Method Article

Effiziente und skalierbare Generierung von humanen ventralen Mittelhirn-Astrozyten aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

DOI:

10.3791/62095

⸱

October 2nd, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur reproduzierbaren Generierung von ventralen Mittelhirn-gemusterten Astrozyten aus hiPSCs und Protokolle für deren Charakterisierung vor, um den Phänotyp und die Funktion zu beurteilen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bei der Parkinson-Krankheit verursachen eine fortschreitende Dysfunktion und Degeneration von Dopamin-Neuronen im ventralen Mittelhirn lebensverändernde Symptome. Neuronale Degeneration hat bei Parkinson verschiedene Ursachen, darunter nicht-zellautonome Mechanismen, die durch Astrozyten vermittelt werden. Im gesamten ZNS sind Astrozyten für das Überleben und die Funktion der Neuronen unerlässlich, da sie die metabolische Homöostase in der neuronalen Umgebung aufrechterhalten. Astrozyten interagieren mit den Immunzellen des ZNS, den Mikroglia, um die Neuroinflammation zu modulieren, die seit den frühesten Stadien der Parkinson-Krankheit beobachtet wird und einen direkten Einfluss auf das Fortschreiten ihrer Pathologie hat. Bei Krankheiten mit einem chronischen neuroinflammatorischen Element, einschließlich Parkinson, erhalten Astrozyten einen neurotoxischen Phänotyp und verstärken so die Neurodegeneration. Folglich sind Astrozyten ein potenzielles therapeutisches Ziel, um die Krankheit zu verlangsamen oder zu stoppen, aber dies erfordert ein tieferes Verständnis ihrer Eigenschaften und Rollen bei Parkinson. Genaue Modelle von humanen ventralen Mittelhirn-Astrozyten für In-vitro-Studien sind daher dringend erforderlich.

Wir haben ein Protokoll entwickelt, um hochreine Kulturen von ventralen Mittelhirn-spezifischen Astrozyten (vmAstros) aus hiPSCs zu erzeugen, die für die Parkinson-Forschung verwendet werden können. vmAstros können routinemäßig aus mehreren hiPSC-Linien hergestellt werden und exprimieren spezifische astrozytäre und ventrale Mittelhirnmarker. Dieses Protokoll ist skalierbar und eignet sich daher für Hochdurchsatzanwendungen, einschließlich des Wirkstoffscreenings. Entscheidend ist, dass die hiPSC-abgeleiteten vmAstros immunmodulatorische Eigenschaften aufweisen, die für ihre in vivo-Gegenstücke typisch sind und mechanistische Untersuchungen der neuroinflammatorischen Signalübertragung bei Parkinson ermöglichen.

Introduction

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Die Parkinson-Krankheit betrifft 2 % bis 3 % der Menschen über 65 Jahre und ist damit die häufigste neurodegenerative Bewegungsstörung1. Sie wird durch eine Degeneration der ventralen Dopamin-Neuronen des Mittelhirns innerhalb der Substantia nigra verursacht, was zu schwächenden motorischen Symptomen sowie zu häufigen kognitiven und psychiatrischen Problemen führt2. Die Parkinson-Pathologie ist durch Aggregate des Proteins α-Synuclein gekennzeichnet, die für Neuronen toxisch sind und zu deren Funktionsstörung und Tod führen 1,2,3. Da die dopaminergen Neuronen die degenerierende Population bei Parkinson sind, standen sie historisch gesehen im Fokus der Forschung. Es ist jedoch offensichtlich, dass ein anderer Zelltyp im Gehirn, die Astrozyten, ebenfalls Anomalien bei Parkinson aufweisen und von denen angenommen wird, dass sie in Modellen von Parkinson zur Degeneration beitragen 4,5,6,7.

Astrozyten sind eine heterogene Zellpopulation, die sich je nach Bedarf sowohl physisch als auch funktionell verändern kann. Sie unterstützen die neuronale Funktion und Gesundheit über eine Vielzahl von Mechanismen, einschließlich der Modulation der neuronalen Signalgebung, der Gestaltung der synaptischen Architektur und der trophischen Unterstützung neuronaler Populationen durch die Sekretion spezifischer Faktoren 6,8,9,10. Astrozyten spielen jedoch auch eine wesentliche immunmodulatorische Rolle, die für die Entwicklung und Ausbreitung von Neuroinflammation wesentlich ist10,11. Neuroinflammation wird im Gehirn von Parkinson-Patienten beobachtet und es wurde kürzlich gezeigt, dass sie das Auftreten von Parkinson-Symptomen verhindert 12,13,14,15 und damit in den Mittelpunkt der Parkinson-Forschung rückt.

Auf zellulärer Ebene wird gesagt, dass Astrozyten als Reaktion auf Verletzungen, Infektionen oder Krankheiten reaktiv werden, um die Neuroprotektion zu erleichtern 9,6,10,16. Die Reaktivität beschreibt eine Verschiebung des Astrozyten-Phänotyps, die durch Veränderungen der Genexpression, des Sekretoms, der Morphologie und der Mechanismen der Beseitigung von Zelltrümmern und toxischen Nebenprodukten gekennzeichnetist 9,10,11,17. Diese reaktive Verschiebung erfolgt als Reaktion auf induktive Signale von Mikroglia, den Immunzellen des ZNS und den Ersthelfern bei Verletzungen und Krankheiten9. Sowohl Astrozyten als auch Mikroglia reagieren auf Entzündungssignale, indem sie ihre eigene Funktion moderieren und können Entzündungssignale weiterleiten und so die Neuroinflammation direkt beeinflussen 9,10. Die chronische Natur der Parkinson-Krankheit führt jedoch zu einem Übergang, bei dem reaktive Astrozyten für Neuronen toxisch werden und selbst Degeneration und Krankheitspathologie fördern 6,9,10,18,19. Bezeichnenderweise wurde kürzlich gezeigt, dass die Blockierung der Transformation von Astrozyten in den reaktiven neurotoxischen Phänotyp das Fortschreiten von Parkinson in Tiermodellen verhindert11. Die Astrozytenreaktivität im Paradigma der Neuroinflammation ist daher zu einem Hauptschwerpunkt der Parkinson-Forschung geworden und bezieht sich in ähnlicher Weise auf ein breites Spektrum von Erkrankungen des ZNS. Zusammengenommen ergeben diese Ergebnisse ein Bild einer signifikanten astrozytären Beteiligung an der Ätiologie von Parkinson und unterstreichen die Notwendigkeit genauer Forschungsmodelle, die den Phänotyp der menschlichen Astrozytenpopulationen, die an Parkinson beteiligt sind, rekapitulieren.

