Injektion von humanen mesenchymalen Stammzellen in die intraspinale Höhle und Verfolgung ihrer Migration in das Rattengehirn

Zusammenfassung

Es können verschiedene Verabreichungswege verwendet werden, um mesenchymale Stammzellen (MSCs) in das Gehirn zu bringen. In der vorliegenden Studie wurden MSCs über die Neuroaxis und das Gehirn durch intraspinale Injektion verabreicht. MSCs wurden in die Wirbelsäulenhöhle von Ratten injiziert, und die Migration der Stammzellen wurde verfolgt und quantifiziert.

Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden zur Behandlung verschiedener Krankheiten untersucht. Bei neurodegenerativen Erkrankungen mit Defekten sowohl im Gehirn als auch im Rückenmark ist der Verabreichungsweg sehr wichtig, da MSCs sowohl ins Gehirn als auch ins Rückenmark wandern müssen. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Verabreichung von MSCs in den Spinalkanal (intraspinale Injektion) beschrieben, die in einem Rattenmodell auf das Gehirn und das Rückenmark abzielen kann. Eine Million MSCs wurden in die Wirbelkanäle von Ratten auf Höhe der Lendenwirbel 2-3 injiziert. Nach der Verabreichung wurden die Ratten 0, 6 und 12 Stunden nach der Injektion euthanasiert. Optische Bildgebung und quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) wurden verwendet, um die injizierten MSCs zu verfolgen. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigten, dass MSCs, die über die Wirbelsäule verabreicht wurden, nachträglich sowohl im Gehirn als auch im Rückenmark nach 12 h nachgewiesen werden konnten. Die Injektion in die intraspinale Höhle hat den Vorteil, dass keine Vollnarkose erforderlich ist und nur wenige Nebenwirkungen auftreten. Der Nachteil der geringen Migrationsrate von MSCs ins Gehirn muss jedoch überwunden werden.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen
Unter Krankheitsbedingungen sezernieren MSCs krankheitsspezifische therapeutische Substanzen über parakrine Wirkungen¹, von denen berichtet wurde, dass sie Immunreaktionen regulieren, geschädigtes Gewebe wiederherstellen und toxische Substanzen entfernen². Daher gilt die MSC-Therapie bei der Behandlung von multifaktoriellen Erkrankungen wie Alzheimer und Sarkopenie als wirksamer als die Single-Target-Therapie 3,4,5,6. Darüber hinaus haben MSCs im Gegensatz zu Pharmazeutika einen Homing-Effekt, der durch die Erkennung von entzündlichen Zytokinen oder Chemokinen im Körper in den Bereich des geschädigten Gewebes wandert ^7,8. Leider erreicht nur eine Untergruppe der Zellen den geschädigten Bereich, und die Lebensfähigkeit der MSCs nimmt während der Migration ab ^9,10,11,12. Um die therapeutische Wirksamkeit von MSCs zu maximieren, ist es daher notwendig, lebensfähige Zellen an den Zielort zu bringen. Daher ist es bei der Verabreichung von MSCs wichtig, den richtigen Verabreichungsweg zu wählen, der auf der Art der Zielerkrankung basiert.

Einspritzweg
Es gibt zahlreiche Wege, auf denen Therapeutika an Patienten verabreicht werden. Die gebräuchlichsten Methoden sind die intravenöse Injektion in den systemischen Kreislauf, die orale Verabreichung und die subkutane oder intramuskuläre Injektion. Bei neurodegenerativen Erkrankungen ist die Blut-Hirn-Schranke (BHS) das Haupthindernis bei der Verabreichung von Therapeutika an das Gehirn. Die BHS schützt das Gehirn vor äußeren Krankheitserregern durch Tight Junctions zwischen den Blutgefäßen und dem Hirnparenchym^13,14. Die BHS verhindert jedoch paradoxerweise auch, dass Therapeutika in das Hirnparenchym gelangen. Daher ist die Passage durch die BHS die Haupthürde bei der Entwicklung von Therapien für Hirnerkrankungen ^15,16. Zur Überwindung dieses Nachteils wird eine intrazerebrale Injektion durchgeführt^, indem Zielsubstanzen durch chirurgische Eingriffe direkt in das Gehirn injiziert^werden 17,18,19. Allerdings sollten die Nebenwirkungen von chirurgischen Eingriffen bedacht werden, zumal die Nadel während des Eingriffs neuronale Zellen schädigt.

