av fri oligonukleotid kan det krävas fler tvättsteg för att avlägsna dem från provet. Körfältet som innehöll den filtrerade och uppkoncentrerade produkten (P) visade samma band som E, men mycket mörkare, vilket betyder att uppkoncentrationsförfarandet var framgångsrikt. Proteinkontrollkolonnen innehöll endast protein, som uppvisade minimal icke-specifik bindning till cyaninfärg, sett som ett svagt band. Samma mönster observerades i Coomassie blåbetsad gel (figur 7B). En liten gel rörlighet skift observerades när jämföra oligonucleotide-konjugerade RNAP med den icke-konjugerade RNAP kontroll.
Figur 8: In vitro-transkriptionsanalys av ON- och OFF-tillstånd i polymerassystem i bur. (B och C) En in vitro transkription analys utfördes på bur och uncaged tillstånd av polymeras genom att mäta produktionen av en fluorescerande aptamer. I den här figuren visas en 336x ökning av transkriptionshastigheten mellan ON- och OFF-tillstånden. Felstaplar anger standardavvikelse (n=3). Denna siffra har ändrats från Chou och Shih27. Förkortningar: RNAP = RNA-polymeras; TF = transkriptionsfaktor. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
För att demonstrera en metod för växling på begäran av transkriptionell förmåga i det tjudrade RNA-polymerassystemet användes en DNA-malldesign som svarade på ett par nukleinsyrainmatningssträngar TFA och TFB (figur 8A). Transkriptionell aktivitet övervakades genom att mäta produktionen av malakitgrön fluorescerande aptamer i både OFF (dvs. caged) och ON (dvs. uncaged) stater. Mängden fluorescenssignal som produceras i slutet av in vitro-transkriptionen visas i figur 8B, och realtidskinetiken visas i figur 8C. Här kan en 336-faldig aktivering i fluorescenssignal observeras, vilket visar robust kontroll av polymerasaktivitet.
| Reagens | Ursprunglig koncentration | Enheter | Volym | Enheter | Slutlig koncentration | Enheter |
| Tris | 1 | M | 1.5 | Ml | 50 | mm |
| NaCl | 5 | M | 1.8 | Ml | 300 | mm |
| Glycerol | 100 | % | 1.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 10.5 | μL | 5 | mm |
| ddH2O | -- | -- | 25.2 | Ml | -- | -- |
| Slutlig volym | -- | -- | 30 | Ml | -- | -- |
Tabell 1: Lys/jämviktsbuffertformel.
| Reagens | Ursprunglig koncentration | Enheter | Volym | Enheter | Slutlig koncentration | Enheter |
| Tris | 1 | M | 1.5 | Ml | 50 | mm |
| NaCl | 5 | M | 4.8 | Ml | 800 | mm |
| Glycerol | 100 | % | 1.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 7.0 | μL | 5 | mm |
| Imidazol | 2 | M | 200 | μL | 20 | mm |
| ddH2O | -- | -- | 22.2 | Ml | -- | -- |
| Slutlig volym | -- | -- | 30 | Ml | -- | -- |
Tabell 2: Tvätta buffertformeln.
| Reagens | Ursprunglig koncentration | Enheter | Volym | Enheter | Slutlig koncentration | Enheter |
| Tris | 1 | M | 0.5 | Ml | 50 | mm |
| NaCl | 5 | M | 1.6 | Ml | 800 | mm |
| Glycerol | 100 | % | 0.5 | Ml | 5 | % |
| BME | 14.2 | M | 3.5 | μL | 5 | mm |
| Imidazol | 2 | M | 1 | Ml | 200 | mm |
| ddH2O | -- | -- | 6.4 | Ml | -- | -- |
| Slutlig volym | -- | -- | 10 | Ml | -- | -- |
Tabell 3: Elutions buffertformel.