Im embryonalen Gehirn treten zuerst Neuronen auf, wobei die astrogliale Linie, nämlich die Astrozyten und Oligodendrozyten, später in der Entwicklung auftreten6. In-vivo- und In-vitro-Studien haben eine Reihe von Signalwegen aufgezeigt, die die Potenz von neuralen Vorläuferzellen von neuronalen zu astroglialen Derivaten zu steuern scheinen. Insbesondere die JAK/STAT-, EGF- und BMP-Signalgebung spielen eine Rolle bei der Proliferation, Differenzierung und Reifung von Astroglia20,21. Diese Signalwege standen im Mittelpunkt von In-vitro-Protokollen zur Erzeugung von Astrozyten aus pluripotenten Zellen, einschließlich hiPSC 6,22,23. Es gibt viele erfolgreiche Beispiele für die Erzeugung von Astrozyten aus hiPSCs 6,24,25. Es ist jedoch offensichtlich, dass In-vivo-Astrozyten im ZNS spezifische regionale Identitäten besitzen, die sich direkt auf ihre Funktion beziehen, in Übereinstimmung mit den spezifischen Anforderungen dieser Astrozyten in Bezug auf ihre spezialisierten neuronalen Nachbarn 17,24,25,26. Zum Beispiel wurde speziell in Bezug auf das ventrale Mittelhirn gezeigt, dass Astrozyten in dieser Region spezifische Sätze von Proteinen exprimieren, einschließlich Rezeptoren für Dopamin, die die Kommunikation mit der lokalen Population von Dopamin-Neuronen im Mittelhirn ermöglichen26. Darüber hinaus weisen ventrale Mittelhirn-Astrozyten einzigartige Signaleigenschaftenauf 26. Um die Rolle der ventralen Mittelhirn-Astrozyten bei Parkinson zu untersuchen, benötigen wir daher ein In-vitro-Modell, das ihre einzigartigen Eigenschaften widerspiegelt.

Um dieses Problem zu lösen, haben wir ein Protokoll zur Generierung von ventralen Mittelhirn-Astrozyten (vmAstros) aus hiPSCs entwickelt. Die resultierenden vmAstros weisen Merkmale ihrer in vivo ventralen Gegenstücke im Mittelhirn auf, wie z. B. die Expression spezifischer Proteine sowie immunmodulatorische Funktionen. Die vorgestellten Ergebnisse stammen aus der Differenzierung der NAS2 und AST23 hiPSC-Linien, die von Dr. Tilo Kunath27 abgeleitet und uns geschenkt wurden. NAS2 wurde von einem gesunden Kontrollsubjekt erzeugt, während AST23 von einem Parkinson-Patienten stammt, der eine Triplikation im Locus trägt, der für α-Synuclein (SNCA) kodiert. Diese hiPS-Linien wurden bereits in einer Reihe von veröffentlichten Forschungsarbeiten charakterisiert und verwendet, unter anderem für die Erzeugung verschiedener neuronaler Zelltypen 27,28,29,30,31.

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Protocol

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1. Auftauen, Wartung und Kryokonservierung der humanen hiPS-Linie