Verabreichung in der intraspinalen Höhle
Die intrathekale Verabreichung - die Verabreichung von Arzneimitteln in den Spinalkanal oder den Subarachnoidalraum - liefert Arzneimittel über die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) an das Gehirn oder die Neuroaxis und ist eine praktikable Alternative zur intrazerebralen Injektion. Intrathekale Injektionen können nach der Injektionsstelle unterteilt werden: Seitenventrikel, Cisterna magna und Wirbelsäulenhöhle. Alle drei Wege ermöglichen es Medikamenten oder Zellen, sich im Liquor in das Gehirn und das Rückenmark zu verteilen. Die Verabreichung des Arzneimittels an das Gehirn kann bei intrazerebroventrikulären und intrazisterna magna Injektionen effizienter sein, da der Wirkstoff in der Nähe des Gehirns injiziert wird. Die intraspinale Injektion hat jedoch den Vorteil, dass keine Vollnarkose oder Operation zum Einsetzen eines intraventrikulären Reservoirs erforderlich ist, da sie im Allgemeinen sicher ist²⁰ und bei Bedarf wiederholt durchgeführt werden kann.

Der Zweck dieser Studie bestand darin, die intraspinale Verabreichung von MSCs sowohl an das Gehirn als auch an das Rückenmark zu validieren. Zunächst wurde die intraspinale Höhle in einem Rattenmodell etabliert. Als nächstes wurden MSCs mit einem lipophilen Tracer, DiD, markiert (DiIC18(5); 1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanin, 4-Chlorbenzolsulfonatsalz), um die Effizienz der Stammzellmigration zum Rückenmark und Gehirn zu bewerten. Zur Beurteilung der Zelldispersion wurde eine optische Ex-vivo-Bildgebung durchgeführt. Dieses einfache Protokoll kann ohne chirurgischen Eingriff durchgeführt werden und kann nicht nur zur Verabreichung von Stammzellen, sondern auch von Arzneimitteln, Antikörpern, Kontrastmitteln und anderen Substanzen verwendet werden, die dem Rückenmark oder dem Gehirn zugeführt werden sollen.

Protokoll

HINWEIS: Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (Zulassungsnummer: 20170125001, Datum: 25. Januar 2017) des Samsung Biomedical Research Institute (SBRI) am Samsung Medical Center genehmigt. Als akkreditierte Einrichtung der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International handelt das SBRI nach den Richtlinien des Institute of Laboratory Animal Resources.

1. Herstellung von aus Wharton-Gelee gewonnenen MSCs beim Menschen

1. Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen (WJ-MSCs) aus Gelee (WJ-MSCs)
   1. Tauen Sie ein Fläschchen mit humanen WJ-MSCs schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. Übertragen Sie die WJ-MSCs in ein konisches 50-ml-Röhrchen und fügen Sie Wachstumsmedium mit einem Volumen hinzu, das mindestens das 10-fache des Volumens der Zellen (v/v) beträgt. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen zu suspendieren.
   2. Bei 300 × g 5 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie die Zellen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu entsorgen.
   3. WJ-MSCs in T175-Kolben mit einer Dichte von 5.000-6.000 Zellen/cm^{aussäen 2}. Inkubieren Sie WJ-MSCs in einem 37 °C_{CO 2} -Inkubator. Wechseln Sie das Wachstumsmedium alle 72 Stunden, bis die WJ-MSCs eine Konfluenz von 80-90% erreichen.
      HINWEIS: Im Allgemeinen dauert es 3-4 Tage, bis die MSCs eine Konfluenz von 80-90% erreicht haben.
2. Subkultivierung humaner WJ-MSCs
   1. Entsorgen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 5 ml 0,25 % Trypsin-Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzu (siehe Materialtabelle). Die Zellen werden bei 37 °C in einem CO₂ -Inkubator 3 Minuten lang inkubiert, bis sich die WJ-MSCs vom Kulturkolben lösen.
   2. Fügen Sie 5 ml Wachstumsmedium mit 10 % fötalem Rinderserum hinzu, um das 0,25 % Trypsin-EDTA zu neutralisieren. Sammeln Sie die Zellmischung und geben Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Waschen Sie den Zellkulturkolben mit 10 ml Wachstumsmedium und sammeln Sie die Zellen in einem 50-ml-Röhrchen mit einer sterilen serologischen Pipette.
   3. Die Zellmischung bei 300 × g 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml Wachstumsmedium und zählen Sie die Anzahl der WJ-MSCs.
      ACHTUNG: Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu entsorgen.
   4. WJ-MSCs je nach Experiment in einer Dichte von 4.000-6.000 Zellen/^cm2 aussäen.
3. Markierung von WJ-MSCs mit DiD-Farbstoff und Aufbereitung von WJ-MSCs für die Injektion in die intraspinale Höhle
   HINWEIS: Das DiD-Farbstoffmarkierungsverfahren wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
   1. Trennen Sie WJ-MSCs, wenn sie eine Konfluenz von 80 % erreichen, indem Sie das oben beschriebene Verfahren anwenden. Suspendieren Sie WJ-MSCs mit einer Dichte von 1 × 10⁶/ml in phenolrotfreiem minimalem essentiellem Medium (MEM) α ohne Serum.
   2. 5 μl DiD-Markierungslösung pro 1 ml Zellsuspension hinzufügen; Vorsichtig durch Pipettieren mischen.
   3. 15 min bei 37 °C inkubieren; Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 × g für 5 min.
   4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die WJ-MSC in phenolrotfreiem MEM-α mit einer Dichte von 1 × 10⁶/0,2 ml.

