Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein neues Rattenmodell der aktiven HIV-Infektion mit chimärem HIV (EcoHIV) zu etablieren, das entscheidend ist, um unser Verständnis von HIV-1-Virusreservoirs im Gehirn zu verbessern und ein System zur Untersuchung von HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen und damit verbundenen Komorbiditäten (dh Drogenmissbrauch) anzubieten.
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Methodenartikel
Ein Rattenmodell der EcoHIV-Gehirninfektion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es wurde gut untersucht, dass das EcoHIV-infizierte Mausmodell bei der Untersuchung von HIV-assoziierten neurologischen Komplikationen von erheblichem Nutzen ist. Die Etablierung des EcoHIV-infizierten Rattenmodells für Studien zu Drogenmissbrauch und neurokognitiven Störungen wäre bei der Untersuchung von neuroHIV- und HIV-1-assoziierten neurokognitiven Störungen (HAND) von Vorteil. In der vorliegenden Studie demonstrieren wir die erfolgreiche Erstellung eines Rattenmodells der aktiven HIV-Infektion mit chimärem HIV (EcoHIV). Zunächst wurde das lentivirale Konstrukt von EcoHIV 48 Stunden lang in kultivierten 293 FT-Zellen verpackt. Dann wurde das bedingte Medium konzentriert und titeriert. Als nächstes führten wir bilaterale stereotaktische Injektionen des EcoHIV-EGFP in F344/ N Rattenhirngewebe durch. Eine Woche nach der Infektion wurden EGFP-Fluoreszenzsignale im infizierten Hirngewebe nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass EcoHIV bei Ratten erfolgreich eine aktive HIV-Infektion induziert. Zusätzlich wurde eine Immunfärbung für den mikroglialen Zellmarker Iba1 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Mikroglia der vorherrschende Zelltyp waren, der EcoHIV beherbergte. Darüber hinaus zeigten EcoHIV-Ratten Veränderungen in der zeitlichen Verarbeitung, einen möglicherweise zugrunde liegenden neurobehavioralen Mechanismus von HAND sowie synaptische Dysfunktion acht Wochen nach der Infektion. Insgesamt erweitert die vorliegende Studie das EcoHIV-Modell der HIV-1-Infektion auf die Ratte und bietet ein wertvolles biologisches System, um HIV-1-Virusreservoirs im Gehirn sowie HAND und damit verbundene Komorbiditäten wie Drogenmissbrauch zu untersuchen.
Einleitung
Biologische Systeme haben unser Verständnis von HIV-1-assoziierten neurokognitiven Störungen (HAND) und ihren zugrunde liegenden neuronalen Mechanismen verbessert2. Die Bestimmung, welches biologische System für eine bestimmte Studie am besten geeignet ist, hängt oft von der Frage des Interesses ab2. Die Begrenzung der Bandbreite der Wirtstiermodelle stellt Studien zur Entwicklung der HIV-1-Krankheit in Den mittelpunkt. Um die HIV-1-Virusreplikation und Pathogenese zu untersuchen, erstellten Potash et al.3 ein Mausmodell der aktiven HIV-1-Infektion, das die kodierende Region des HIV-Oberflächenhüllenglykoproteins gp120 durch ökotropes MLV gp80 ersetzte, was zu einer erfolgreichen Virusreplikation bei Mäusen führte4. Nach Injektionen von Schwanzvenen bei chimären HIV-Mäusen (EcoHIV) wurden viele Merkmale beobachtet, die denen von HIV-1-seropositiven Personen ähneln (z. B. infizierte Lymphozyten und Makrophagen, die auf antivirale Immunantworten abzielen, und Entzündungen3,5,6).
Obwohl Mäuse und Ratten beide Mitglieder der Muridae sind, können grundlegende Artenunterschiede ihre Eignung für spezifische experimentelle Fragen beeinflussen7. Daher wäre die Ausweitung des EcoHIV-Infektionsmodells auf Ratten (häufig in Studien zu Drogenmissbrauch und neurokognitiven Störungen verwendet) bei der Untersuchung von neuroHIV von Vorteil. Zum Beispiel macht ihre größere Größe die Implantation von Jugularkathetern für Selbstverabreichungsverfahren von Medikamenten praktischer8. Techniken der Selbstverabreichung von Medikamenten bei Ratten wurden verwendet, um die Motivation bei HIV-19zu bewerten. Darüber hinaus wurden viele neurokognitive / verhaltende Aufgaben ursprünglich für Ratten entwickelt10. Hier berichten wir über die Verwendung stereotaktischer Injektionen von EcoHIV bei Ratten, um das EcoHIV-Infektionsmodell zu erweitern und eine wichtige Gelegenheit zu bieten, neue Fragen im Zusammenhang mit neuroHIV und HAND zu beantworten.