  1. Zum Beschichten von hiPSC-Kulturplatten ist Vitronektin auf 5 μg/ml (1:100) in PBS bei 1 ml pro 10 cm Oberfläche auf2 Zellkulturplatten zu verdünnen. 1 h bei Raumtemperatur ziehen lassen.
  2. Entfernen Sie Vitronektin und fahren Sie sofort mit der Zugabe von hiPSCs/Medien zur Kulturplatte fort.
    HINWEIS Bei der Entnahme von Vitronektin von der Platte ist es entscheidend, dass die Kulturoberfläche nicht austrocknet.
  3. Zum Auftauen von hiPS-Zellen Kryoröhrchen mit hiPS-Zellen aus flüssigem Stickstoff entfernen und in ein 37 °C warmes Wasserbad stellen, bis der Inhalt vollständig aufgetaut ist.
  4. Bereiten Sie 9 ml vorgewärmtes Zellkulturmedium (z. B. E8 oder E8 Flex) vor, das 1x Zellzusatz (z. B. Revitacell) enthält. Geben Sie 1 ml tropfenweise zum Inhalt des Kryofläschchens. Geben Sie die restlichen 8 mL Medien in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen und fügen Sie dem verdünnten Inhalt des Kryofläschchens hinzu.
    ACHTUNG: Verreiben Sie den Inhalt nicht.
  5. Bei 150 x g 3 min zentrifugieren. Die Flüssigkeit wird aspiriert, ohne das Zellpellet zu stören, und in einem geeigneten Volumen des Zellkulturmediums (z. B. E8 oder E8 Flex) resuspendiert, das 1x Zellzusatz (z. B. Revitacell) enthält. Zum Beispiel 2 mL pro Well einer 6-Well-Platte.
  6. Resuspendierte hiPS-Zellen in mit vitronektin beschichtete Schalen geben und in einen 37 °C/5 % CO2 -Inkubator stellen.
    HINWEIS: hiPSCs sollten innerhalb von 30 min-2 h nach dem Auftauen beginnen, sich an vitronektinbeschichtete Kunststoffe zu heften.
  7. Bewahren Sie hiPSCs in Zellkulturmedium (z. B. E8 oder E8 Flex) auf. Füttern Sie die Zellen täglich durch Medienaustausch. Nährmedien vor der Fütterung immer 30 Minuten vorwärmen.
    HINWEIS Bei Verwendung von E8 Flex ist bei hiPSCs kein Medienwechsel alle 24 Stunden erforderlich, und die Zuführschritte können bei Bedarf auf 48 Stunden verlängert werden. Entweder E8 Flex- oder E8-Medien liefern gleich hochwertige hiPSC-Kulturen. HiPSCs sollten mindestens 14 Tage nach dem Auftauen und vor Beginn der Differenzierungsschritte kultiviert werden. Kulturperioden von weniger als 14 Tagen scheinen sich negativ auf das Überleben der hiPSCs während der anfänglichen Differenzierungsphase auszuwirken. Passage hiPSCs bei etwa 80% Konfluenz (Abbildung 1A: 3-4-tägiges Passagenintervall).
  8. 1 h vor Beginn 1x Zellergänzungsmittel (z.B. Revitacell) in die hiPSC-Kultur geben.
  9. Waschen Sie die hiPS-Zellen einmal mit PBS (ohne Calcium oder Magnesium) und fügen Sie 0,5 mM EDTA hinzu (verdünnt aus dem Vorrat in PBS ohne Calcium oder Magnesium).
  10. Inkubieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur oder bis sich die hiPSCs voneinander zu lösen beginnen und ein runder Aussehen annehmen, wobei die Grenzen jedes iPSCs unter einem Hellfeldmikroskop heller erscheinen.
  11. Geben Sie mit einer Pipette 200 μl EDTA auf einen fokussierten Bereich der hiPSCs. Wenn sie sich leicht ablösen und einen freien Platz in der Zellschicht schaffen, sind sie bereit für die Ernte. Wenn sie sich nicht leicht ablösen, lassen Sie es in EDTA und wiederholen Sie den Vorgang nach 1 Minute.
  12. Wenn Sie fortfahren möchten, entfernen Sie vorsichtig EDTA und waschen Sie die hiPS-Zellen mit einer Pipette vorsichtig zweimal mit Zellkulturmedium (z. B. E8 oder E8 Flex).
    HINWEIS: Um dies zu erreichen, ohne dass sich die hiPS-Zellen lösen, kippen Sie die Platte und geben Sie das Medium tropfenweise an der Seite der Kulturplatte hinunter.
  13. Zur Entnahme von hiPSCs verwenden Sie 1 ml Zellkulturmedium (z. B. E8 oder E8 Flex), das 1x Zellzusatz (z. B. Revitacell) enthält. Geben Sie das Medium direkt auf die hiPSC-Schicht ab und die Zellen sollten sich ablösen. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf mit einem weiteren 1-ml-Medium.
  14. Betrachten Sie die hiPSCs unter dem Mikroskop. Im Idealfall sollten hiPS-Zellen in relativ einheitlichen Clustern auftreten, wie in Abbildung 1B gezeigt. Wenn hiPSC-Cluster viel größer oder sehr unterschiedlich groß sind, verwenden Sie die Pipette, um die größeren hiPSC-Cluster aufzubrechen (Abbildung 1B).
    HINWEIS HiPSCs nicht zu stark trituieren. Obwohl das Präparat das Gesamtüberleben der Zellen erhöht, wirkt sich eine übermäßige Verreibung negativ auf das Überleben der hiPSC-Kultur aus. Empfohlen werden 1-4 Durchgänge mit einer Pipette.
  15. Die hiPSC-Suspension wird mit einer serologischen Pipette auf eine mit vitronektin beschichtete Platte übertragen, wie in Schritt 1.1 hergestellt. Setzen Sie die hiPSC-Kultur wieder in den 37 °C/5 % CO2 -Inkubator ein.
    HINWEIS: HiPS-Zellen werden bei einer Konfluenz von ca. 80 % kryokonserviert.
  16. 1 h vor Beginn 1x Zellergänzungsmittel (z.B. Revitacell) in die hiPSC-Kultur geben.
  17. Entfernen Sie hiPS-Zellen von Kulturplatten mit 0,5 mM EDTA, wie in Schritt 1.4 beschrieben, und sammeln Sie Zellen in Zellkulturmedium (z. B. E8 oder E8 Flex), das 1x Zellzusatz enthält (z. B. Revitacell). Bei 150 x g 3 min zentrifugieren.
  18. Resuspendieren Sie pelletierte hiPSCs in zellgefrierenden Medien (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie 700 μl pro 10 cm2 Kulturfläche, was 1 Kryofläschchen Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte entspricht.
  19. Füllen Sie Kryoröhrchen in ein geeignetes Zellgefriergefäß um (Einzelheiten siehe Materialtabelle).
  20. Stellen Sie das Gefriergefäß für 24 h in einen -80 °C Gefrierschrank. Nach 24 h können Kryofläschchen zur Langzeitlagerung auf flüssigen Stickstoff (-196 °C) umgefüllt werden.

2. vmAstro-Differenzierungsprotokoll

HINWEIS: Eine schematische Zusammenfassung des vmAstros-Differenzierungsprotokolls ist in Abbildung 1A dargestellt. Eine detaillierte Liste der für das Protokoll und deren Erstellung erforderlichen Reagenzien ist in Tabelle 1 enthalten.

