Summary
다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하면 크롬노그래피 컬럼을 병렬 친화성 또는 이온 교환 정제를 위한 다중 웰 컬렉션 플레이트와 인터페이스하여 경제적인 높은 처리량 단백질 정제 방법을 제공합니다. 그것은 중력 또는 진공 산출 밀리 그램 양의 단백질을 통해 저렴 한 계측을 통해 사용할 수 있습니다.
Abstract
단백질 정제는 단백질 구조 및 기능에 대한 연구에 필수적이며 일반적으로 생물 물리학 기술과 함께 사용됩니다. 그것은 또한 새로운 치료의 개발에 핵심 구성 요소. 기능성 프로테오믹스의 진화하는 시대는 이를 용이하게 하기 위해 고처리량 단백질 정제 및 개선된 기술에 대한 수요를 촉진하고 있다. 다중 컬럼 플레이트 어댑터(MCPA)가 병렬 정제를 위해 다중 웰 플레이트와 다른 수지의 여러 크로마토그래피 컬럼을 인터페이스할 수 있다고 가설이 있었습니다. 이 방법은 자동화 된 시스템의 속도에 필적하는 중력 이나 진공 하에서 사용할 수있는 경제적이고 다양한 단백질 정제 방법을 제공합니다. MCPA는 후속 특성화 및 분석을 위한 저렴하고 시간 효율적인 방법으로 단백질의 밀리그램 수율을 회수하는 데 사용할 수 있습니다. MCPA는 SH3 도메인의 높은 처리량 선호도 정화에 사용되었습니다. 이온 교환은 또한 단백질 포스트 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 정화하기 위해 MCPA를 통해 입증되었으며, 이는 이 시스템이 다른 정제 유형에 어떻게 적응될 수 있는지를 나타냅니다. 여러 열로 설정하기 때문에 파라미터의 개별 사용자 지정은 현재 플레이트 기반 방법에 의해 달성 할 수없는 동일한 정제로 이루어질 수 있습니다.
Introduction
정제된 단백질의 밀리그램 양을 달성하는 단백질 정제 기술은 특히 NMR과 같은 생물 물리학 적 방법에 대한 특성화 및 분석에 필수적입니다. 단백질 정제는 또한 약물 발견 과정 및 단백질 단백질 상호 작용 연구와 같은 연구의 다른 영역에 걸쳐 중심; 그러나, 이러한 양의 순수 단백질을 달성하는 것은 이러한 기술에 대한 병목 현상이 될 수 있다1,2,3. 단백질 정화를 위한 주요 방법은 단백질과 그들의 꼬리표의 개별적인 특성에 의존하는 다양한 방법을 포함하는 크로마토그래피입니다. 친화도 크로마토그래피에서, 단백질은 크로마토그래피 수지4에특정 기판에 대한 친화력을 갖는 태그로 작동하는 추가 단백질 또는 펩티드 모티프를 가지고 있다. 가장 일반적인 친화성 방법은 그의 태그 단백질을 사용하여 고정 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)이며, 또 다른 인기있는 방법은 충전에 따라 단백질을 분리하는 이온 교환 크로마토그래피입니다. 최고 순도를 위해 친화도 크로마토그래피와 이온 교환의 조합이 자주 함께 사용되며 일반적으로 고처리량에 대한 고가의 실험실 장비가 필요합니다.
기능성 프로테오믹스의 진화하는 시대는 특정 분석을 위한 단수 단백질이 아니라 포괄적인 분석 및 게놈 와이드연구를위해 동시에 많은 수의 단백질을 정화하기 위한 고처리량 기술에 대한 수요를 촉진하고 있다 5. 고정금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)는 고처리량 단백질 정제6,7, 소규모 실험실8에 대해 비용이 많이 들고 저렴하지않은 고처리량 단백질 정제를 위한 가장 널리 사용되는 방법 중 하나입니다. 현재 사용할 수있는 더 저렴한 판 기반 대안은 진공과 같은 접근 가능한 실험실 기반 장비의 사용을 사용합니다. 이러한 방법은 정화 속도를 개선하는 데 성공하지만, 마이크로그램 범위에서 단백질만 산출하는 작은 규모로고 처리량 정제를 달성할 수 있습니다. 이러한 제한은 미리 포장된 96개의 웰 필터 플레이트(예를 들어, 현재 Cytiva가 소유하고 있는 GE 헬스케어로부터)가 생물물리학 기술9이전에는 사용할 수 없음을 의미한다. 중력 크로마토그래피는 가장 비용 효율적인 정화 방법입니다. 그러나 여러 컬럼을 설정하는 것은 불편하며 여러 단백질에 오류가 발생하기 쉽습니다.
다중 컬럼 플레이트 어댑터(MCPA)가 성공적으로 편리하게 병렬 친화성 크로마토그래피 컬럼을 한 번에 실행하여 태그가 지정된 효모 SH3도메인(10)을정화하는 것으로 입증되었다. MCPA는 비용이 많이 드는 계측에 의존하지 않는 비용 효율적인 고처리량 정제 방법을 제공합니다. 유연한 설계는 중력 또는 진공 매니폴드 아래 여러 친화성 크로마토그래피 컬럼을 통해 밀리그램의 단백질을 효과적으로 정화할 수 있습니다. 또한 수지 유형, 볼륨 및 기타 매개 변수는 각 개별 컬럼에 대해 조정하여 더 빠른 최적화를 할 수 있습니다. 이 연구는 MCPA에 의한 이온 교환 크로마토그래피를 MCPA에 의한 친화성 크로마토그래피와 함께 Abp1 SH3 도메인의 정제를 향상시키는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 추가적으로, 최대 24개의 다른 단백질은 이 방법을 사용하여 병렬로 분리될 수 있습니다.