| Reagens | Ursprunglig koncentration | Enheter | Volym | Enheter | Slutlig koncentration | Enheter |
| Tris | 1 | M | 5 | Ml | 100 | mm |
| NaCl | 5 | M | 2 | Ml | 200 | mm |
| BME | 14.2 | M | 140.8 | μL | 40 | mm |
| Triton X-100 | 100 | % | 100 | μL | 0.2 | % |
| EDTA | 0.5 | M | 200 | μL | 2 | mm |
| ddH2O | -- | -- | 42.56 | Ml | -- | -- |
| Slutlig volym | -- | -- | 50 | Ml | -- | -- |
Tabell 4: Formeln för lagringsbuffert.
| Prov | Beskrivning | μL prov | μL lastfärg |
| 1 | Protein stege | 9 | -- |
| 2 | FT: Genomströmning | 9 | 3 |
| 3 | W1: Tvätta 1 | 9 | 3 |
| 4 | W2: Tvätta 2 | 9 | 3 |
| 5 | W3: Tvätta 3 | 9 | 3 |
| 6 | E1: Elution 1 | 9 | 3 |
| 7 | E2: Elution 2 | 9 | 3 |
| 8 | E3: Elution 3 | 9 | 3 |
| 9 | DE: Avsaltad elution | 9 | 3 |
Tabell 5: SDS-PAGE-exempelinläsning för körfält från vänster till höger.
| Reagens | Ursprunglig koncentration | Enheter | Slutlig koncentration | Enheter | Slutlig volym | Enheter |
| Transkriptionsbuffert | 10 | X | 1 | X | 2 | μL |
| rNTP-blandning | 25 | mm | 0.5 | mm | 0.4 | μL |
| DNA-mall | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μL |
| SNAP T7 RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2 | μL |
| Nukleasfritt vatten | -- | -- | -- | -- | 10.6 | μL |
| Total volym | 20 | μL |
Tabell 6: In vitro transkriptionsreaktionsformel med SNAP T7 RNAP (master mix).
| Reagens | Ursprunglig koncentration | Enheter | Slutlig koncentration | Enheter | Slutlig volym | Enheter |
| Transkriptionsbuffert | 10 | X | 1 | X | 2 | μL |
| rNTP-blandning | 25 | mm | 0.5 | mm | 0.4 | μL |
| DNA-mall | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μL |
| WT T7 RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2 | μL |
| Nukleasfritt vatten | -- | -- | -- | -- | 10.6 | μL |
| Total volym | 20 | μL |
Tabell 7: In vitro transkriptionsreaktionsformel med wild-type (WT) T7 RNAP (master mix).
| Reagens | Ursprunglig koncentration | Enheter | Slutlig koncentration | Enheter | Slutlig volym | Enheter |
| Transkriptionsbuffert | 10 | X | 1 | X | 2 | μL |
| rNTP-blandning | 25 | mm | 0.5 | mm | 0.4 | μL |
| DNA-mall | 500 | Nm | 125 | Nm | 5 | μL |
| Nukleasfritt vatten | -- | -- | -- | -- | 12.6 | μL |
| Total volym | 20 | μL |
Tabell 8: In vitro transkriptionsreaktionsformel utan polymeras; buffertkontroll.
| Reagens | Ursprunglig koncentration | Enheter | Volym | Enheter | Sist | Enheter | Sist | Enheter | Slutlig volym | Enheter |
| NaHCO3 | 1 | M | 25 | μL | 0.05 | mm | 1.25E-05 | Mol | 500 | μL |
| DMSO | 100 | % | 284 | μL | 56.8 | % | --- | --- | 500 | μL |
| Oligo | 1 | mm | 125 | μL | 0.25 | μM | 6.25E-08 | Mol | 500 | μL |
| BG-GLA-NHS i DMSO | 50 | mm | 66 | μL | 6.6 | mm | 1.65E-06 | Mol | 500 | μL |
Tabell 9: Reaktionsformel för bensylguaninkonjugation till oligonukleotid.
| Gel volym | 10 ml |
| Akrylamidkoncentration | 18% |
| g UREA | 4.8 |
| ml 40% akrylamid (19:1) | 4.5 |
| ml på 10x TBE | 1 |
| ml ddH2O | 2.8 |
| μL TEMED | 5 |
| μL på 10% APS | 100 |
Tabell 10: Reaktionsformel för en 18% TBE-UREA denatureringsSIDA.
