Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Organoid-abgeleiteten intestinalen Epithel-Monolayern zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion, Permeabilität und des Transports. Da Organoide die ursprüngliche Reaktion des Epithelgewebes auf äußere Reize darstellen, kombinieren diese Modelle die Vorteile der Erweiterbarkeit von Zelllinien und die Relevanz und Komplexität von Primärgewebe.
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Methodenartikel
Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In der Vergangenheit waren intestinale Epithelmodellsysteme auf transformierte Zelllinien und Primärgewebe beschränkt. Diese Modellsysteme haben inhärente Einschränkungen, da erstere die ursprüngliche Gewebephysiologie nicht getreu darstellen und die Verfügbarkeit der letzteren begrenzt ist. Daher behindert ihre Anwendung die Grundlagen- und Arzneimittelentwicklungsforschung. Adulte Stammzell-basierte Organoide (im Folgenden als Organoide bezeichnet) sind Miniaturen von normalem oder erkranktem Epithelgewebe, aus dem sie gewonnen werden. Sie können sehr effizient aus verschiedenen gastrointestinalen (GI) Traktregionen etabliert werden, haben eine langfristige Erweiterbarkeit und simulieren gewebe- und patientenspezifische Reaktionen auf Behandlungen in vitro. Hier wurde die Etablierung von intestinalen organoidabgeleiteten epithelialen Monoschichten zusammen mit Methoden zur Messung der Integrität, Permeabilität und des Transports der Epithelbarriere, der antimikrobiellen Proteinsekretion sowie der Histologie demonstriert. Darüber hinaus können intestinale Organoid-abgeleitete Monoschichten mit proliferierenden Stamm- und Transit-amplifizierenden Zellen sowie mit wichtigen differenzierten Epithelzellen angereichert werden. Daher stellen sie ein Modellsystem dar, das darauf zugeschnitten werden kann, die Auswirkungen von Verbindungen auf Zielzellen und deren Wirkungsweise zu untersuchen. Obwohl Organoidkulturen technisch anspruchsvoller sind als Zelllinien, können sie, sobald sie sich etabliert haben, Fehler in den späteren Stadien der Arzneimittelentwicklung reduzieren, da sie wirklich die Komplexität des In-vivo-Epithels und die interpatientische Heterogenität darstellen.
Einleitung
Das Darmepithel fungiert als physikalische Barriere zwischen dem luminalen Gehalt des Darms und dem darunter liegenden Gewebe. Diese Barriere besteht aus einer einzigen Epithelschicht von hauptsächlich absorbierenden Enterozyten, die durch Tight Junctions verbunden sind, die starke interzelluläre Verbindungen zwischen benachbarten Zellen herstellen. Diese Zellen bilden eine polarisierte Epithelauskleidung, die die apikale (Lumen) und die basolaterale Seite des Darms trennt und gleichzeitig den parazellulären Transport von verdauten Nährstoffen und Metaboliten reguliert. Neben den Enterozyten tragen auch andere wichtige Epithelzellen wie Kelch-, Paneth- und enteroendok....
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Protokoll
1. Herstellung von Reagenzien für die Kultur
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Biosicherheitskabine durch und befolgen Sie die Standardrichtlinien für die Arbeit mit Zellkulturen. Ultraviolettes Licht wird 10 Minuten lang verwendet, bevor die Biosicherheitskabine in Betrieb genommen wird. Vor und nach dem Gebrauch wird die Oberfläche der Biosicherheitswerkbank mit einem Seidenpapier gereinigt, das mit 70% Ethanol getränkt ist. Um die Bildung dreidimensionaler Tropfen extrazellulärer Matrix (ECM) zu erleichtern, halten Sie einen vorgewärmten Bestand von 96-, 24- und 6-Well-Platten im Inkubator bei 37 ° C bereit.
- Basale Med....