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Protocol
1. Ni-NTA 크로마토그래피 를 부인
- 버퍼 준비
참고: 모든 버퍼에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.- 0.5 M NaOH의 500mL를 구성하여 먼저 밀리-Q 물을 추가한 다음 비커가 교반기위에 있는 동안 NaOH를 천천히 추가하십시오. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터링합니다.
- 0.22 μm 필터를 사용하여 0.1 M 니켈 황산염 및 필터의 100mL를 준비합니다.
- 0.22 μm 필터를 사용하여 2M 이미다졸의 50mL를 준비하고 필터를 필터링합니다.
- 준비 및 0.22 μm 필터 1.5 L pH 8.0에서 5.3 mM Tris-HCl, 4.7 mM Tris-base (Tris (하이드록시메틸) 메틸라민), 13.7 mM NaH2PO4,86.3 mM Na2HPO4 및 6 M guani.
- 준비 및 0.22 μm 필터 500 mL의 용해 완충액 10 mM imidazole 는 2 M imidazole 주식을 사용하여 데마링 버퍼 (1.1.4 참조)에 용해된다.
- 준비 및 0.22 μm 필터 500 mL의 세척 버퍼 용액 10 mM imidazole 는 2 M imidazole 주식을 사용하여 데마링 버퍼 (1.1.4 참조)에 용해된다.
- 준비 및 0.22 μm 필터 500 mL 의 100 mM EDTA 버퍼, 1 M NaOH를 사용하여 8에 pH를 조정합니다.
- 준비 및 0.22 μm 필터 500 mL의 용출 버퍼는 6 M 과니딘 염산으로 99 % 빙하 아세트산의 7 mL로 구성됩니다.
참고: 네이티브 버퍼를 사용하는 경우 표 1에따라 조정합니다.
- 리싱 셀(데킹 방법)
- 과발현된 그의 태그 단백질을 포함하는 수확된 대장균 세포 펠릿 1g당 2mL의 용해 버퍼를 넣습니다. 세포가 다시 중단될 때까지 몇 분 동안 소용돌이. 샘플을 4°C에서 30분 동안 로커에 둡니다.
- 원심분리기는 30분 동안 18,000 x g의 펠릿을 용인했습니다. -20°C 냉동고에 50 μL을 따로 두어 나중에 SDS-PAGE 젤에서 분석하십시오.
- 펠릿이 방해받지 않도록 슈퍼네티츠를 조심스럽게 부어 넣습니다. Lysates는 맑고 밝은 노란색이어야 합니다. lysates가 흐린 경우 원심분리기 샘플이 다시 시료입니다. 핵산을 저하시킬 수 있다면 초음파 처리를 고려하십시오.
- 수지 없이 필터가 있는 빈 열을 통해 수퍼넌트들을 필터링하고 열린 컬렉션 트레이에서 수집합니다. 그런 다음 1.3 단계에서 사용하기 위해 튜브로 옮습니다.
참고: 네이티브 버퍼를 사용하는 경우, 1.2.1 단계 후, 샘플을 -80°C에서 동결/해동3 사이클로 처리하거나 초음파 처리 또는 프렌치 프레스에 의해 세포를 용해한다.
- 진공 정화 설정 및 컬럼 계평 준비
참고: 참조 그림 1 24개의 열이 있는 MCPA를 설정합니다.- 원하는 수지 유형 및 볼륨뿐만 아니라 필요한 열 수를 결정합니다. T7 기반 플라스미드를 사용하여 자신의 태그된 SH3 도메인을 표현하는 100mL의 자동 유도 배양(~2g 펠릿)에 대한 엄지 손가락의 규칙으로, 컬럼당 0.6mL의 Ni-NTA 수지를 사용하여 약 6mL의 용액에서 약 3 mg의 단백질을 산출하십시오.
- 12mL 컬럼(수지 없이 필터)의 원하는 수수를 미리 조립된 MCPA(천공 밀봉 매트가 있는 긴 드립 플레이트)에 삽입합니다. 기둥은 구멍이 뚫린 밀봉 매트의 구멍에 꼭 맞아야 합니다.
- 24개 미만의 열을 사용하는 경우 빈 구멍에 빈 닫힌 열이 있는 경우 닫습니다.
- 오픈 컬렉션 플레이트를 가지고 진공 매니폴드의 베이스에이 플레이트를 넣고 매니폴드의 상단으로 닫습니다.
- 조립된 MCPA를 진공 매니폴드 위에 기둥이 놓습니다.
- 진공 펌프 시스템에서 진공 매니폴드 하단의 입구/노즐에 튜브를 부착합니다.
- Ni-NTA 구슬이 20%의 에탄올로 50% 솔루션에 있는지 확인합니다. 구슬로 무엇이든 하기 전에 비드/에탄올 용액을 부드럽게 흔들며 섞어 균일하게 다시 중단합니다. 그런 다음 5mL 파이펫을 사용하여 50% 용액의 파이펫 1.2 mL을 열로 입력합니다. 파이펫팅동안 구슬이 완전히 혼합되어 있는지 확인합니다.
- 24개의 컬럼을 모두 입력한 후 진공 펌프를 켜고 20% 에탄올을 컬럼을 통과하여 아래 컬렉션 플레이트로 실행합니다.
- 모든 20% 에탄올이 모든 컬럼을 통과하면 펌프를 끕니다(Ni-NTA 수지는 버퍼가 컬럼을 통과한 후에도 진공이 계속 적용되면 간단한 건조를 견딜 수 있습니다). 열린 수거 판에 있는 것을 폐기하여 폐기상자에 넣습니다.
주의: Ni-NTA 구슬의 모든 폐기물은 구슬을 취급하거나 폐기물을 폐기하고 장갑, 고글 및 기타 PPE를 착용할 때 위험합니다. 또한, 모든 니켈 황산염 폐기물을 별도의 용기에 넣고 나중에 개별 처리를 위해 폐기하십시오.