2. Intraspinale Injektion von WJ-MSCs

1. Vorbereitung für die Injektion in die intraspinale Höhle
   1. Betäubung von 6 Wochen alten Sprague-Dawley-Ratten mit 5 % Isofluran; Halten Sie dann während des gesamten chirurgischen Eingriffs eine Anästhesie mit 2 % Isofluran aufrecht.
      HINWEIS: Optimieren Sie die Anästhesiebedingungen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
   2. Rasieren Sie den Operationsbereich mit einem Elektrorasierer für Kleintiere.
      HINWEIS: Der Elektrorasierer kann durch einen manuellen Rasierer und ein Rasiergel ersetzt werden.
   3. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Povidon-Jod. Einen 3 cm langen Schnitt in die Haut mit einer chirurgischen Klinge setzen. Sezieren Sie das restliche Haut- und Muskelgewebe mit einer chirurgischen Klinge und einer Schere. Zeigen Sie die Dornfortsätze an der Lendenwirbelsäule 2-3 (L2-3).
2. Injektion von DiD-markierten WJ-MSCs über die intraspinale Höhle
   1. Bringen Sie die Ratte in Bauchlage. Beugen Sie die Wirbelsäule der Ratte entsprechend, um den Abstand zwischen den angrenzenden Dornfortsätzen zu vergrößern, und verwenden Sie ausreichend Papiergewebe oder andere Materialien, die dabei helfen können, die richtige Position beizubehalten.
   2. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit 0,2 mL DiD-markierten WJ-MSCs. Platzieren Sie eine 23-g-Spritzen-Nadel-Kombination senkrecht zwischen den Dornfortsätzen von L2 und L3 und führen Sie die Nadel ein, bis sie den Wirbelkörper berührt.
   3. Wenn die Nadel den Wirbelkörper berührt, ziehen Sie sie um ca. 0,5 cm zurück und platzieren Sie die Nadelspitze im Wirbelkanal. Kippen Sie die Spritze und platzieren Sie die Spitze der Nadel so, dass sie in rostrale Richtung zeigt. Injizieren Sie WJ-MSCs über einen Zeitraum von 1 Minute in die Wirbelsäule.
      HINWEIS: Die Geschwindigkeit der Einspritzung sollte im Vorfeld optimiert werden.
   4. Entfernen Sie die Spritze nach der Injektion vollständig aus dem Wirbelkanal. Nähen Sie den Schnitt und desinfizieren Sie dann die Operationsstelle mit Povidon-Jod.
3. Behandlung nach dem Eingriff
   1. Stabilisieren und fixieren Sie die Ratte, um jede Bewegung zu verhindern, indem Sie sie 15 Minuten lang in einem 45°-Winkel auf den Kopf stellen, während sie noch unter Narkose steht. Brechen Sie die Anästhesie nach 15 Minuten ab und warten Sie, bis die Ratte aufgewacht ist.