  1. Einweisung von vmNPCs
    HINWEIS: Dieses Protokoll wurde so optimiert, dass es mit einem Minimum von 1x Wells einer 6-Well-Platte (10 cm2) von hiPSCs mit einer Konfluenz von 70 % bis 80 % beginnt, was ungefähr 4-5 x 104 Zellen/cm 2 entspricht (Abbildung 1B)30. Die Anzahl und Dichte der Ausgangszellen muss für jede hiPSC-Linie optimiert werden, da dies einen erheblichen Einfluss auf das Überleben und die Differenzierungseffizienz hat.
    1. Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus den hiPS-Zellen und waschen Sie es 3x in DMEM/F12 + Glutamax. Ersetzen Sie das Medium durch 2 mL vmNPC-Induktionsmedien (N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH(C24ii) + LDN193189. Siehe Tabelle 1 für Einzelheiten zur Vorbereitung von Medien und Reagenzien).
    2. Füttern Sie an abwechselnden Tagen mit einem halben Medienwechsel nach 24 Uhr und einem vollständigen Medienwechsel nach 48 Uhr.
      HINWEIS: Nach 3-4 Tagen muss die vmNPC-Kultur passagiert werden. Empfohlen wird ein Standard-Passageverhältnis von 1:3 oder 1:4 – dies muss für jede verwendete hiPSC-Leitung optimiert werden.
    3. 1 h vor der Passage 1x Zellergänzungsmittel (z. B. Revitacell) zu vmNPCs hinzufügen und 1x Basalmembranmatrix (z. B. Geltrex) beschichteter Gewebekulturkunststoff vorbereiten (Abschnitt 2.2 Herstellung der Basalmembranmatrix und Beschichtung von Rissue-Kulturkunststoff).
    4. Entfernen Sie die Medien von vmNPCs und waschen Sie sie 2x mit D-PBS. Fügen Sie 1 ml vorgewärmte Zellablösungslösung (z. B. Accutase) pro 10 cm2 Kulturfläche hinzu (1 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte).
    5. 1 Minute lang bei 37 °C platzieren und dann die vmNPCs mit einem Phasenkontrastmikroskop untersuchen.
      HINWEIS: Die vmNPCs beginnen sich aufzurunden, ihre Prozesse ziehen sich zurück und es erscheinen Lücken in der Zellschicht. Dies kann je nach Zelldichte zwischen 1 und 3 Minuten dauern.
    6. Wenn vmNPCs dieses Aussehen annehmen, fügen Sie 100 μl Zellablösungslösung (z. B. Accutase) auf die Schicht der vmNPCs hinzu.
      HINWEIS: Wenn die vmNPCs bereit sind, sich zu lösen, erscheint ein Loch in der Zellenschicht. Wenn dies nicht der Fall ist, müssen die vmNPCs mit einer Lösung zur Zellablösung weiter inkubiert werden.
    7. Wenn sich vmNPCs leicht ablösen lassen, entfernen Sie vorsichtig die Zellablösung, und waschen Sie die vmNPCs 2x mit N2B27-Medien. Geben Sie das N2B27-Medium vorsichtig an der Seite des Well- oder Kulturgefäßes hinunter und schwenken Sie es vorsichtig, um es zu waschen, wobei darauf zu achten ist, dass sich die vmNPCs nicht ablösen.
      HINWEIS: Dieser Schritt muss schnell abgeschlossen werden, um sicherzustellen, dass vmNPCs nicht erneut an die Zellenoberfläche angehängt werden. Wenn sich vmNPCs in den Waschschritten abzulösen beginnen, sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 150 x g für 3 min. vmNPCs werden beim Passieren nicht standardmäßig zentrifugiert, da dies ihr Überleben beeinträchtigen kann.
    8. Entfernen Sie schließlich vmNPCs mit einer Pipette, indem Sie vmNPC-Induktionsmedien, die 1x Zellzusatz (z. B. Revitacell) enthalten, kräftig direkt auf die Zellschicht ausstoßen. Dadurch sollen vmNPCs entfernt werden, die dann direkt in die neuen matrixbeschichteten beschichteten Kulturgefäße überführt werden können.
      HINWEIS: Verwenden Sie keine Medien, die bereits resuspendierte vmNPCs enthalten, um weitere Zellen zu entfernen, da dies zu einer Überverreibung führt, die ihr Überleben verringert.
    9. In den 37 °C/5 % CO2 -Inkubator einsetzen. vmNPCs sollten nach 20-30 Minuten beginnen, sich an die matrixbeschichtete Oberfläche zu heften. Ersetzen Sie nach 24 h die Hälfte des Mediums durch frisches vmNPC-Induktionsmedium (ohne Zellzusatz) und setzen Sie den Fütterungsplan wie zuvor fort.
    10. Setzen Sie das Regime des Fütterns und Passierens für 10 Tage fort.
  2. Aufbereitung der Basalmembranmatrix und Beschichtung von Gewebekulturkunststoff
    HINWEIS: Zur Pflege von vmNPCs wird 1x Basalmembranmatrix (z.B. Geltrex) zur Beschichtung von Kunststoffen verwendet. Für die Wartung von vmAPCs oder vmAstros kann eine 0,25-fache Basalmembranmatrix verwendet werden.
    1. Entfernen Sie das Material der Kellermembranmatrix aus einem -80 °C-Gefrierschrank und stellen Sie es über Nacht zum Auftauen in einen 4 °C-Kühlschrank.
    2. 1:10 mit eiskaltem DMEM/F12 + Glutamax verdünnen, aliquotieren und bei -80 °C als 10x Brühe lagern.
    3. Beim Beschichten von Kunststoffen verdünnen Sie diesen 10x auf 1x (für vmNPCs) bzw. 0,25x (für vmAPCs oder vmAstros) mit eiskaltem DMEM/F12 + Glutamax.
    4. Sofort 1 ml pro 10 cm2 in Gewebekulturkunststoff geben, z. B. 1 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte.
    5. Bei 37 °C 1 h ziehen lassen. Die Basalmembran-Matrix-Lösung sollte nicht von Kunststoffen entfernt werden, bis sie bereit ist, Medien/Zellen hinzuzufügen, um sicherzustellen, dass die beschichteten Kunststoffe nicht austrocknen. Matrixbeschichtete Platten müssen vor dem Hinzufügen von Zellen nicht gewaschen werden.
  3. Erweiterung der vmNPCs
    1. Ersetzen Sie an Tag 10 des Protokolls das Induktionsmedium durch vmNPC-Expansionsmedien (N2B27 + GDNF + BDNF + Ascorbinsäure). Siehe Tabelle 1 für Einzelheiten zur Vorbereitung von Medien und Reagenzien).
      HINWEIS: Die vmNPCs benötigen keine Zugabe von Mitogenen, um eine Proliferation zu induzieren. BDNF, GDNF und Ascorbinsäure unterstützen das Überleben und die Aufrechterhaltung von vmNPCs30.
    2. Füttern Sie an abwechselnden Tagen mit einem halben Medienwechsel nach 24 Uhr und einem vollständigen Medienwechsel nach 48 Uhr.
      HINWEIS: Nach 3-4 Tagen muss die vmNPC-Kultur passagiert werden. Für die Passage wird ein Standard-Passageverhältnis von 1:3 oder 1:4 empfohlen (dies muss für jede verwendete hiPSC-Leitung optimiert werden. Bestimmen Sie das Verhältnis, das das beste Überleben, die beste Verbreitung und die beste Generierung von vmNPCs ermöglicht.
    3. 1 h vor der Passage 1x Zellergänzungsmittel (z. B. Revitacell) zu vmNPCs hinzufügen und 1x matrixbeschichtete Platten/Kolben im Voraus vorbereiten (Abschnitt 2.2 Vorbereitung der Basalmembranmatrix und Beschichtung von Rissue-Kulturkunststoff). Die Zellablösungslösung (z. B. Accutase) auf 37 °C vorwärmen. Erwärmen Sie frische vmNPC-Expansionsmedien mit 1x Zellzusatz (z. B. Revitacell).