참고: 수지가 새 또는 최근에 재생되는 경우 이러한 단계의 나머지 단계를 무시하여 다음 섹션으로 이동합니다. - 20mL 주사기 또는 50mL 주사기가 있는 리피터 주사기 장치를 사용하여 100mMM EDTA 버퍼의 수지 볼륨(1.8mL) 3개(1.8mL)를 추가합니다. 그런 다음 진공 펌프를 켜서 EDTA 버퍼가 세척하고 세척한 후 펌프를 끄도록 합니다.
참고: 이 세척은 니켈 파란색을 제거해야 하지만 그렇지 않은 경우 모든 열이 파란색을 잃을 때까지 이 단계를 반복합니다. 펌프를 끄고 열린 수거 판의 내용을 폐상자에 붓습니다. - 펌프를 켜고 각 열을 통해 실행하기 전에 각 열에 0.5 M NaOH 버퍼의 3 수지 볼륨 (1.8 mL)을 추가합니다. 빈 컬렉션 플레이트.
- 각 열에 100mM 니켈 황산염의 4수지 부피(2.4mL)를 추가합니다. 진공 펌프를 켜고 다시 한 번 컬럼을 통해 실행합니다.
- 밀리-Q 물의 수지 부적 10개(~6000 μL)를 추가하고 컬럼을 통해 실행합니다. 펌프를 끄고 수거 판의 내용을 폐상자에 붓습니다.
- 열을 10m 이미다졸4량(2.4mL)으로 2회 세척하여 세척 버퍼(데니케이션 또는 네이티브)로 세척하여 여분의 니켈을 제거하고 평형을 차지합니다. 빈 컬렉션 플레이트.
참고: 컬럼이 상당히 느리게 실행되는 경우 큰 주사기를 사용하여 열을 분리하고 공기를 확인MCPA를 통해 공기를 밀어붙일 수 있습니다. 이 것을 차단 해제한 경우 새 필터가 있는 다른 열을 사용합니다. - 여러 가지 샘플/단백질이 MCPA에서 정제될 경우 오픈 컬렉션 플레이트를 48 x(5mL/well) 수집 플레이트로 교체합니다. 그러나, 모든 컬럼에서 동일한 단백질 샘플만 을 실행할 때, 오픈 수집 플레이트를 사용하여 계속 하는 것이 좋다.
- 적재, 세탁 및 용출
- 진공 을 끄면 하중 용해가 열로 떨어집니다 (용해량은 일반적으로 1에서 12 mL 이상으로 다양하며 여러 배치로로드해야 할 수 있습니다). 얇은 플라스틱 교반기를 사용하여 구슬과 기둥의 용재를 부드럽게 혼합하여 바인딩을 최대화합니다.
- 각 컬럼을 몇 분 간 부드럽게 혼합한 후 진공 펌프를 켜고 기둥을 통해 lysates를 실행합니다. 여러 단백질 샘플이 실행되는 경우 48 개의 우물 수집 플레이트를 사용하고 4 mL이 이 플레이트의 우물을 통과 한 후 다른 48 개의 우물 플레이트에 대한 수집 플레이트를 교체해야합니다. 모든 lysates가 열을 통해 실행될 때까지 lysate를 계속 실행합니다. 흐름이 포함된 수집 플레이트를 동결합니다.
참고: 열이 "차단"되어 lysate가 열을 통해 흐르는 속도가 예상보다 느려질 수 있습니다. 이것은 쉽게 이웃 열이 정상 속도로 흐르는 것으로 발견된다. 이 경우, 리세이트/수지 혼합물을 신선한 필터를 포함하는 컬럼으로 옮기는 것이 좋습니다. - 수집 판을 빈 오픈 컬렉션 플레이트로 교체한 다음 각 열에 10mM imidazole 세척 버퍼의 9개의 수지 볼륨(5.4mL)을 추가하고 진공을 켜고 세척을 실행합니다. 이 것을 4-5번 반복합니다. 오버플로를 방지하기 위해 주기적으로 비어 있는 폐기물 플레이트입니다.
- 그런 다음 수집 판을 깨끗한 적절한 플레이트로 교체하십시오 (단백질 1개만 열면 플레이트와 96개의 단백질이 있는 경우 A1이 왼쪽 상단 모서리에 있는지 확인).
- 12.5mL 주사기가 있는 리피터 주사기를 사용하여 각 열에 용출 버퍼를 데스팅하는 파이펫 ~1 수지 부피(0.75 mL)를 사용합니다.
- 단백질 발포를 피하려면 가장 낮은 환경에서 진공 펌프를 켭니다. MCPA를 부드럽게 들어 올려 컬렉션 플레이트에 떨어지는 것이 남아 있는지 확인합니다.
참고: 진공 또는 중력으로 용출하는 대안은 10mL 주사기 플런저를 컬럼 의 맨 위에 밀어 들어 열을 통해 용출 버퍼를 부드럽게 밀어 넣는 것입니다. 주사기 플런저를 제거할 때 열 하단의 구슬을 방해하지 않도록 주의하면서 모든 열에 대해 이 작업을 수행합니다. 용출 버퍼가 통과되면 사용된 마지막 열에서 주사기 플런저를 부드럽게 제거하고 진공 펌프를 잠시 켜서 열에서 마지막 방울을 제거합니다.- 96웰 컬렉션 플레이트가 사용된 경우, 긴 드립 플레이트를 통해 각 열에서 흐르는 것이 하나의 우물로 만 흐르고 아무것도 수집 판의 이웃 우물에 용례되지 않도록 수집 판을 확인하십시오.
- 다음 용출을 위해 위의 2 단계를 반복하고 신선한 멀티 웰 (다른 샘플) 또는 오픈 컬렉션 플레이트 (동일한 샘플)로 수집합니다.
- 선택적 단계, 순도 및 농도 분석을 위해 각 용출의 50 μL 알리쿼트복용.