3. Bewertung der Injektion in die intraspinale Höhle

1. Euthanasie der Ratten und Isolierung des Gehirns und des Rückenmarks 0, 6 und 12 Stunden nach der Injektion
   1. Betäubung der Versuchstiere mit 5% Isofluran; Halten Sie die Anästhesie mit 2% Isofluran während der PBS-Perfusion aufrecht.
   2. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt unterhalb des Zwerchfells. Öffnen Sie den Schnitt mit einer Pinzette und schneiden Sie den Brustkorb rostral, um das Herz freizulegen.
   3. Machen Sie ein kleines Loch in den rechten Vorhof und stechen Sie eine Schmetterlingsnadel in den linken Ventrikel. Perfundieren Sie 100 ml kaltes PBS 4-5 Minuten lang in den linken Ventrikel, bis die Leber vom Blut befreit ist.
   4. Machen Sie nach der Perfusion einen langen Schnitt auf der Rückseite vom Kopf bis zum Schwanz mit einer chirurgischen Klinge entlang der Längsebene. Isolieren Sie das verbleibende Gehirn und die gesamte Wirbelsäule mit einer chirurgischen Schere, einer Pinzette und einem Knochenschneider. Entferne die restlichen Rippen, die verbundenen Knochen und das Fleisch.
2. Optische Ex-vivo-DiD-Fluoreszenzbildgebung
   1. Legen Sie das isolierte Gewebe in die Kammer des optischen Bildgebungsgeräts.
   2. Stellen Sie die Parameter wie folgt ein: Emission, 700 nm; Anregung, 605 nm; und Belichtungszeit, 2 Sekunden, als Photonen pro Sekunde pro Zentimeter zum Quadrat pro Steradiant (p/s/cm²/sr). Nehmen Sie die optischen Bilder auf.
      HINWEIS: Alle Bilder sollten mit identischen Beleuchtungseinstellungen (Lampenspannung, Filter, Blende, Sichtfeld und Binning) aufgenommen werden.
   3. Zeichnen Sie mit dem Zeichenwerkzeug drei rechteckige Regionen von gleicher Größe (Regions of Interest, ROIs) gleicher Größe für das Rückenmark und einen Kreis-ROI für das Gehirn. Messen Sie die Fluoreszenzintensitäten der ROIs.
3. Extraktion von genomischer DNA (gDNA) aus dem Rückenmark und dem Hirngewebe
   1. Entferne den Schädel und die Wirbelsäule vorsichtig mit einer chirurgischen Zange, einer Schere und einem Rongeur.
   2. Entnahme des Gehirns und des Rückenmarks aus dem Schädel und der Wirbelsäule. Schneide das Rückenmark in drei Stücke (Hals-, Brust- und Lendenwirbelsäule).
      HINWEIS: Die entnommenen Gewebe müssen bei -80 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort analysiert werden.
   3. Mahlen Sie die Taschentücher mit einem vorgekühlten Mörser, Stößel und flüssigem Stickstoff. Extrahieren Sie gDNA mit kommerziellen Produkten gemäß den Anweisungen des Herstellers.
4. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
   1. Quantifizieren Sie die Menge an gDNA in jeder Probe mit einem Spektralphotometer.
   2. Durchführung der qPCR mit 10 ng gDNA pro Probe und humanen Arthrobacter luteus (ALU)-Primern^12,21.
   3. Die genaue Anzahl der WJ-MSC in den Proben wird nach der ΔΔC_T-Methode ²² berechnet.

Ergebnisse

Um die Wirksamkeit der intraspinalen Injektion von MSCs in die intraspinale Höhle zu bewerten, wurden in der vorliegenden Studie DiD-markierte MSCs verwendet. Vor der Injektion von MSCs in die Wirbelsäulenhöhle wurde die Wirksamkeit der Markierung in vitro mittels optischer Bildgebung und Fluoreszenzmikroskopie beurteilt (Abbildung 1). Nach der Färbung der MSCs mit dem DiD-Markierungsreagenz unter Verwendung des in Protokollabschnitt 3.1 beschriebenen Verfahrens wurden optische Bilder der Ku...

Diskussion

Der optimale Verabreichungsweg für die Behandlung mit MSCs sollte in Abhängigkeit von der Zielerkrankung, dem Zustand des Patienten und der Art des zu verabreichenden Arzneimittels gewählt werden. Bei Zelltherapien, einschließlich der MSC-Therapie, muss eine direkte Injektion von Stammzellen in das Gehirn oder intrathekal über den Liquor in Betracht gezogen werden, da die Zellen die BHS^{nicht passieren können 19}. Die Injektion in die intraspinale Höhle ist relativ ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25 % Trypsin-EDTA	Gibco-invitrogen	25200114	Zellkultur
Fötales Rinderserum	biowest	S1520	Nährmedium
Ergänzung Gentamicin	Gibco-invitrogen	15710-072	Nährmedium Ergänzung
Gentra Puregene Tissue Kit	QIAGEN	158689	gDNA Isolierung
MEM, kein Glutamin, kein Phenolrot	Gibco	51200038	WJ-MSC Fomulation zur Injektion
Miminum Essential Medium alpha	Gibco-invitrogen	12571063	WJ-MSC Kulturmedium
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4368577	quantitatives real-time PCR Reagenz
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo fisher	4485694	quantitative real time PCR
trypan blue	Gibco	15250061	Injektion
Vybrant DiD Zellmarkierungslösung	invitrogen	V22887	Stammzellmarkierungslösung
Xenogen IVIS Spectrum System	Perkin Elmer	124262	Optisches Bildgebungsgerät