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Ergebnisse
Abbildung 1A zeigt ein repräsentatives Hellfeldbild von Darmorganoiden nach dem Auftauen aus einem Kryovia. Es ist wichtig, Organoide mit hoher Dichte aufzutauen, um eine optimale Erholung zu gewährleisten. Organoide sind in 24- oder 6-Well-Platten in ECM-Domes von etwa 10 μL plattiert (Abbildung 1B). Die meisten normalen Darmorganoide haben eine zystische Morphologie. Nach der Erholung vom Auftauprozess wachsen die Organoide zu einer größeren Größe heran und si.......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt die allgemeine Manipulation und Aufrechterhaltung von Darmorganoiden sowie die Herstellung und mögliche Anwendungen von epithelialen Monoschichten, die von diesen Organoiden abgeleitet sind. Bisher wurden Monoschichten erfolgreich aus dem Zwölffingerdarm, dem Ileum und verschiedenen Regionen von Dickdarmorganoiden hergestellt, die sowohl aus normalem als auch zuvor und aktiv entzündetem Darmgewebe stammen (unveröffentlichte Daten). Die Anwendung von patientenabgeleiteten organoiden Monoschicht.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Danksagungen
Diese Arbeit wird unterstützt durch das Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) Public-Private Partnerships (PPP) Allowance des niederländischen LSH-Sektors mit der Projektnummer LSHM16021 Organoids als neuartiges Werkzeug für die toxikologische Modellierung der Hubrecht Organoid Technology (HUB) und der HUB-internen Finanzierung für die Abteilung Disease Modeling and Toxicology. Wir danken den Labors von Sabine Middendorp (Abteilung für Pädiatrische Gastroenterologie, Wilhelmina Children's Hospital, UMC, Utrecht) und Hugo R. de Jonge und Marcel J.C. Bijvelds (Abteilung für Gastroenterologie und Hepat....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 100% Ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300 und 20 µ L Low-Retention-Filterspitzen | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 mL konische Röhrchen | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24-Well-Zellkulturplatten | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-Well-HTS Fluoroblok Transwell-Platte (lichtdicht) | Corning | 351156 | |
| 24-Well-HTS-Transwell-Platten (Tabelle 1) | Corning | 3378 | |
| 24-Well-Platte mit Transwell-Einsätzen | Corning | 3470 | |
| 40 & micro; m Zellsieb | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL konische Röhrchen | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-Well-Zellkulturplatten | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-Well-Platte schwarz mit transparentem Boden | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-Well-Schnellwechselplatten | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96-Well-HTS-Fluoroblok-Transwell-Platte | Corning | 351162 | |
| 96-Well-HTS-Transwell-Platten (Tabelle 1) | Corning | 7369 | |
| 96-Well-transparente Kulturplatte | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase-Zelldissoziationsreagenz | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | Zelle Dissoziationsreagenz 2 |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 Ergänzung | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Zellkulturmikroskop (Lichtmikroskop / optisches Mikroskop) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Zentrifuge | Eppendorf | ||
| CO2-Inkubator | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC-behandelter H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco mit Ca2+ und Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, Pulver, kein Kalzium, kein Magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 Messgerät mit STX-Elektrode | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Glaspipetten | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 Primärantikörper | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 Sekundärantikörper | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasobjektträger mit Zählgittern | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Laminar-Flow-Haube | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH Dilithiumsalz | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, Wachstumsfaktor reduziert ( GFR) | Corning | 356231 | extrazelluläre Matrix (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0,1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Mikropipetten (1000, 200 und 20 & Mikro; L) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 Primärantikörper | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 Sekundärantikörper | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Mehrkanalpipette (200 & Mikro; L) | Gilson | ||
| N-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0,5 mg | |
| Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonukleotid ALPI1 / Vorwärts | Sonderanfertigung | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonukleotid ALPI1 / Rückwärts | Sonderanfertigung | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonukleotid LGR5 / Vorwärts | Sonderanfertigung | ACACGTACCCAGAGAAGCTC | |
| Oligonukleotid LGR5 / Rückwärts | Sonderanfertigung | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonukleotid MUC2 / Vorwärts | Sonderanfertigung | AGGATCTGAAGAAGTGTGTGTCACTG | |
| Oligonukleotid MUC2 / Rückwärts | Sonderanfertigung | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonukleotid TBP/Vorwärts | Sonderanfertigung | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonukleotid TBP/Rückwärts | Sonderanfertigung | AAATCAGTGCCGTGTGTGTG | |
| Optischer Klebstoff bedeckt | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies Europa BV | 15140122 | |
| Plattenschüttler | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master | Mix Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimikrobielle Formulierung für Primärzellen |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reagenzreservoir für Mehrkanalpipetten | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler mit 24-Sonde oder 96C-Sonde | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo | Scientific 87023 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Serologische Pipetten | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Serologische Pipette (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Einschneidige Rasierklinge | GEM Scientific | ||
| Superscript 1. Strangsystem für RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M Plattenleser | Tecan | ||
| Trypanblau-Lösung, 0,4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzym (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Reagenz für Zelldissoziation 1 |
| Wasserbad | Grant | ||
| Y27632 (ROCK-Inhibitor) | AbMol | M1817 |
Referenzen
- Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permea....
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Nachdrucke und Genehmigungen