    4. Entfernen Sie Medien von vmNPCs und waschen Sie sie 2x mit D-PBS. Fügen Sie 1 ml Zellablösungslösung (z. B. Accutase) pro 10 cm2 Kulturfläche hinzu (1 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte). 1 Minute lang bei 37 °C platzieren und dann die vmNPCs mit einem Phasenkontrastmikroskop untersuchen.
      HINWEIS: Die vmNPCs beginnen sich aufzurunden, ihre Prozesse ziehen sich zurück und es erscheinen Lücken in der Zellschicht. Dies kann je nach Zelldichte 1-3 Minuten dauern.
    5. Wenn vmNPCs ein abgerundetes Aussehen annehmen, fügen Sie 100 μl Zellablösungslösung (z. B. Accutase) auf die Schicht der vmNPCs hinzu.
      HINWEIS: Wenn die vmNPCs bereit sind, sich zu lösen, erscheint ein Loch in der Zellenschicht. Geschieht dies nicht, müssen die vmNPCs mit der Zellablösungslösung weiter inkubiert werden.
    6. Wenn sich vmNPCs leicht ablösen lassen, entfernen Sie vorsichtig die Zellablösung, und waschen Sie die vmNPCs 2x mit N2B27-Medien. Geben Sie das N2B27-Medium vorsichtig an der Seite des Well- oder Kulturgefäßes hinunter und schwenken Sie es vorsichtig, um es zu waschen, wobei darauf zu achten ist, dass sich die vmNPCs nicht ablösen.
      HINWEIS: Wenn sich vmNPCs in den Waschschritten in großer Zahl ablösen, sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 150 x g für 3 Minuten. vmNPCs werden beim Passieren nicht standardmäßig zentrifugiert, da dies ihr Überleben beeinträchtigen kann. Dieser Schritt muss schnell abgeschlossen werden, um sicherzustellen, dass vmNPCs nicht erneut an der Zellenoberfläche befestigt werden.
    7. Entfernen Sie vmNPCs mit einer Pipette und stoßen Sie das vmNPC-Expansionsmedium mit 1x Zellzusatz (z. B. Revitacell) kräftig direkt auf die Zellschicht aus. Dadurch sollten vmNPCs entfernt werden, die dann direkt in die vorbereiteten matrixbeschichteten Platten/Kolben überführt werden können (siehe Abschnitt 2.2 "Vorbereitung der Basalmembranmatrix und Beschichtung von Gewebekulturkunststoffen").
      HINWEIS: Verwenden Sie keine Medien, die bereits resuspendierte vmNPCs enthalten, um weitere Zellen zu entfernen, da dies zu einer Überverreibung führt, die ihr Überleben verringert.
    8. In den 37 °C/5 % CO2 -Inkubator einsetzen. vmNPCs sollten nach 20-30 Minuten beginnen, sich an die matrixbeschichtete Oberfläche zu heften. Ersetzen Sie nach 24 Stunden die Hälfte des Nährmediums durch frisches vmNPC-Expansionsmedium (ohne Zellzusatz) und setzen Sie das vorherige Fütterungsschema fort.
    9. Setzen Sie dieses Regime des Fütterns und Übergebens für 10 Tage fort. vmNPCs können bis zu Tag 50 erweitert werden.
  4. Differenzierung und Ausbau von vmAPCs
    HINWEIS: vmNPCs können zwischen 30 und 50 Tagen nach der ersten hiPSC-Phase erfolgreich für die Generierung von vmAPCs/vmAstros verwendet werden (Abbildung 1A).
    1. Nehmen Sie eine konfluente vmNPC-Kultur und waschen Sie vmNPCs 3x in erweitertem DMEM/F12, um Spuren der Komponenten von vmNPC-Expansionsmedien zu entfernen. Ersetzen Sie den Datenträger durch vmAPC-Erweiterungsmedien (ASTRO-Datenträger + EGF + LIF. Siehe Tabelle 1 für Einzelheiten zur Vorbereitung von Medien und Reagenzien).
    2. Nach 72 Stunden Passage hat die vmNPC-Kultur ein hohes Verhältnis (1:7,5). Unter der Annahme, dass vmNPCs beispielsweise in einer einzigen Vertiefung einer 6-Well-Platte aufbewahrt wurden, sollten sie nun in einen 1x-Matrix-beschichteten 75-cm-2-Kolben geleitet werden (beschichtet wie in Abschnitt 2.2 "Vorbereitung der Basalmembranmatrix und Beschichtung von Gewebekulturkunststoff" beschrieben). Passage mit einer Lösung zur Zellablösung, wie für vmNPCs in Abschnitt 2.3 'Expansion von vmNPCs' beschrieben.
    3. Resuspendieren Sie vmNPCs in einem geeigneten Volumen von vmAPC Expansion-Medien (7,5-15 mL Medien pro 75 cm2 Kolben. Vollständiger Medienwechsel alle 3 Tage oder je nach Bedarf der Zellen.
      HINWEIS: Von diesem Zeitpunkt an werden vmNPCs als vmAPCs bezeichnet und sollten als einzelne Zellen und nicht als Zellcluster übergeben werden. vmAPCs sollten alle 3-7 Tage oder wenn sie konfluent werden, durchlaufen werden, um eine übermäßige Konfluenz zu vermeiden. Ab diesem Zeitpunkt sollte die reduzierte Konzentration der 0,25-fachen Matrix zur Beschichtung von Kunststoffen verwendet werden (wie in Abschnitt 2.2 Vorbereiten der Basalmembranmatrix und Beschichten von Gewebekulturkunststoff beschrieben).
    4. Erweitern Sie vmAPCs bis zum 90. Tag (aus der hiPSC-Phase) und kryokonservieren Sie vmAPCs zu verschiedenen Zeitpunkten ihrer Expansion.
  5. Generierung ausgereifter vmAstros aus vmAPCs
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können vmAPCs in 175 cm2 Gewebekulturflaschen gezüchtet werden. Dies kann für die Generierung einer großen Anzahl ausgereifter vmAstros erweitert werden.
    1. Wenn vmAPCs eine Konfluenz von 80 % erreichen, waschen Sie sie 3x mit ASTRO-Medien und ersetzen Sie sie durch vmAstros-Reifemedien (ASTRO-Medien +BMP4 +LIF. Siehe Tabelle 1 für Einzelheiten zur Vorbereitung von Medien und Reagenzien).
    2. Führen Sie alle 3 Tage oder je nach Bedarf der Zellen 10 Tage lang einen kompletten Medienwechsel durch.
      ANMERKUNG: a) Zu diesem Zeitpunkt deutet die Charakterisierung darauf hin, dass die vmAstros ausgereift sind, was durch Immunzytochemie (Abbildung 2G - I) und durch Genexpressionsanalyse (Manuskript in Vorbereitung) bestätigt wurde. b) vmAstros, die unmittelbar nach der Reifung verwendet werden, sollten auf einer neu vorbereiteten, matrixbeschichteten Oberfläche neu beschichtet werden. Wenn vmAPCs oder vmAstros länger als 14 Tage auf derselben Kulturoberfläche gehalten werden, kann dies zu suboptimalen Kulturen führen, bei denen die Zellen zu schrumpfen beginnen und sich sogar ablösen. c) Bei Anwendungen, die die neuroinflammatorische Modulation untersuchen, werden BMP und LIF 72 Stunden vor der neuroinflammatorischen Stimulation entfernt. Dadurch soll eine mögliche Wechselwirkung zwischen der BMP/LIF-Signalgebung und der induzierten neuroinflammatorischen Signalgebung vermieden werden.
    3. vmAstros können nun für experimentelle Assays neu plattiert werden, z. B. auf Deckgläser für die Immunzytochemie oder kryokonserviert für zukünftige Anwendungen (Abschnitte 3, 4).
      HINWEIS: Eine Passage sollte in diesem Stadium des Protokolls nicht erforderlich sein, da die Proliferation nur mit einer sehr geringen Rate erfolgen sollte. vmAPCs, die zu dicht beschichtet sind, weisen in diesem Stadium ein höheres Maß an Proliferation auf. Wenn dies der Fall ist, durchlassen und teilen Sie die Zellen, um eine Dichte zu erreichen, wie in Abbildung 1F gezeigt.