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Protokoll
Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of South Carolina überprüft und genehmigt (Bundesversicherungsnummer: D16-00028). Sechs erwachsene männliche F344/ N-Ratten wurden in einer kontrollierten Umgebung unter einem 12/12 Light: Dark-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Alle Tiere wurden nach Richtlinien gepflegt, die von den National Institutes of Health im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren festgelegt wurden.
1. Virusverpackung in 293 FT-Zellen
- Die 293 FT-Zellen (5×105/ml) werden in gelatinebeschichteten 75 cm2 Kolben mit DMEM plus 10% FBS11 kultiviert. Züchten Sie Zellen bei 37 °C, um bei der Transfektion zu 50% konfluent zu sein.
- 22,5 μL Transfektionsreagenz (z. B. Lipofectamin 3000) in 750 μL Medium (z. B. Opti-MEM) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Wirbel für 3 s verdünnen.
- 20 μg EcoHIV-Plasmid-DNA in 750 μL Medium in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen verdünnen und gut mischen.
- Verdünnte DNA in die Tube des verdünnten Transfektionsreagenzes geben und vorsichtig mischen. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Mischung wird in 10 ml vorgewärmtes DMEM-Medium in 75 cm2 Kolben geben. Inkubieren Sie die Zellen für 2 Tage bei 37 °C.
- Ernten und kombinieren Sie 24 ml konditioniertes Medium aus den beiden Kolben, die das verpackte Lentivirus enthalten.
- Zentrifugieren Sie alle 24 ml Konditionalmedium bei 500 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Den geklärten Überstand in ein steriles 50 ml Röhrchen geben.
- Kombinieren Sie 8 ml Lenti-x-Konzentrator mit 24 ml geklärten Überstand (Verhältnis 1:3). Mischen Sie durch sanfte Inversion. Mischung bei 4 °C für zwei Tage inkubieren.
- Zentrifugenmischung bei 1.500 x g für 45 Minuten bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 100 μL 100 mM PBS.
- Titerviruskonzentration mit einem p24 ELISA-Kit.
2. EcoHIV-EGFP Virus stereotaxische Operationen
- Anästhesieren Sie Ratten mit 3% Sevofluran. Fahren Sie mit Schritt 2.2 fort, wenn die Ratten nicht auf schädliche Reize reagieren und Reflexe fehlen.
- Rasieren Sie die Haare aus der Gehirnregion und sterilisieren Sie die Haut zweimal mit 70% Ethanol und einem Peeling auf Chlorhexidinbasis. Sichern Sie die Ratte in Bauchlage im stereotaxischen Apparat.
- Machen Sie einen Schnitt (5-6 cm) durch die Haut entlang der Kopfhautmittellinie.
- Markieren Sie zwei Bohrpositionen bei 0,8 mm seitlich, 1,2 mm rostral bis bregma. Bohren Sie in jede Schädelposition ein Loch (Durchmesser 0,4 mm).
- Füllen Sie titerierte EcoHIV-Lentiviruslösung (1,04 × 106 TU/ml) in eine 10 μL Injektionsspritze. Befestigen Sie die Spritze am stereotaktischen Gerät.
- Bewegen Sie die Nadel nahe an die Oberfläche des Bohrlochs. Messen und bewegen Sie 2,5 mm in der Tiefe.
- 1 μL Viruslösung mit einer Rate von 0,2 μL/min infundieren. Halten Sie die Nadel 5 Minuten lang im Injektionsbereich. Bewegen Sie die Nadel langsam nach oben, bis sie sich außerhalb des Rattenschädels befindet.
- Nähen Sie die Haut mit einem 4-0 Seidenfaden.
- Sterilisieren Sie den Schnitt einmal mit 70% Ethanol. Subkutane Injektion von Butorphenol (Dorolex, 0,1 mg/kg Körpergewicht).
- Die Ratte mit einem Heizkissen in eine Aufwachkammer bringen, bis sie aufwacht.
3. Visualisierung von Hirnschnitten
HINWEIS: Warten Sie ein bis acht Wochen nach der EcoHIV-Virusinfusion.
- Betäuben Sie die Ratte mit 5% Sevofluran. Fahren Sie mit Schritt 3.2 fort, wenn die Ratten nicht auf schädliche Reize reagieren und Reflexe fehlen.
- Befestigen Sie die Ratte in Rückenlage in einem Abzug.
- Schneiden Sie die Haut entlang der thorakalen Mittellinie. Schneiden Sie das Zwerchfell ab und öffnen Sie die Brusthöhle.
- Führen Sie eine 20 G × 25 mm Nadel in den linken Ventrikel ein.
- Öffnen Sie sofort das rechte Atrium mit einer Schere.
