Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

Summary

Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.

Abstract

Die richtige Entwicklung des Säugetiergehirns beruht auf einem feinen Gleichgewicht der proliferation neuronaler Stammzellen und der Differenzierung in verschiedene neuronale Zelltypen. Dieses Gleichgewicht wird streng durch genexpression kontrolliert, die auf mehreren Ebenen fein abgestimmt ist, einschließlich Transkription, Posttranskription und Übersetzung. In dieser Hinsicht unterstreicht eine wachsende Zahl von Beweisen eine entscheidende Rolle der translationalen Regulierung bei der Koordinierung von Entscheidungen über das Schicksal neuronaler Stammzellen. Polysome Fractionation ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Beurteilung des mRNA-Translationalstatus sowohl auf globaler als auch auf individueller Genebene. Hier stellen wir eine hauseigene Polysomen-Profiling-Pipeline vor, um die Translationseffizienz in Zellen aus der sich entwickelnden Mausgroßrinde zu bewerten. Wir beschreiben die Protokolle zur Saccharosegradientenvorbereitung, Gewebelyse, Ultrazentrifugation und Fraktionierungs-basierte Analyse des mRNA-Translationalstatus.

Introduction

Während der Entwicklung des Säugetierhirns vermehren sich neuronale Stammzellen und differenzieren sich, um Neuronen und Glia^1,2 zu erzeugen. Die Störung dieses Prozesses kann zu Veränderungen in der Gehirnstruktur und -funktion führen, wie in vielen neuroentwicklungsbedingten Störungen^{gesehen 3,4}. Das richtige Verhalten neuronaler Stammzellen erfordert die orchestrierte Expression spezifischer Gene⁵. Während die epigenetische und transkriptionelle Kontrolle dieser Gene intensiv untersucht wurde, deuten jüngste Ergebnisse darauf....

Protocol

Der gesamte Gebrauch von Tieren wurde vom Animal Care Committee der University of Calgary überwacht. CD1-Mäuse, die für das Experiment verwendet wurden, wurden von kommerziellen Anbietern gekauft.

1. Vorbereitung von Lösungen

HINWEIS Um den ABBAU der RNA zu verhindern, sprühen Sie die Werkbank und alle Geräte mit RNase-Dekontaminationslösung. Für das Experiment werden RNase-freie Spitzen verwendet. Alle Lösungen werden in RNase-freiem Wasser vorbereitet.

1. Cycloheximid-Stammlösung (100 mg/ml) in DMSO vorbereiten und bei -20 °C lagern.
2. 2,2 M Saccharose-Stammlösung vorbereiten, indem 75,3 g Saccha....

Results

Als Demonstration wurde das kortikale Lysat, das 75 g RNA (gepoolt aus 8 Embryonen) enthält, durch den Saccharosegradienten in 12 Fraktionen getrennt. Spitzen der UV-Absorption bei 254 nm identifizierten Fraktionen, die die 40S-Untereinheit, 60S-Untereinheit, 80S-Monosomen und Polysomen enthalten (Abbildung 4A). Die Analyse der Fraktionen nach Western Blot für die große ribosomale Untereinheit randalierte Rpl10 in der 60S-Untereinheit (Fraktion 3), Monosomen (Fraktion 4) und Polysomen (Frakt.......

Discussion

Polysome Profiling ist eine häufig verwendete und leistungsfähige Technik, um den Translationsstatus sowohl auf einzelnen Gen- als auch auf genomweiten Ebenen¹⁴ zu bewerten. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll der Polysomenprofilierung mit einer selbst zusammengesetzten Plattform und deren Anwendung zur Analyse des sich entwickelnden Mauskortex vor. Diese kostengünstige Plattform lässt sich einfach montieren und robuste, reproduzierbare Saccharosegradienten und Polysomenprofilierung mit ho.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL RNA-freie Mikroröhrchen	Axygen	MCT-150-C
10 cm Schale	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G Nadel	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL Spritze	BD	302832
stumpfes Ende Nadel	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromophenol blau	Sigma	115-39-9
CD1 Maus		Charles River Laboratory
Pinzette mit gebogener Spitze	Sigma	#Z168785
Cycloheximid		Sigma	66-81-9
Software zur Datenerfassung TracerDAQ	Measurement Computing
Digitaler Konverter		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 Pinzette	Sigma	#F6521
Fraktionssammler	Bio-Rad	Modell 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Lineartischantrieb	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luziferase-Kontrolle RNA	Promega	L4561
Maxima Erststrang-cDNA-Synthesekit	Themo Fisher	M1681
Miniatur-V-Klemme	Thorlabs	VH1/M
Steckbrett der Mini-Serie	Thorlabs	MSB7515/M
Optischer Pfosten der Mini-Serie	Thorlabs	MS2R/M
Mini-Serie Sockel-Pfostenhalter Basis	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasale Medien	Gibco	21103-049
& Oslash; 12,7 mm Aluminiumpfosten	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR grün fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Rechtwinklige Klemme	Thorlabs	RA90/M
Rechtwinklig & Oslash; 1/2" bis Ø 6 mm Pfostenklemme	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
RNase freie Spitzen	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase freies Wasser	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Schlanke rechtwinklige Halterung	Thorlabs	AB90B/M
Kleine V-Klemme	Thorlabs	VC1/M
Natriumdesoxycholat	Sigma	302-95-4
Schrittmotortreiber	SongHe	TB6600
Saccharose	Bioshop	57501
SW 41 Ti Rotor	Beckman Coulter	331362
Spritzenpumpe	Harvard Apparatus	70-4500
Spritzenpumpe	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Schlauchstecher	Brandel	BR-184
Ultrazentrifuge		Beckman Coulter	L8-70M
Ultrazentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7,5	Invitrogen	15567-027
UNO Projekt Super Starter Kit	Elegoo	EL-KIT-003
UV-Monitor	Bio-Rad	EM-1 Econo
Vertikale Halterung	Thorlabs	VB01A/M