Method Article

Drei- und vierdimensionale Visualisierungs- und Analyseansätze zur Untersuchung der axialen Dehnung und Segmentierung von Wirbeltieren

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir Berechnungswerkzeuge und -methoden, die die Visualisierung und Analyse von drei- und vierdimensionalen Bilddaten von Mausembryonen im Rahmen der axialen Dehnung und Segmentierung ermöglichen, die durch optische In-toto-Projektionstomographie und durch Live-Bildgebung und Ganzkörper-Immunfluoreszenzfärbung mittels Multiphotonenmikroskopie erhalten werden.

Abstract

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Die Somitogenese ist ein Kennzeichen der embryonalen Entwicklung von Wirbeltieren. Seit Jahren untersuchen Forscher diesen Prozess in einer Vielzahl von Organismen mit einer breiten Palette von Techniken, die Ex-vivo- und In-vitro-Ansätze umfassen. Die meisten Studien stützen sich jedoch immer noch auf die Analyse zweidimensionaler (2D) Bilddaten, was die ordnungsgemäße Bewertung eines Entwicklungsprozesses wie axiale Ausdehnung und Somitogenese mit hochdynamischen Wechselwirkungen in einem komplexen 3D-Raum einschränkt. Hier beschreiben wir Techniken, die die Live-Bildgebung der Maus, die Datensatzverarbeitung, die Visualisierung und die Analyse in 3D und 4D ermöglichen, um die Zellen (z. B. neuromesodermale Vorläufer) zu untersuchen, die an diesen Entwicklungsprozessen beteiligt sind. Wir bieten auch ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die optische Projektionstomographie und die gesamte Immunfluoreszenzmikroskopie in Mausembryonen (von der Probenvorbereitung bis zur Bildaufnahme) und zeigen eine Pipeline, die wir entwickelt haben, um 3D-Bilddaten zu verarbeiten und zu visualisieren. Wir erweitern den Einsatz einiger dieser Techniken und heben spezifische Merkmale verschiedener verfügbarer Software (z. B. Fidschi / ImageJ, Drishti, Amira und Imaris) hervor, die verwendet werden können, um unser derzeitiges Verständnis von axialer Ausdehnung und Somitbildung (z. B. 3D-Rekonstruktionen) zu verbessern. Insgesamt betonen die hier beschriebenen Techniken die Bedeutung der 3D-Datenvisualisierung und -analyse in der Entwicklungsbiologie und könnten anderen Forschern helfen, 3D- und 4D-Bilddaten im Zusammenhang mit der axialen Ausdehnung und Segmentierung von Wirbeltieren besser zu adressieren. Schließlich verwendet die Arbeit auch neuartige Werkzeuge, um die embryonale Entwicklung von Wirbeltieren zu erleichtern.

Introduction

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Die Bildung von Wirbelkörperachsen ist ein hochkomplexer und dynamischer Prozess, der während der Embryonalentwicklung stattfindet. Am Ende der Gastrulation [in der Maus, um den Embryonaltag (E) 8.0] wird eine Gruppe von Epiblast-Vorläuferzellen, die als neuromesodermale Vorläuferzellen (NMPs) bekannt sind, zu einem Schlüsseltreiber der axialen Ausdehnung in einer Kopf-zu-Schwanz-Sequenz und erzeugt das Neuralrohr und das paraxiale mesodermale Gewebe während der Hals-, Rumpf- und Schwanzbildung 1,2,3,4 . Interessanterweise scheint die Posit....

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Protocol

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Tierversuche folgten den portugiesischen (Portaria 1005/92) und europäischen (Richtlinie 2010/63/EU) Rechtsvorschriften über Unterkunft, Haltung und Wohlfahrt. Das Projekt wurde von der Ethikkommission des "Instituto Gulbenkian de Ciência" und von der portugiesischen Nationalstelle "Direcção Geral de Alimentação e Veterinária" (Lizenzreferenz: 014308) geprüft und genehmigt.

1. Probenvorbereitung für 3D- und 4D-Bildgebung

HINWEIS: Hier finden Sie eine detaillierte Beschreibung zur Sezierung und Vorbereitung von Mausembryonen E8.25 bis E10.5 für die Live-Bildgebung (1.1), E7.5- bis E11.5-Embryonen für die Ganzkörper-....

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Results

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Die repräsentativen Ergebnisse, die in diesem Artikel sowohl für die Live- als auch für die Immunfluoreszenzbildgebung gezeigt werden, wurden unter Verwendung eines Zwei-Photonen-Systems mit einem 20 × 1,0 NA-Wasserobjektiv, dem auf 960 nm abgestimmten Anregungslaser und GaAsP-Photodetektoren (wie in Dias et al. (2020) 43 beschrieben. Die optische Projektionstomographie wurde mit einem speziell angefertigten OPenT-Scanner durchgeführt (wie in Gualda et al. (2013)28 beschrie.......