| Prov | Beskrivning | μl-prov | μl lastfärg |
| 1 | L: Stege med ultralåg räckvidd | 3 | -- |
| 2 | S1: 100 nM oligo | 3 | 3 |
| 3 | S2: 100 nM oligo-BG | 3 | 3 |
| 4 | S3: 100 nM oligo-BG + Centri-Spin | 3 | 3 |
Tabell 11: Denaturering av PAGE-provinläsning för körfält från vänster till höger.
| Prov | Koncentration (M) | oligo:RNAP |
| 1 | 2.50E-04 | 5:1 |
| 2 | 2.00E-04 | 4:1 |
| 3 | 1.50E-04 | 3:1 |
| 4 | 1.00E-04 | 2:1 |
| 5 | 5.00E-05 | 1:1 |
| 6 | 2.50E-05 | 1:2 |
| 7 | 1.68E-05 | 1:3 |
| 8 | 1.25E-05 | 1:4 |
| 9 | 1.00E-06 | 1:5 |
Tabell 12: Reagensförhållanden för analytisk skalkoppling av BG-oligonucleotide till SNAP T7 RNAP.
| Reagens | Volym | Enhet |
| SNAP-buffert | 2 | μL |
| BG-Oligo | 4 | μL |
| SNAP-T7 RNAP | 4 | μL |
| Total volym | 10 | μL |
Tabell 13: Reaktionsformel för SNAP-taggens märkningsreaktion.
| Körfält | Exempel på beskrivning | Provvolym (μL) | SNAP-buffertvolym (μL) | Lastning av färgämne (μL) |
| 1 | Prov 1 | 2 | 4 | 2 |
| 2 | Prov 2 | 2 | 4 | 2 |
| 3 | Prov 3 | 2 | 4 | 2 |
| 4 | Exempel 4 | 2 | 4 | 2 |
| 5 | Prov 5 | 2 | 4 | 2 |
| 6 | Prov 6 | 2 | 4 | 2 |
| 7 | Prov 7 | 2 | 4 | 2 |
| 8 | Exempel 8 | 2 | 4 | 2 |
| 9 | Prov 9 | 2 | 4 | 2 |
| 10 | RNAP-kontroll | 2 | 4 | 2 |
| 11 | Oligo kontroll | 2 | 4 | 2 |
| 12 | Stege | 4 | - |
Tabell 14: Bis-Tris PAGE (4%-12%) reaktionsformler för gel lane lastning prover.
| Reagens | Ursprunglig koncentration | Enheter | Volym | Enheter | Slutlig koncentration | Enheter | Slutlig volym | Enheter |
| Tris | 1 | M | 50 | μL | 50 | mm | 1000 | μL |
| NaCl | 5 | M | 100 | μL | 0.5 | M | 1000 | μL |
| ddH2O | -- | -- | 850 | μL | -- | -- | 1000 | μL |
Tabell 15: Reaktionsformel för elutionsbuffert (11.1).
| Reagens | Ursprunglig koncentration | Enheter | Slutlig koncentration | Enheter | volym till pipetten | Enheter |
| Tris | 1000 | mm | 25 | mm | 25 | μL |
| EDTA | 500 | mm | 5 | mm | 10 | μL |
| MgCl | 1000 | mm | 25 | mm | 25 | μL |
| ddH2O | -- | -- | -- | -- | 940 | μL |
Tabell 16: Reaktionsformel för 5x glödgningsbuffert.
| Reagens | Ursprunglig koncentration | Enheter | Slutlig koncentration | Enheter | Volym till pipetter | Enheter | Total reaktionsvolym | Enheter |
| glödgningsbuffert | 5 | X | 1 | X | 5 | μL | 24 | μL |
| betydelse | 10 | μM | 1 | μM | 2.4 | μL | 24 | μL |
| antisense | 10 | μM | 1 | μM | 2.4 | μL | 24 | μL |
| ddH2O | -- | -- | -- | -- | 14.2 | μL | 24 | μL |
Tabell 17: Reaktionsformel som används för att glödga två ssDNA-mallar (sense och antisense-strängar).