- 50 ml vorgefertigtes 100 mM PBS mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min perperieren.
- 100 ml kaltes 4% Paraformaldehyd mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min perfundieren.
- Enthaupten Sie die Ratte, öffnen Sie die Kopfhaut und entfernen Sie das Gehirn.
- Postfix über Nacht mit 4% Paraformaldehyd.
- Übertragen Sie das Gehirn auf 40 ml 30% Saccharose in 100 mM PBS in 50 ml Röhrchen, bis das Gehirn nach unten schwebt (ca. 3 Tage).
- Schnappen Sie das Gehirn in Methylbutanol für 2 min bei - 80 °C ein.
- Sichern Sie das Hirngewebe auf einer Metallplattform in einem -20 °C Kryostaten.
- Schneiden Sie 50 μm dicke koronale Abschnitte mit dem Kryostaten.
- Übertragen Sie die Gehirnscheiben mit einem feinen Pinsel auf Glasobjektträger.
- Montageabschnitte in 0,3 mL Antifademedium und Abdeckung mit 22 mm 50 mm Deckrippen.
- Halten Sie die Glasobjektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur, bis sie trocken sind.
- Stellen Sie die anvisierten Neuronen mit einem konfokalen Mikroskop mit Z-Stack ab, der auf den Grenzen der Hirnregion und den morphologischen Merkmalen der Neuronen basiert.
HINWEIS: Die verwendeten konfokalen Mikroskopeinstellungen waren: Vergrößerung von 60 X (A/1,4, Öl) und ein Z-Ebenenintervall von 0,15 μm (Lochgröße 30 μm; rückprojektierter Lochradius 167 nm) mit einer Wellenlänge von 488 nm.
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Ergebnisse
Das konditionierte Medium wurde aus Lentivirus von EcoHIV-EGFP-infizierten 293FT-Zellen entnommen. Als nächstes wurde es konzentriert und titeriert, dann stereotrisch in das Gehirn (kortikale Region) von F344 / N-Ratten injiziert. Sieben Tage nach der Injektion wurden Ratten geopfert und Bilder von koronalen Hirnschnitten von Bregma 5,64 mm bis Bregma -4,68 mm aufgenommen. In Abbildung 1Agibt es signifikante EcoHIV-EGFP-Signale im gesamten Gehirn, insbesondere im Kortex und im Gyrus hippocam...
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Diskussion
In diesem Protokoll haben wir ein EcoHIV-induziertes HIV-Infektionsmodell bei Ratten etabliert. Insbesondere beschrieben wir eine bilaterale stereotaktische Injektion von EcoHIV in den Kortex, die 7 Tage nach der Injektion erfolgreich eine aktive HIV-Infektion im Rattengehirn induzierte. Darüber hinaus zeigen wir, dass ecoHIV-Infektionen bei Ratten ein gutes biologisches System sein könnten, um Schlüsselaspekte von HAND zu untersuchen. Acht Wochen nach der EcoHIV-Infektion zeigten Ratten signifikante neurokognitive Beein...
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Offenlegungen
Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu erklären.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse HD043680, MH106392, DA013137 und NS100624 finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 293FT Zellen | ThermoFisher Scientific | R70007 | |
| Antibiotisch-Antimykotische Lösung | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Corning BioCoatGelatin 75cm² Rechteckige Zellkulturflasche mit schrägem Hals und belüfteter Kappe | Life Technologies | 354488 | |
| Corning DMEM mit L-Glutamin, 4,5 g/l Glukose und Natriumpyruvat | Life Technologies | 10013CV | |
| Deckglas | VWR | 637-137 | |
| Bohrer | |||
| Dumont #5 Pinzette | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Pinzette | World Precision Instruments | 14097 | |
| Eppendorf Snap-Cap Mikrozentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes | Life Technologies | 22600028 | |
| Ethicon Vicryl Plus antibakteriell, 4-0 Polyglactin 910 Naht, 27in. FS-2 | Med Vet International | VCP422H | |
| Hamilton Spritze | Hamilton | 1701 | |
| Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz | Life Technologies | L3000015 | |
| Irispinzette | World Precision Instruments | 15914 | |
| Irisschere | World Precision Instruments | 500216 | |
| Lentivirus-assoziiertes p24-ELISA-Kit | Cell Biolabs, Inc. | VPK-107-5 | |
| Lenti-X Konzentrator | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 11058021 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyd | Sigma | P6148 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| Sevofluran | Merritt Veterinärbedarf | 347075 | |
| stereotaktische Geräte | Kopf Instruments | Modell 900 | |
| SuperFrost Plus Objektträger | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Vannas Schere | World Precision Instruments | 500086 |
Referenzen
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- Potash, M. J., et al. A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).
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