3. Kryokonservierung von vmNPCs, vmAPCs und vmAstros

HINWEIS: Kryokonserve vmNPCs/vmAPCs/vmAstros bei voller Konfluenz.

  1. 1 h vor Beginn 1x Zellergänzungsmittel (z. B. Revitacell) zur Kultur hinzufügen. Füllen Sie das Kryolagergefäß (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur mit Isopropanol.
  2. Lösen Sie die Zellen von den Kulturplatten mit einer Zellablösung, wie zuvor beschrieben, und sammeln Sie die Zellen in geeigneten Medien (N2B27 oder ASTRO-Medien), die 1x Zellzusatz (z. B. Revitacell) enthalten. Bei 150 x g 3 min zentrifugieren.
  3. Resuspendieren Sie pelletierte vmNPCs/vmAPCs/vmAstros in Volumes zum Einfrieren von Zellen (siehe Materialtabelle) wie folgt (Schritte 3.3.1. - 3.3.3.)
    1. Für vmNPCs: Verwenden Sie 700 μL pro 10 cm2 Kulturfläche in 1 Kryofläschchen.
    2. Für vmAPCs: 700 μl pro 60 cm2 Kulturfläche in 1 Kryofläschchen (ca. 1/3 eines T175-Kulturkolbens) verwenden.
    3. Für vmAstros: Resuspendieren Sie in einem 2-ml-Medium und zählen Sie die Anzahl der vmAstros. Rezentrifugieren und resuspendieren Sie in Zellgefriermedien (siehe Materialtabelle) mit einer Anzahl pro Kryovial, die für zukünftige Anwendungen geeignet ist. Unter der Annahme eines ungefähren Zellverlusts von 15 % durch Frost-Auftauen werden neu aufgetaute vmAstros gezählt und mit einer 15 % überschüssigen Zellzahl plattiert, um den Zelltod im Frost-Tau-Prozess zu kompensieren. Dies entspricht also 74.750 vmAstros procm2. Aufgetaute vmAstros werden vor der Analyse 72 Stunden lang in ASTRO-Medien aufbewahrt.
  4. Füllen Sie die Kryofläschchen in ein Zellgefriergefäß (Details siehe Materialtabelle) und stellen Sie das Gefriergefäß für 24 Stunden in einen -80 °C-Gefrierschrank. Nach 24 h können Kryofläschchen zur Langzeitlagerung auf flüssigen Stickstoff (-196 °C) umgefüllt werden.