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Discussion

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Axiale Dehnung und Segmentierung sind zwei der komplexesten und dynamischsten Prozesse, die während der embryonalen Entwicklung von Wirbeltieren auftreten. Die Verwendung von 3D- und 4D-Bildgebung mit Einzelzellverfolgung wird seit einiger Zeit angewendet, um diese Prozesse sowohl bei Zebrafischen als auch bei Hühnerembryonen zu untersuchen, für die Zugänglichkeit und Kulturbedingungen eine komplexe Bildgebung ermöglichen 19,44,45,46,47,48,49

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Disclosures

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Wir danken Olivier Pourquié und Alexander Aulehla für den LuVeLu-Reporterstamm, dem SunJin-Labor für das RapiClear-Testmuster, Hugo Pereira für die Hilfe bei der Verwendung von BigStitcher, Nuno Granjeiro für die Hilfe bei der Einrichtung des Live-Imaging-Apparates, der IGC-Tieranlage und ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Mallo-Labors für nützliche Kommentare und Unterstützung während dieser Arbeit.

Wir danken der technischen Unterstützung der Advanced Imaging Facility der IGC, die durch portugiesische Mittel unterstützt wird ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 und ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, kofinanziert durch das Lisboa Regio....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose niedrige GeliertemperaturSigmaA9414Wird zur Einbettung von Embryonen verwendet (z. B. für OPT)
Amira-SoftwareThermofisher-CommerialSoftware-Tool
Anti-Brachyury (Ziege polyklonal)R and D SystemsAF2085 RRID:AB_2200235Für Immunfluoreszenz
Anti-Sox2 (Kaninchen monoklonal)Abcamab92494 RRID:AB_10585428Für Immunfluoreszenz
Anti-Tbx6 (Ziege polyklonal)R and D SystemsAF4744 RRID:AB_2200834Für Immunfluoreszenz
Anti-Laminin111 (Kaninchen polyklonal)SigmaL9393 RRID:AB_477163Für Immunfluoreszenz
Anti-Ziege 488 (Esel polyklonal)Molekulare SondenA11055 RRID:AB_2534102Für Immunfluoreszenz
Anti-Kaninchen 568 (Esel polyklonal)ThermoFisher   ScientificA10042 RRID:AB_2534017Für Immunfluoreszenz
Benzylalkohol (99+%)(beliebig)-Zur Reinigung von Embryonen (Bestandteil von BABB)
Benzylbenzoat (99+%)(beliebig)-Zur Reinigung von Embryonen (Bestandteil von BABB)
RinderserumalbuminBiowestP6154Für Immunfluoreszenz
Deckglas 20x20 mm #0beliebig)-100um dickes
Deckglas 20x20 mm #(beliebig)-170um dickes
Deckglas 20x60 mm #1,5(beliebig)-Zur Verwendung als " Folien"
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid)Life TechnologiesD3571Für Immunfluoreszenz
Drishti-Software(Open Source)-Freies Software-Tool
EDTASigmaED2SSFür die Demineralisierung
Fiji/ImageJ Software(Open Source)-Freies Software-Tool
GlycineNZYtechMB01401Für Immunfluoreszenz
Huygens-SoftwareScientific Volume Imaging-CommerialSoftware-Tool
HyClone definiertes fötales RinderserumGE Healthcare#HYCLSH30070.03Für Live-Bildgebung
Wasserstoffperoxidlösung 30 %Milipore1085971000Für das Clearing
Imaris SoftwareBitplane / Oxford Instrumente-Kommerzielles Software-Tool
iSpacersSunJin Lab(varies)Verwendung als Spacer für Präparate
L-GlutaminGibco#25030– 024Für Medium für die Lebendbildgebung
DMEM mit niedrigem GlukosegehaltGibco11054020Für Medium für die Lebendbildgebung
M2 mediumSigmaM7167Zum Präparieren von Embryonen
MethanolVWRVWRC20847.307Für Dehydratisierungs- und Rehydratisierungsschritte
MethylsalicylatSigmaM6752Zur Reinigung von Embryonen
ParaformaldehydSigmaP6148Zur Verwendung in Lösung zur Fixierung von Embryonen
Penicillin-StreptomycinSigma#P0781Für das Live-Imaging-Medium
PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)BiowestL0615-500-RapiClear
SunJin LaboratoryRapiClear 1.52Zur Reinigung von Embryonen
Secure-Sea HybridisierungskammernSigmaC5474Verwendung als Spacer für Vorbereitungen
simLab SoftwareSimLabsoft-Commerial Software-Tool
Objektträger, Vertiefung konkaves Glas - 75x25 mm(beliebig)-Zum Einbetten dicker Embryonen.
Triton X-100SigmaT8787Für Immunfluoreszenz
(1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

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Vertebrate SomitogenesisAxial Elongation3D Visualization4D ImagingMouse EmbryosOptical Projection TomographyWhole Mount ImmunofluorescenceNeuromesodermal ProgenitorsTissue Clearing3D Reconstruction

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