| Reagens | Ursprunglig koncentration | Enheter | Slutlig koncentration | Enheter | Volym till pipetter | Enheter | Total reaktionsvolym | Enheter |
| IN vitro-transkription (IVT) buffert | 10 | X | 1 | X | 2.5 | μL | 25 | μL |
| rNTP-blandning | 25 | mm | 1 | mm | 1 | μL | 25 | μL |
| Malakit grön | 1 | mm | 40 | μM | 1 | μL | 25 | μL |
| RNAP | 500 | Nm | 50 | Nm | 2.5 | μL | 25 | μL |
| DNA-mall | 1000 | Nm | 120 | Nm | 3 | μL | 25 | μL |
| ddH2O | -- | -- | -- | -- | 14 | μL | 25 | μL |
Tabell 18: In vitro-transkriptionsreaktionsformel (huvudblandning); inkluderar RNAP-koncentration.
| Gel Volym | 10 ml |
| Akrylamidkoncentration | 12% |
| g UREA | 4.8 |
| ml 40% akrylamid (29:1) | 3 |
| ml 10x TBE | 1 |
| ml ddH2O | 4.3 |
| μl TEMED | 5 |
| μl 10% APS | 100 |
Tabell 19: Reaktionsformel för en 12% TBE-UREA denatureringsSIDA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie visar en DNA-nanoteknik-inspirerad metod för att kontrollera aktiviteten hos T7 RNA polymeras genom att kovalent koppla en N-terminally SNAP-märkt rekombinant T7 RNAP med en BG-funktionaliserad oligonukleotid, som sedan användes för att programmera TMDSD reaktioner. Snap-taggen placerades av design vid polymerasens N-ändstation, eftersom C-ändstationen av vild-typ T7 RNAP är begravd i proteinstrukturkärnan och gör viktiga kontakter med DNA-mallen28. Tidigare försök att modifiera polymeras C-ändstationen har resulterat i fullständig förlust av enzymatisk aktivitet om inte andra kompenserande mutationer införs. 29,30 N-terminalfusioner av T7 RNAP tolereras väl, även om valet av fusionstagg kan påverka polymerasaktiviteten. Hur olika taggar påverkar RNAP-aktiviteten har inte systematiskt fastställts. SNAP-taggen valdes eftersom den är effektiv och robust, vilket möjliggör kvantitativ märkning för stökiometriska förhållanden mellan protein och oligonukleotid. Alternativt kan andra kopplingskemier användas för att länka oligonukleotid till polymerasen, såsom Ybbr31-taggar, Sortase-taggarna32och SpyTags33, eller annars via införandet av onaturliga aminosyror med reaktiva grupper. Skillnaden i storlek och sekvens mellan dessa taggar kan också påverka aktiviteten hos det resulterande fusionsproteinet, och det optimala valet för platsspecifik RNAP-märkning förtjänar framtida undersökning. Slutligen rekommenderas att begränsa längden på oligonukleotid som är fastbunden vid RNAP till < 30 nt. Detta är utformat för att minska icke-specifika elektrostatiska interaktioner mellan oligonukleotid med DNA-bindningsområdet för T7 RNAP och för att underlätta rening av oligonukleotidtjuderad RNAP genom jonutbyteskromatografi.
Den föreslagna tekniken som beskrivs här kräver uttryck av en rekombinant SNAP T7 RNAP, och det finns två kritiska steg under syntesprocessen som påverkar proteinproduktens totala utbyte. För det första kan användning av ultraljudsbehandling för celllys värma upp provet (avsnitt 4). För att säkerställa effektiv celllys och proteinutvinning utan värmeförnekande proteinet bör cellprovet förvaras på is under hela ultraljudsbehandlingen och temperaturen på ultraljudsbehandlingssonden övervakas mellan varje prov. Ett andra kritiskt steg är buffertutbytet och uppkoncentrationen av SNAP T7 RNAP efter his-tag-rening (steg 4.11.2). Det är viktigt att försiktigt pipettera membranet i centrifugalfilterenheten för att förhindra proteinaggregering, vilket skulle minska den totala avkastningen och proteinfunktionen.