- 각 컬럼에 20% 에탄올 2mL를 추가하고 진공 펌프를 사용하여 이를 실행합니다. 그런 다음 기둥에 20% 에탄올의 또 다른 2mL을 추가하고 신선한 얇은 플라스틱 교반기를 사용하여 20% 에탄올과 구슬을 혼합한 후 50mL 튜브로 이송하여 4°C에서 보관합니다. 기둥을 청소하고 물이 각 열을 통해 자유롭게 흐르는지 확인한 다음 모든 것을 청소하고 나중에 사용하기 위해 버려두세요.
참고: 일부 열은 결국 필터를 차단하고 너무 느리게 실행되며 이러한 열을 교체하거나 필터를 청소해야 합니다. 따라서 수지를 제거하고 열을 물로 채우면 필터를 주기적으로 테스트하여 필터가 빠르게 흐르는지 확인하는 것이 좋습니다. 필터는 닫힌 열을 둔용 버퍼로 채우고 밤새 흔들어 서 청소할 수 있습니다.
2. 이온 교환 - 단일 단백질 정제
- 버퍼 준비
참고: 모든 버퍼에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.- 2 L 저염 버퍼 준비: 10 m M Tris pH 8.1 (5 mM Tris Acid, 5 mM Tris 기지). 0.22 μm 필터를 사용하여 용액을 필터링합니다.
- 0.5 L 고염 버퍼 준비: 10 mM Tris pH 8.1, 4 M NaCl. NaCl 116.9 g을 측정하고 위에서 10m Tris pH 8.1로 0.5 L까지 구성합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 용액을 필터링합니다.
- 소금 농도 시리즈 만들기: 0-1 M NaCl.
참고: 모든 단백질에 대해 소금 농도의 범위를 조정할 수 있습니다.- 랙에 24 x 50mL 라벨원심분리기 튜브 설치
- 위에서 만든 버퍼를 사용하여 0-1000 μM에 이르는 24 x 14 mL NaCl 희석제를 준비합니다. 이것은 단백질에 따라 25 mM 또는 50 mMM의 증분에 의해 행해질 수 있었습니다.
- 그런 다음 각 튜브에 10mM Tris의 필요한 볼륨을 추가합니다. 혼합 각 튜브를 여러 번 반전.
- 샘플 준비
- 이온 교환에 의해 정제될 샘플을 가져옵니다. 선택적으로 나중에 분석을 위해 50 μL 알리쿼트를 가져 가라.
참고: 샘플은 항상 차갑게 유지되어야 합니다. 이들은 lysates 수 있습니다., 또는 어쩌면 게시 Ni-NTA. 데마링 버퍼의 Ni-NTA 샘플은 10m Tris 버퍼에서 투석 또는 버퍼 교환이 필요합니다. 네이티브 버퍼에서 Ni-NTA의 샘플은 단백질이 IEX 수지에 결합할 수 있도록 염 농도를 감소시키기 위해 10m Tris 버퍼로 희석될 수 있습니다. - 18,000 x g에서 10분 동안 샘플을 회전시합니다.
- 상체를 계량 보트에 조심스럽게 붓습니다. 펠릿을 방해하지 마십시오.
- 20mL 주사기에 상체를 조심스럽게 들고 0.22 μm 필터를 부착합니다.
- 필터를 통해 상체를 천천히 50mL 튜브로 배출합니다.
- 희석이 필요한 경우, 위에서 만든 10m Tris 버퍼로 상전자를 희석시(이 실험에서 상퍼는 2에서 1을 희석하였다). 그 동안 4 °C에 보관하십시오.
- 이온 교환에 의해 정제될 샘플을 가져옵니다. 선택적으로 나중에 분석을 위해 50 μL 알리쿼트를 가져 가라.
- 진공 정화 설정 및 평형 설정 준비
참고: 이 프로토콜에서는 하나의 샘플의 IEX 정화에 하나의 열만 사용됩니다. 여러 정화의 경우 다음 섹션을 참조하십시오.- 원하는 수지 유형 및 볼륨을 결정합니다. 부분적으로 순수한 His 태그 SH3 도메인의 최대 20 mg에 대한 엄지 손가락의 규칙으로, 컬럼 당 Q-sepharose 빠른 흐름 수지의 0.4 mL을 사용합니다 (단계 2.4.8 참조).
- 미리 조립된 MCPA에 24개의 빈 열(하단에 필터 없이 비어 있음)을 삽입합니다. 기둥은 구멍이 뚫린 밀봉 매트의 구멍에 꼭 맞아야 합니다.
- 정화가 시작되는 첫 번째 위치를 제외한 모든 빈 열에 10mL 주사기 플런저를 놓습니다.
- 5mL 주사기 플런저 플런저 고무 개스킷(관통된)을 통해 열린 컬럼의 바닥을 밀어 기둥 끝에 고무 링이 형성됩니다. 이 고무 링은 이 열이 위의 각 빈 열에 삽입될 때 좋은 씰을 보장합니다. 지금은 MCPA의 첫 번째 빈 열에 이 열을 삽입합니다.
- 오픈 컬렉션 플레이트를 가지고 진공 매니폴드의 베이스에이 플레이트를 넣고 매니폴드의 상단으로 닫습니다.
- 조립된 MCPA(열 있음)를 진공 매니폴드 위에 놓습니다.
- 진공 펌프 시스템에서 진공 바닥의 입구/노즐에 튜브를 부착합니다.
- 파란색 파이펫 팁을 바닥에서 ~ 2cm ~ 자르고 Q-sepharose 구슬 (또는 다른 이온 교환 수지)의 800 μL을 차지하여 50/50 비드 에탄올 용액이 겹침을 피하기 위해 혼합되도록하십시오. 파이펫 800 μL은 첫 번째 위치에서 하나의 열린 열(필터 있음)으로 들어가고 구슬이 열 의 바닥에 정착하면 20% 에탄올을 통과할 수 있을 만큼 진공을 전환합니다.
- 10mM Tris의 2 x 2mL로 세파로즈 구슬이 들어 있는 컬럼을 세척합니다. 트리스 버퍼가 실행되기 직전에 진공을 끄면 수지 건조를 방지합니다. 런오프를 폐기할 수 있습니다.