4. Charakterisierung des vmAstro-Phänotyps

  1. Immunzytochemie
    1. Legen Sie 100-200 13 mm Glasdeckgläser in gläserne Petrischalen auf eine Schicht Filterpapier und sterilisieren Sie sie in einem trockenen Autoklaven.
    2. Übertragen Sie die Deckgläser mit einer sterilen Pinzette in Vertiefungen mit 4- oder 24-Well-Platten. 1x Matrixlösung (z.B. Geltrex) als 50 μL Tröpfchen auf die Deckgläser geben und bei 37 °C 1 h inkubieren.
    3. vmAstros passieren oder auftauen, in ASTRO-Medien resuspendieren und eine Zählung durchführen. Platten vmAstros mit 25-100.000 Zellen pro Deckglas in einem 50 μL Tröpfchen.
    4. Entfernen Sie die Matrize vom Deckglas und fügen Sie vmAstros sofort in ein Tröpfchen Medium ein. 30 min bei 37 °C erhitzen und dann die Vertiefungen mit einem zusätzlichen 250 μL ASTRO-Medium fluten.
      HINWEIS: Wenn eine Immunzytochemie durchgeführt wird, um lediglich die Expression von Astrozyten- und Mittelhirnmarkern zu überprüfen, kann vmAstros 24 Stunden nach der Beschichtung fixiert werden.
    5. Bereiten Sie 4%ige Formaldehydlösung her, indem Sie 36%ige Formaldehydlösung 1:9 in D-PBS verdünnen.
    6. Waschen Sie vmAstros 1x mit D-PBS. Sofort 4% Formaldehyd in die Vertiefungen geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen.
    7. Formaldehyd entfernen und durch D-PBS ersetzen. Entweder bei 4 °C lagern oder mit der Immunzytochemie fortfahren.
    8. Deckgläser in Vertiefungen 3x mit D-PBS waschen. Permeabilisieren und blockieren Sie in 10 % Ziegenserum, 1 % BSA in 0,1 % PBTx (D-PBS + 1:1000 Triton-X) für 1 h bei Raumtemperatur.
    9. Primärantikörper (Table of Materials) in 1 % Ziegenserum, 0,1 % BSA in 0,1 % PBTx (D-PBS + 1:1000 Triton-X) geben und über Nacht bei 4 °C auf einer Wippe inkubieren.
    10. Am nächsten Tag Primärantikörper entfernen und Deckgläser 3x mit D-PBS waschen.
    11. Geeignete Sekundärantikörper (Table of Materials) in 1 % Ziegenserum, 0,1 % BSA in 0,1 % PBTx geben und 1-2 h bei Raumtemperatur inkubieren und auf einer Wippe vor Licht schützen. Deckgläser 3x mit D-PBS waschen.
    12. Geben Sie DAPI-Lösung (0,1 μg/ml DAPI in D-PBS) hinzu und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Deckgläser 3x mit D-PBS waschen.
    13. Um das Deckglas zu montieren, geben Sie einen 5-μl-Tropfen Mowiol/DABCO-Eindeckmittel [12 % Mowiol (w/v), 12 % Glycerin (w/v) über Nacht gelöst und in 0,2 M Tris (pH 8,5) mit 25 mg/ml 1,4-Diazabicylo[2.2.2]octan (DABCO)] zu einem Glasobjektträger. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Deckglas aus der Vertiefung. Tupfen Sie den Rand des Deckglases auf das Taschentuch, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie die vmAstros-Seite nach unten auf das Mowiol/DABCO-Tröpfchen.
    14. Wiederholen Sie dies für jedes Deckglas und lassen Sie es 8 Stunden trocknen, bevor Sie es mikroskopisch untersuchen.
  2. ELISA-Messung der vmAstros-Sekretion von IL-6 als Reaktion auf eine Zytokinbehandlung
    HINWEIS: Nach der 10-tägigen Reifung mit BMP4 und LIF sollten vmAstros auf 0,25x matrixbeschichteten Gewebekultur-Kunststoffen durchgelassen, gezählt und plattiert werden (wie in Abschnitt 2.2Aufbereitung der Basalmembranmatrix und Beschichtung von Gewebekulturkunststoff) bei einer Dichte von 65.000 vmAstros pro cm2 in ASTRO media. BMP4 und LIF sollten 72 Stunden vor der Zytokinbehandlung aus dem vmAstros entfernt werden, da aktive Signale von diesen Faktoren die Wirksamkeit der Zytokinbehandlung beeinträchtigen können. Alternativ können kryokonservierte vmAstros aufgetaut und für Assays verwendet werden.
    1. Waschen Sie vmAstros 3x am Tag des Assays vorsichtig in nicht-redoxen Medien (DMEM/F-12 + Glutamax + N2).
    2. Verwenden Sie zum Vergleich eine unbehandelte und mit Zytokinen behandelte Vertiefung. Fügen Sie das ausgewählte Zytokin in optimierter Konzentration hinzu. Die Daten in Abbildung 2J - L wurden unter Verwendung von IL-1α bei 3 ng/mL9 in nicht-redox-Medien bei 1 mL pro 10 cm2 Zellkulturfläche generiert.
    3. Ersetzen Sie vmAstros für 24 h in einen 37 °C/5 % CO2 -Inkubator. Nach 24 Stunden das Nährmedium in sterile Mikrofuge-Röhrchen auffüllen.
    4. Wenn der ELISA nicht sofort durchgeführt wird, frieren Sie die Proben des Schnapp-Gefriermediums ein, indem Sie Mikrofuge-Röhrchen in flüssigen Stickstoff tauchen und für die zukünftige Analyse bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde speziell für die Verwendung mit dem IL-6 ELISA-Kit optimiert, das in der Materialtabelle aufgeführt ist. Antikörper und Standards, die als lyophilisiertes Pulver in einem neuen ELISA-Kit geliefert werden, müssen vor der ersten Verwendung rekonstituiert und für die zukünftige Verwendung aliquotiert werden. Das mit dem Kit gelieferte Datenblatt enthält die für die Rekonstitution erforderlichen Reagenzien und Volumina. Der Capture-Antikörper muss in PBS (ohne Trägerprotein) rekonstituiert werden.
    5. Führen Sie den ELISA in einem 96-Well-Plattenformat durch und berechnen Sie die Volumina der Reagenzien entsprechend den verwendeten Wells. Bereiten Sie am Tag des ELISA den Fangantikörper vor, indem Sie die Brühe in PBS 1:120 verdünnen. Beschichten Sie die Platte, indem Sie 50 μl Capture-Antikörper pro Vertiefung laden. Decken Sie die Platte mit einem Klebestreifen ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur.
    6. Am nächsten Tag die Platte 3x mit D-PBS-Tween (D-PBS mit 0,05% Tween-20), 100 μL pro Vertiefung waschen. Trocken tupfen.
    7. Blockieren Sie die Platte, indem Sie 150 μL D-PBS/1 % BSA pro Vertiefung laden. Mindestens 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Waschplatte wie beschrieben.
    8. Tauen Sie die Proben auf Eis auf (dies kann 1-2 Stunden dauern). Verdünnen Sie die Proben im Verhältnis 1:5, indem Sie 10 μl Probe und 40 μL D-PBS/1 % BSA laden. Wirbeln Sie jede Probe vor dem Laden vor.
      HINWEIS: Bei der Durchführung eines IL-6-ELISA ist es notwendig, Proben zu verdünnen, die Verdünnungen sollten optimiert werden.
    9. Der obere Standard (1.000 ρg/ml) wird durch Verdünnung des Stoffes in D-PBS/1 % BSA im Verhältnis 1:180 hergestellt. Bereiten Sie 7 Standards vor, indem Sie eine serielle Verdünnung des Top-Standards durchführen. Wirbel zwischen jeder Verdünnung.
    10. Geben Sie 50 μl Standards/Proben in die Vertiefungen. Verwenden Sie D-PBS/1% BSA als Rohling. Inkubieren Sie 2 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler, um die verdünnten Proben richtig zu mischen. Waschplatte wie beschrieben.
    11. Bereiten Sie den Nachweisantikörper her, indem Sie das Material 1:60 in D-PBS/1 % BSA verdünnen. Laden Sie 50 μl Nachweisantikörper pro Well. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei RT. Waschplatte wie beschrieben.
    12. Bereiten Sie Streptavidin her, das an Meerrettichperoxidase (Strep-HRP) konjugiert ist, indem Sie das Material 1:40 in D-PBS/1 % BSA verdünnen. Laden Sie 50 μl Strep-HRP pro Vertiefung und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschplatte wie beschrieben.
    13. Initiieren Sie die Farbreaktion, indem Sie 50 μl TMB-Substratlösung pro Vertiefung laden. Bei Raumtemperatur im Dunkeln 20 Minuten inkubieren (oder bis die Standards und Proben eine blaue Farbe angenommen haben).
      HINWEIS: TMB wird bei 4 °C gelagert, sollte aber bei Raumtemperatur verwendet werden.
    14. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 25 μl Stopplösung (1 M H2SO4) pro Vertiefung hinzufügen und den Farbwechsel von blau nach gelb notieren.
    15. Lesen Sie die Platte bei 450 nm Extinktion mit einem Mikroplatten-Reader ab. Stellen Sie die Wellenlängenkorrektur auf 540 nm Absorption ein, um die Genauigkeit zu maximieren. Berechnen Sie die Proteinkonzentrationen in den Proben aus der erstellten Standardkurve.