I princip är BG-oligonucleotide reaktionen med SNAP-tagg kvantitativ vid ett 1: 1 molar förhållande. En rad stoichiometriska förhållanden mellan oligonukleotid och polymeras bör dock testas innan ett större parti av materialet förbereds. Detta beror på att uppskattningarna av proteinkoncentrationen kan vara felaktiga. Detta steg kan kräva att SDS-PAGE utförs av kopplingsreaktionen vid olika utspädningar av BG-oligonukleotid med avseende på en konstant proteinkoncentration för att identifiera det optimala kopplingsförhållandet. Under PAGE-analys kan samma gel vara seriellt fläckad med två fläckar: en nukleinsyra fläck följt av en Coomassie Blå protein fläck. Det är viktigt att tvätta SDS noggrant från gelén innan du färgar med nukleinsyrafläcken. Detta beror på att SDS kommer att fånga färgämnet i gelén, vilket leder till en hög bakgrundssignal. Dessutom måste nukleinsyrafläcken utföras före Coomassie Blue proteinfläcken.
Medan detta föreslagna system sammanför skalbarheten hos en DNA-krets med funktionaliteten hos en proteinbaserad transkriptionskrets, introducerar det också begränsningar som ses i transkriptionskretsar. En av de många fördelarna med DNA-datorer är stabiliteten hos nukleinsyror i en mängd olika miljöer. Med tillsats av polymeraser måste det tjudrade polymerassystemet förvaras under särskilda förhållanden för att förhindra denaturering. Dessutom måste datoranvändning ske i en miljö med specifika buffert villkor som möjliggör transkription. Även om RNA-polymeraset från T7-bakteriofag används i denna demonstration, kan ett annat RNA-polymeras med mer applikationsanpassade villkor användas för att kringgå denna begränsning.
Resultaten visar att detta tjudrade polymerassystem kan växlas mellan OFF (t.ex. i bur) och ON(dvs. uncaged) tillstånd med hjälp av nukleinsyra "transkriptionsfaktorer". Genom att använda DNA för att reglera transkription kan du utforma transkriptionskretsar i stor skala, inklusive att bygga flerskiktssignalkaskader och återkoppling. En annan funktion är självförstärkning av indatasignaler som tas emot eller passerar genom kretsen, eftersom ett aktiverat polymeras som har hybridiserats till en mall fortsätter att producera fler kopior av utskriften tills den stoppas. Denna signalförstärkningsmekanism kan utnyttjas för att förstärka kretsresponsen på lågkoncentrationsingångar. Slutligen kan denna byggsten användas för att implementera en rad digitala logiker. Denna studie visar aktivering av mallar via "AND logic" genom att utforma mallar som måste aktiveras av två nukleinsyrasträngar. På samma sätt kan "OR logic" utformas genom att göra en DNA-mall lyhörd för endast del B och införa en "adapter" mellanliggande som binder sträng A i utbyte mot att producera ännu en kopia av del B. I det här fallet skulle införandet av antingen del A eller B som indata i reaktionen utlösa transkription av mål-DNA-mallen. Förmågan att rationellt utforma en mängd olika kretsbeteenden i stor skala bör möjliggöra implementering av komplexa molekylära datoralgoritmer för framväxande tillämpningar inom sjukdomsdetektering, bärbar biotillverkning samt molekylär databehandling och lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga konkurrerande ekonomiska intressen att deklarera av någon av författarna.