참고: 수지이전에 사용 된 경우, 4 M NaCl의 5 수지 볼륨에서 세척한 다음 단계 2.4.9 전에 10 mM Tris의 5 수지 볼륨으로 세척하여 재생합니다.
- 적재, 세탁 및 용출
- 모든 시료를 첫 번째 위치에서 Q 세파로즈 컬럼으로 정수(섹션 3 참조)로 옮기고, 작은 플라스틱 루프를 사용하여 진공 펌프를 전환하기 전에 약 ~2분 동안 시료와 구슬을 저어줍니다.
참고: 초과 상수(>12 mL)의 경우 열을 과도하게 채우는 것을 조심하십시오. 샘플을 실행한 다음 더 추가한 다음 다시 실행하기 전에 혼합합니다. - 나중에 분석을 위해 흐름을 저장/동결합니다.
- 또 다른 오픈 컬렉션 플레이트를 진공 매니폴드에 넣은 다음 각 세파로즈 컬럼을 10mM Tris의 2 x 2mL로 세척합니다.
- 96 개의 웰 컬렉션 플레이트를 삽입하여 A1이 왼쪽 상단 모서리에 있는지 확인합니다.
- 첫 번째 용출 분획을 수집하려면 다음 열에서 주사기 플런저를 제거하고 Q 세파로즈 열을 이 위치로 이동하고 주사기 플런저를 이전 위치에 넣습니다. 그런 다음 첫 번째 염농도의 파이펫 1 mL을 Q 세파로즈 기둥으로 넣습니다. 펌프를 켜고 용출을 수집합니다. 구슬 근처의 액체 라인과 마찬가지로 펌프를 끄면 구슬이 건조되는 것을 방지합니다.
- 다음 용출 분획을 수집하려면 다음 열에서 주사기 플런저를 제거하고 Q 세파로즈 열을 이 위치로 이동하고 주사기 플런저를 이전 위치에 넣습니다.
- 다음 염농도 1mL을 컬럼에 넣고 모든 농도가 사용되고 24개의 출출이 24개의 별도 우물에서 수집될 때까지 공정을 반복한다. 액체가 인접한 우물에 들어가지 않은지 확인하십시오.
- 4M NaCl 10m Tris의 2mL로 컬럼을 세척합니다. 이 것을 실행하자.
- 20% 에탄올2mL로 씻으시다. 에탄올이 구슬 바로 위에 있을 때까지 실행하여 보관할 수 있도록 밀봉합니다.
- 96 개의 잘 수집 플레이트를 저장하고 UV 분광및 SDS PAGE로 분석하십시오.
- 모든 시료를 첫 번째 위치에서 Q 세파로즈 컬럼으로 정수(섹션 3 참조)로 옮기고, 작은 플라스틱 루프를 사용하여 진공 펌프를 전환하기 전에 약 ~2분 동안 시료와 구슬을 저어줍니다.
3. 이온 교환 - 24 가지 단백질의 동시 정제
참고: 버퍼 만들기, 일련의 소금 농도 및 샘플 준비에 대한 자세한 내용은 2.1-2.3 단계를 참조하십시오.
- 정화 설정 준비
참고: 정화 시스템이 어떻게 설정되는지는 정제되는 단백질의 수와 얼마나 많은 소금 조건이 사용될지에 따라 매우 좌우됩니다. 최대 24개의 시료까지 12개의 시료를 동시에 정화하려면, 엘루트에 사용되는 모든 염 농도에 대한 수집 플레이트가 필요합니다. 12개 미만의 샘플의 경우 수집 플레이트를 변경하기 전에 동일한 MCPA 내에서 크로마토그래피 컬럼을 몇 가지 위치로 이동할 수 있습니다. 이 경우 열을 빈 열에 배치할 필요가 없으며 MCPA 밀봉 매트에 직접 연결할 수 있습니다. 아래 의정서는 24개의 동시 이온 교환 정화입니다.- 조립된 MCPA를 24개의 빈 기둥에 직접 부착하여 필터를 진공 매니폴드 위에 놓고 위의 단일 정화 방법으로 24개의 이온 교환 컬럼을 준비하고 세척합니다. 이 정화를 위해 Eppendorf 리피터 또는 주사기를 사용하여 열을 빠르게 피펫하는 것이 편리합니다.
- 적재, 세탁 및 용출
- MCPA(세척된 정화 열 첨부)를 장착하기 전에 48웰 컬렉션 플레이트를 진공 매니폴드 베이스에 놓습니다. A1이 왼쪽 상단 모서리에 있는지 확인합니다.
- 각 단백질 샘플(한 번에 최대 5mL)을 해당 컬럼으로 파이펫합니다. 얇은 플라스틱 루프(오염을 피하기 위해 모든 열에 대한 루프 1개)를 사용하여 각 열을 약 2분간 저어줍니다. 그런 다음 진공 펌프를 켜고 상체가 흐르게합니다.
참고: 과잉 상부체의 경우 열을 덮어도 주의하십시오. 샘플을 열을 통해 실행한 다음 더 추가한 다음 다시 실행하기 전에 혼합합니다. - 저장/이 모든 단백질에 대한 흐름을 포함으로 나중에 분석을위한 48 잘 수집 플레이트를 동결.
- 또 다른 48웰 컬렉션 플레이트를 진공 매니폴드에 넣은 다음 각 세파로즈 컬럼을 10mM Tris의 2 x 2mL로 세척합니다.
- 처음 96웰 컬렉션 플레이트를 매니폴드에 삽입하여 A1이 왼쪽 상단 모서리에 있는지 확인한 다음 첫 번째 염 농도의 파이펫 1 mL을 각 열에 넣은 다음 진공 펌프를 켜서 컬럼을 통해 이를 실행합니다. 수집 판을 제거하고 파라필름으로 덮고 분석을 위해 4 °C에 보관하십시오.