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Results

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Differenzierungsmethodik und -verlauf
Im Folgenden werden sowohl die Methoden zur Erzeugung von vmAstros als auch die Protokolle, die für ihre anschließende phänotypische Charakterisierung verwendet werden, im Detail vorgestellt. Die Methode zur Erzeugung von vmAstros besteht aus mehreren unterschiedlichen Differenzierungsstufen, die mikroskopisch überwacht werden können und unterschiedliche morphologische Merkmale identifizieren (Abbildung 1A-F

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Discussion

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Diese Methode zur Erzeugung von vmAstros aus hiPSCs ist hocheffizient, da sie Reinkulturen von vmAstros erzeugt und für die Erzeugung von vmAstros aus verschiedenen hiPSC-Linien reproduzierbar ist. Dieses Protokoll wurde um die Rekapitulation der Entwicklungsereignisse herum entwickelt, die im Embryo erforderlich sind, um das sich entwickelnde Mittelhirn korrekt zu strukturieren und Astrozyten zu erzeugen, und umfasst drei definierte Phasen: 1) die Induktion des neuralen ventralen Mittel...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch ein Parkinson's UK Project Grant (G-1402) und ein Stipendium finanziert. Die Autoren danken der Wolfson Bioimaging Facility für ihre Unterstützung und Hilfe bei dieser Arbeit.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagenzien
0,2M Tris-Cl (pH 8,5)n/an/aHergestellt aus Tris-Base und plus HCl
0,5M EDTA, PH 8ThermoFisher  15575-0201:1000 in D-PBS bis 0,5 mM final 
1,4-Diazabicylo[2.2.2]octan (DABCO)SigmaD27802-  25 mg/mL in Mowiol-Eindecklösung
13 mm DeckgläserVWR631-0149
2-Mercaptoethanol (50 mM)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634010Hat 1x NEAA, aber wir fügen die Endkonzentration von 2x (0,2 mM)
AscorbinsäureSigmaA5960 hinzu200 mM Schaft, 1:1000 bis 200 & Mikro; M final
B27 SupplementThermoFisher17504-04450x Lager
BSASigma5470
ZellgefriermedienSigmaC2874Cryostor CS10
ZellgefriergefäßNalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem13860,8 mM Lagerbestand, 1:1000 Verdünnung auf 0,8 &Mikro; M final
Kryofläschchen  SigmaCLS430487
DAPI SigmaD95421 mg/ml, 1:10.000 bis 100 ng/ml final (in PBS)
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS (D-PBS ohne Mg oder Ca)ThermoFisher14190144pH 7,2
E8 Flex Medium KitThermoFisherA2858501
Formaldehyd (36%ige Lösung)Sigma47608
GeltrexThermoFisherA14133021:100 oder 1:400 in eiskaltem DMEM/F12
GlutamaxThermoFisher350500382 mM Material (1:200 in N2B27, 1:100 in ASTRO Medien bis 20 &Mikro; M endg.) 
GlycerolSigmaG5516
Human-BDNF  Peprotech450-0220 & Mikro; g/mL Lagerbestand, 1:1000 bis 20 ng/mL final
Human BMP4Peprotech120-0520 µ g/mL Vorrat, 1:1000 bis 20 ng/mL endgültig
Humaner EGFPeprotechAF-100-1520 µ g/mL Lagerbestand, 1:1000 bis 20 ng/mL final
Human GDNFPeprotech450-1020 µ g/ml Vorrat, 1:1000 bis 20 ng/ml endgültige
HumaninsulinlösungSigma I927810 mg/ml-Bestand, 1:2000 bis 5 & Mikro; g/mL final
Humanes LIFPeprotech300-0520 µ g/mL Vorrat, 1:1000 bis 20 ng/mL endgültiges
IL-6 ELISA-KitBiotechneDY206
IsopropanolSigmanbsp; I9516-4LZum Befüllen Mr Frosty Kryolagergefäß
LDN193189SigmaSML0559100 µ M Schaft, 1:10.000 Verdünnung auf 10 nM final
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 SupplementThermoFisher17502048100x Ware
NEAAThermoFisher1114003510 mM Schaft, 1:100 bis 0,1 mM final 
Neurobasale MedienThermoFisher21103049
Normales ZiegenserumVector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501100x Stammmaterial, 1:100 bis 1x
final SB431542Tocris161410 mM Material, 1:1000 Verdünnung auf 10 & Mikro; M final
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 µ g/mL Lagerbestand, 1:1000 bis 200 ng/mL final
Tris-HClSigma PHG0002 
Triton-XSigmaX100
Tween-20Sigma P7949
VitronectinThermoFisherA147001:50 in D-PBS
Antikörper für die Immunzytochemie  <>Company>Katalognummer<strong>Wirtsspezies
Antikörper gegen S100bSigmaSAB4200671Maus; 1:200
Antikörper gegen FOXA2SCBTNB600501Maus; 1:50
Antikörper gegen LMX1AProSci7087Kaninchen; 1:300
Antikörper gegen LMX1AMilliporeAB10533Kaninchen; 1:2000
Antikörper gegen LMX1BProteintech18278-1-APKaninchen; 1:300
Antikörper gegen GLASTProteintech20785-1-APKaninchen; 1:300
Antikörper gegen GFAPDakoZ0334Kaninchen; 1:400
Antikörper gegen CD49fProteintech27189-1-APKaninchen; 1:100
Antikörper gegen MSI1Abcamab52865Kaninchen; 1:400
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen ThermoFisherA32731Ziege; 1:500
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-MausThermoFisherA32723Ziege; 1:500
Alexa Fluor 568 Ziege Anti-KaninchenThermoFisherA11036Ziege; 1:500
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-MausThermoFisherA11031Ziege; 1:500
&

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