Acknowledgments
L.Y.T.C erkänner generöst stöd från New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant och University of Toronto's Medicine by Design Initiative, som får finansiering från Canada First Research Excellence Fund (CFREF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20) | BioShop | TWN510.5 | |
| 0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio Basic | SD8135 | |
| 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7) | Bio Basic | PD0435 | Tablets used to make 10 mM buffer |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678-100G | |
| 100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC910008 | |
| 100% acetone | Fisher Chemical | A18P4 | |
| 100% ethanol (EtOH) | House Brand | 39752-P016-EAAN | |
| 10x in vitro transcription (IVT) buffer | New England Biolabs | B9012 | |
| 10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Bio Basic | A0026 | |
| 1M Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I5502-1G | |
| 1M sodium bicarbonate buffer | Sigma Aldrich | S6014-500G | |
| 1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 648311-1KG | |
| 1X Tris-EDTA (TE) buffer | ThermoFisher | 12090015 | |
| 2M imidazole | Sigma Aldrich | 56750-100G | |
| 2-mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 3M sodium acetate | Bio Basic | SRB1611 | |
| 40% acrylamide (19:1) | Bio Basic | A00062 | |
| 4x LDS protein sample loading buffer | Fisher Scientific | NP0007 | |
| 5M sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| 5mM dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43815-1G | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| agarose B powder | Bio Basic | AB0014 | |
| BG-GLA-NHS | New England Biolabs | S9151S | |
| BL21 competent E. coli | Addgene | C2530H | |
| BLUeye prestained protein ladder | FroggaBio | PM007-0500 | |
| bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| coomassie blue (SimplyBlue SafeStain) | ThermoFisher | LC6060 | |
| cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain) | Fisher Scientific | S11494 | |
| cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain) | Fisher Scientific | S33102 | |
| dry dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D12345 | |
| formamide | Sigma Aldrich | F9037-100ML | |
| glycerol | Bio Basic | GB0232 | |
| kanamycin sulfate | BioShop | KAN201.5 | |
| lysogeny broth | Sigma Aldrich | L2542-500ML | |
| malachite green oxalate | Sigma Aldrich | 2437-29-8 | |
| N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| NuPAGE MES SDS running buffer (20x) | Fisher Scientific | LSNP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well | Life Technologies | NP0322BOX | |
| oligonucleotide (cage antisense) | IDT | N/A | TATAGTGAGTCGTATTAATTTG |
| oligonucleotide (cage sense) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA |
| oligonucleotide (malachite green aptamer antisense) | IDT | N/A | GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT |
| oligonucleotide (malachite green aptamer sense) | IDT | N/A | TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC |
| oligonucleotide (Transcription Factor A) | IDT | N/A | AGTACACCAACTACGAGTGAG |
| oligonucleotide (Transcription Factor B) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG |
| oligonucleotide with 3’ Amine modification (tether) | IDT | N/A | GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/ |
| Pierce strong ion exchange spin columns | Fisher Scientific | 90008 | |
| plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes | Genscript | N/A | custom gene insert |
| protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column) | Fisher Scientific | 88226 | |
| rNTP mix | New England Biolabs | N0466S | |
| Roche mini quick DNA spin column | Sigma Aldrich | 11814419001 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | |
| Ultra Low Range DNA ladder | Fisher Scientific | 10597012 | |
| urea | BioShop | URE001.1 |
References
- Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
- Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).
- Chen, Y. -J., et al. Programmable chemical controllers made from DNA. Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).
- di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V.
- Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects. Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).
- Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).
- MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational sequence design with R2oDNA Designer. Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).
- Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Martínez-Pérez, I. M. Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach. Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).
- Wetterstrand, K.
- Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics. Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. A DNA-fuelled molecular machine made of DNA. Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).
- Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. Dynamic and scalable DNA-based information storage. Nature Communications. 11 (1), 2981 (2020).
- Yurke, B., Mills, A. P. Using DNA to power nanostructures. Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).
- Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA. Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).
- Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. Effective design principles for leakless strand displacement systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).
- Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement. Nature Communications. 5 (1), 5324 (2014).
- Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -B. V., Ouldridge, T. E. Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions. bioRxiv. , (2020).
- Brophy, J. A. N., Voigt, C. A.
- Khalil, A. S., et al. A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions. Cell. 150 (3), 647-658 (2012).
- Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).
- Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles. Journal of immunotherapy. 31 (7), 607 (2008).
- Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits. Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).
- Baugh, C., Grate, D., Wilson, C. 2.8 Å crystal structure of the malachite green aptamer11. Journal of Molecular Biology. Doudna, J. A. 301 (1), 117-128 (2000).
- Chou, L. Y. T., Shih, W. M. In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors. ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).
- Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis. Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase. Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).
- Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).
- Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step. Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).
- Zhang, W. -B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).