- 엘루트에 사용되는 연속염 농도에 대해 반복단계를 반복합니다. 모든 용출에 새 컬렉션 플레이트가 사용되고 각 컬렉션 플레이트에 레이블이 지정되고 저장되어 있는지 확인합니다.
- 각 컬럼을 10m Tris, 4M NaCl로 2mL로 세척합니다.
- 각 컬럼을 20% 에탄올2mL로 씻으시다. 에탄올이 구슬 바로 위에 있을 때까지 실행하여 보관을 위해 씰 컬럼을 밀봉합니다.
- 96 개의 잘 수집 플레이트를 저장하고 UV 분광및 SDS-PAGE로 분석하십시오.
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Representative Results
예를 들어, MCPA는 Ni-NTA(그림2A)를통해 데칭 조건에서 14개의 AbpSH3 돌연변이를 성공적으로 정제하였다. 작은 오염 물질 ~ 25 kDa를 볼 수 있지만 단백질은 여전히 대체로 순수합니다. 이 오염 물질은 대장균11에서발견되는 일반적인 공동 정제 단백질인 YodA로여겨진다. 도 2B는 네이티브 조건하에서 11개의 서로 다른 SH3 도메인의 정제를 나타낸다. 데니징 조건에서 볼 수 있는 작은 오염 물질은 네이티브 조건에서 제거됩니다. 이는 MCPA가 표 1에 나열된 네이티브 또는 데니어링 버퍼로 구성된 정제를 비교하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.
IEX MCPA를 통한 용액의 정화를 위한 대표적인 데이터는 도 3에도시된다. 이것은 AbpSH3가 425 mM에서 700 mMMMM 사이에서 나중에 elutes로 오염 물질의 대다수에서 분리될 수 있다는 것을 건의합니다. 기둥에서 단백질을 엘로테하는 데 필요한 소금의 농도는 단백질과 수지 사이의 정전기 상호 작용의 강도와 관련이 있습니다. 세균성 단백질의 대다수는 낮은 오피가 있습니다; 그러나 관심의 단백질은 매우 부정적이며 더 낮은 pI를 갖는 것으로 보입니다. 상당히 순수한 AbpSH3 단백질의 좋은 수확량은 ~ 5 kDa에서 밴드로 볼 수있는 몇 가지 다양한 높은 분자량 오염 물질 AbpSH3로 회복되었다. 따라서 MCPA를 통한 IEX는 현재 오염 물질로부터 충분한 양의 단백질을 리자테에서 분리할 수 있으므로 정화 프로토콜의 첫 번째 단계로 사용될 수 있다.
MCPA를 이용한 IEX의 추가 정제는 Ni-NTA MCPA실행(그림 4)에서출품된 분획에 대해 성공적으로 입증되었다. 눈에 띄게, 두 개의 주요 봉우리400 및 700 mM 소금에서 최대물로 해결되었습니다, 이는이 단백질의 N 단말 잘린 버전을 분리에 해당 할 수있다. 추가 DSF 데이터 분석을 통해 피크 1이 약간 덜 안정적이고 피크 2에 비해 약간 낮은Tm을 가졌다는 것이 명백해졌습니다. lysate의 IEX 실행과 비교하여, 분수는 전반적으로 훨씬 깨끗하고 IEX 전에 Ni-NTA 단계를 실행의 이점을 보여줍니다. 더 높은 분자량의 단백질로 약간의 오염이 있더라도, 분수는 아직도 크게 순수하고 NMR 및 열/화학 적 성소 분석을 사용하여 좋은 생물 물리학 데이터를 산출했습니다.
그림 1: MCPA 기기의 전면 보기입니다. (A)24개의 열이 부착된 MCPA 기기의 전면 보기. 기둥은 96 웰 밀봉 매트 내에서 균등하게 간격을 두어 elutions를 96, 48 또는 오픈 컬렉션 플레이트로 안내합니다. (B)밀봉 매트의 상단 보기.(C)동일한 밀봉 매트의 바닥 보기.(D)기둥과 주사기 플런서가 부착된 MCPA의 전면 보기. 이 그림은 도밍게즈 외10에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 1 x 24 컬럼 구성, 다양한 SH3 돌연변이의 정제 및 네이티브 조건의 예. (A)다양한 AbpSH3 돌연변이의 정화를 거부한다. 각 차선에서 ~ 25 kDa의 약간의 오염을 발견 할 수 있습니다. (B)11개의 다른 효모 SH3 도메인의 기본 정제. 오염 물질은 각 차선에서 제거되었으며 더 이상 젤에 표시되지 않습니다. 이 그림은 도밍게즈 외10을수정했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: MCPA를 통해 IEX를 사용하여 용액의 정화. (A)이온교환(IEX)으로부터의 모든 용출의 흡광도 판독값은 LVis 플레이트(BMG)에 의해 측정되었다. 판독값은 용출의 해당 NaCl 농도에 대해 플롯됩니다. 가장 높은 단백질 농도를 가진 피크는 700 mM NaCl에서 보입니다. (B)에 제시된 IEX 염용출의 SDS-PAGE분석(A). 분자량 마커는 겔의 왼쪽에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: MCPA 시스템을 통해 IEX를 사용하여 VJM2 풀 (포스트 Ni-NTA)의 정화.
(a)이온교환(IEX)으로부터 수집된 용출의 흡광도 판독값은 나노드롭을 이용하여 측정하였다. 판독값은 용출의 해당 NaCl 농도에 대해 플롯됩니다. (B)에 제시된 IEX 염용출의 SDS-PAGE분석(A). 분자량 마커는 겔의 왼쪽에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼 컴포지션 거부 | 네이티브 버퍼 컴포지션 | |
| 리시스 버퍼 | 10 mM NaH2PO4,10 mM Tris, 6 M GuHCl, 10 mM imidazole, pH 8.0 | 20mM Tris, 300mM NaCl, 10m imidazole, pH 8.0 |
| 세척 버퍼 | 10 mM NaH2PO4,10 mM Tris, 6 M GuHCl, 20 mM imidazole, pH 8.0 | 20mM 트라이스, 300mM 나Cl, 20m mm 이미다졸, pH 8.0 |
| 용출 버퍼 | 10mM NaH2PO4,10mM Tris, 6M GuHCl, 0.2 M 아세트산, pH 3.0 | 20mM Tris, 300mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 8.0 |
| 버퍼 컴포지션 | ||
| 높은 소금 | 5 mM 트리산, 5mM 트라이스 베이스, pH 8.1, 4 M NaCl | |
| 낮은 소금 | 5 mM 트리산, 5m 트리스 베이스, pH 8.1 |
표 1: 버퍼, Ni-NTA 데니및 네이티브 정제 및 이온 교환 저염 및 고염 버퍼의 구성.
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Discussion
이 방법은 상대적으로 경험이 부족한 단백질 생화학자에게 사용하기쉽고 견고하지만 몇 가지 고려 사항이 있습니다.
컬렉션 플레이트 과충전에 대한 주의 사항
48웰 컬렉션 플레이트 자체는 우물당 5mL에 불과하며 각 96웰은 2mL에 불과합니다. 우물을 과도하게 채울 위험이 있기 때문에 버퍼를 추가하고 열을 통해 샘플을 실행할 때 이 점을 염두에 두어야 합니다. 특히, 더 큰 샘플을 정제를 위해 크로마토그래피 컬럼으로 옮길 때 주의를 기울여야 한다. 과잉 상퍼가있는 경우, 부품으로 분할, 열을 채우기에 충분, 이는 샘플의 초과 및 손실을 방지하기 위해 다음 부분을 추가하기 전에 통해 실행할 수 있어야합니다. 상체의 각 추가 후, 컬럼은 펌프를 켜기 전에 구슬에 결합하는 단백질의 가능성을 높이기 위해 작은 플라스틱 루프와 혼합되어야합니다. 플레이트의 방향과 따라서 우물의 내용을 추적하려면 맞춤화를 시작하기 전에 라벨이 부착된 모서리 'A1'이 항상 플레이트왼쪽 상단에 있는지 확인합니다.
용출 단백질
IEX 및 선호도 단계에서 용출할 때 진공은 가장 낮은 설정에서 열을 통해 용출 버퍼를 당기기 위해 사용됩니다. 이것은 단백질 농도가 높은 경우에, 거품과 잠재적으로 변성하는 단백질 용액으로 이끌어 낼 수 있더라도 중력에 비해 유량을 가속화합니다. 이 경우, 대안은 열을 통해 버퍼를 밀어 열려있는 열 의 상단에 주사기 플런저를 사용하는 것입니다. 이 경우 주사기 플런저는 부드럽게(강제로) 컬럼으로 밀어 액체를 통해 아래 수집 판으로 밀어야 합니다. MCPA에 남아있는 용출 방울이 이웃 우물로 흘러 들어가지 않도록 수집 판을 제거하여 오염을 유발할 때 주의해야 합니다.
수지 및 기둥 의 유지 보수
이 프로토콜의 중요한 단계는 Ni 수지 및 컬럼의 재생입니다. 열은 정화 프로토콜의 시작 또는 끝에서 재생되어야 합니다. 마지막에 재생이 발생하면 수지는 4°C에서 20% 에탄올에 보관해야 한다. 크로마토그래피 컬럼 필터는 "차단"되어 샘플이 컬럼을 통과하는 속도가 예상보다 훨씬 느려질 수 있습니다. 이 경우 열을 교체하거나 필터를 제거하여 밤새 버퍼를 제거하고 물로 헹구어야 합니다.
3단계에서 입증된 바와 같이, MCPA 기기의 다양성은 단일 시료로서 다중 단백질의 정제를 위해 효과적으로 활용될 수 있다. 이온 교환 프로토콜은 실험의 요구에 맞게 조정할 수 있으며, 사용되는 다른 샘플수와 소금 농도수에 적응할 수 있다. 예를 들어 12개 미만의 샘플이 동시에 정제되면 동일한 플레이트 내에서 각 용출 후 컬럼을 이동하거나 각 용출에 대한 수집 플레이트를 교환하는 모든 조합이 포함됩니다. 예를 들어, 4개의 단백질만이 병렬로 정제되는 경우, 열을 하나의 수집 판을 가로질러 플레이트를 변경하기 전에 최대 4개의 염 농도의 elutions를 수집할 수 있다. MCPA는 다양한 수지-친화성 및 이온 교환이 이미 논의되었지만 소수성 상호 작용 크로마토그래피도 가능하고 면역반응성크로마토그래피(12)에대한 추가 가능성이 있다. 이 방법은 여러 소규모 정화에 초점을 맞추고 있지만, MCPA는 샘플 펌프 또는 고가의 FPLC없이 세균 문화의 여러 리터에서 정제하기 위한 단일 대형 크로마토그래피 컬럼에 사용할 수 있습니다.
MCPA를 사용하여 처리량이 높은 이온 교환을 위해 논의된 바와 같이 최대 24개의 별도의 수집 플레이트가 필요합니다. 이것은 비실용적 일 수 있고 표준 실험실 벤치 상단에 많은 공간을 요구하고 인적 오류의 위험을 증가. 더욱이, 24개의 상이한 견본에서 elutions의 단백질 흡수를 측정하는 것은 어려울 지도 모릅니다. 이 상황에서 멀티 채널 파이펫이 도움이 될 것이며 여러 샘플을 빠르고 쉽게 전송할 수 있습니다. 소량의 경우, 브래드포드 분석 시약을 사용하지 않고도 농도를 직접 측정할 수 있으므로 16 마이크로드롭을 함유한 LVis 플레이트(BMG)를 사용하는 것이 좋습니다.
진공 펌프를 사용하면 중력10을사용하여 달성되는 것보다 3배 더 빠른 정화 속도를 허용하지만 수지의 무결성을 손상시키지 않으면서 다른 문제를 일으킵니다. 예를 들어, 정화 시 진공의 강도를 유지하려면 수지로 포장된 컬럼을 삽입하기 전에 꺼내야 하는 10mL 주사기 플런저로 모든 컬럼을 막아야 합니다. 플런더를 하나씩 꺼내는 것도 적시에 공정하며 진공의 저항으로 인해 열에서 제거하기가 어려울 수 있습니다.
MCPA를 이용한 다중 단백질 IEX 정제의 세부 사항은 프로토콜에 부여된다. 이러한 높은 처리량 방법은 시간 효율적이고 제어가능하며, 각 정화에 대한 모든 파라미터는 사용자가 조작할 수 있다. 그러나, 산업을 포함한 대부분의 단백질 생화학 실험실에서, 빠른 단백질 액체 크로마토그래피는 처리량, 재현성 및 방법 전달 및 견고성 면에서 우수단백질 정제의 바람직한 방법입니다. 단백질 바이오솔루션에 의한 단백질 메이커 및 AKTA FPLC 생체 분자 정제 시스템과 같은 이러한 시스템은 큰 성공을 통해 정제 병목 현상 문제를 완화할 수 있다. 이러한 시스템에도 불구하고 우수한 결과를 얻었음에도 불구하고 MCPA 시스템을 사용하여 보는 분리는 여전히 고순도 단백질을 얻을 수 있을 만큼 좋습니다. 흥미롭게도, 우리의 실험실은 또한 AKTA 시작 FPLC를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 해상도가이 기계와 함께 할 수있는 선형 그라데이션으로 더 높을 수 있지만, 그것은 특히 여러 샘플을 실행하는 데 시간이 더 많이 소요되고이 시스템에 경험이없는 학생을 훈련하는 것이 훨씬 더 도전이다.
다른 상당히 저렴 한 판 기반 정화 대안 존재. 예를 들어 GE 헬스케어 생명 과학(현 시티바)과 시그마 알드리치는 사전 포장된 96개의 잘 포장된 필터 플레이트와 카트리지를 특정 정화 수지와 함께 판매합니다. 이 필터 플레이트는 작은 규모의 고처리량 정제를 제공하지만 마이크로그램 수율 범위에서만 정화됩니다. 또한 QIAGEN의 QIAvac 24 Plus는 진공 상태에서 스핀 컬럼을 사용하지만, 흐름을 통해 또는 세차하는 것은 실용적이지 않습니다.
MCPA의 유연한 설계는 병렬 단백질 정제를 허용하지만 MCPA 방법을 사용하여 수동으로 움직이는 컬럼과 플레이트는 표준 FPLC 시스템에 비해 인간의 오류를 잠재적으로 증가시킬 수 있습니다. 그러나 샘플을 컬럼에 수동으로 적재하는 것은 보다 광범위한 교육이 필요한 밸브와 펌프를 스위칭하는 경우가 있으므로 실수를 보다 쉽게 할 수 있는 표준 FPLC를 사용하여 컬럼에 샘플을 적재하는 것보다 경험이 부족한 사용자에게 더 신뢰할 수 있습니다. 단백질 정화를 위한 완전 자동화 된 시스템은 일상적으로 정화에 작동하는 산업 및 학술 실험실의 정화 그룹에 대한 MCPA보다 더 적합하다는 것이 분명합니다. 그러나, 비싼 장비와 유지 보수를 감당할 수 없고 광범위한 훈련을 피하고 싶어하거나 때때로 단백질 정화에 작동하려는 작은 실험실의 경우 MCPA는 여전히 좋은 분리를 얻고 저렴하고 쉽게 설정할 수있는 효과적인 대체 시스템을 제공합니다.
MCPA는 간단하고 저렴한 계측기로 구성되어 있으며, 여러 컬럼이 동시 병렬 정제를 위해 인터페이스되어 밀리그램 양의 단백질을 생산할 수 있습니다. 또한 이 기술을 사용하면 개별 컬럼의 모듈화로 처리량을 증가시수 있습니다. 이것은이 방법에 고유하고 현재 플레이트 기반 정화 키트를 사용하여 달성 할 수 없습니다.
단백질 정제는 단백질의 연구 와 특성화 및 치료 의 발달에 필수적으로 남아 있을 것입니다. NMR 및 단백질 결정학과 같은 생물 물리학 기술은 순수 단백질의 밀리그램 양에 의존하므로 현재 발현 및 정제 시스템은 이2,13,14를달성하는 데 드는 비용과 시간을 개선하기 위해 추가개발이 필요하다. 설명한 바와 같이 자동화된 정화 시스템은 자동화되지 않은 방법에 비해 많은 이점이 있지만 고가의 계측 및 교육이 필요한 소규모 실험실에서는 비용이 너무 많이 듭니다. MCPA의 시작 비용으로 상당히 저렴 $4510. 또한 이 MCPA는 광범위한 교육이나 지속적인 유지 관리가 필요하지 않으며 문제가 발생하면 쉽게 해결할 수 있습니다. Ni-NTA에 사용되는 데마징 버퍼와 같은 부식성 버퍼는 제대로 세척되지 않으면 정화 시스템을 부식시킬 수 있습니다. 그러나 MCPA의 유연한 설계를 통해 필요한 경우 구획을 신속하게 청소, 수리 및 변경할 수 있습니다. 결론적으로, MCPA는 더 저렴한 자동화 시스템이10개설치될 때까지 더 작은 실험실을 위한 효과적이고 높은 처리량 단백질 정제를 용이하게 할 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 간행물에서 보고된 연구는 보조금 번호 P20GM103451및 리버풀 대학에서 내부 연구 교부금의 국립 의학 과학의 국립 학회에서 기관 개발 상 (IDeA)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
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