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Methodenartikel

Untersuchung von aktivierten olfaktorischen sensorischen Neuronen der Maus durch kombinierte Immunfärbung und in situ Hybridisierung

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DOI:

10.3791/62150

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11. April 2021

 ,  , 
1Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of Biology, University of Campinas, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Campinas

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll kombiniert In-situ-Hybridisierung mit Immunfluoreszenz, um olfaktorische und vomeronasale Rezeptorgene zu identifizieren, die in olfaktorischen sensorischen Neuronen exprimiert werden, nachdem sie durch chemische Stimuli in der Maus aktiviert wurden.

Zusammenfassung

Tiere sind auf chemische Kommunikation angewiesen, um relevante Umweltinformationen zu vermitteln und wahrzunehmen, die von der Bewertung der Lebensmittelqualität bis hin zur Erkennung verfügbarer Paarungspartner oder Bedrohungen reichen. Bei Mäusen wird diese Aufgabe hauptsächlich vom olfaktorischen System und seinen zugrunde liegenden Subsystemen, einschließlich des Haupt- und des akzessorischen olfaktorischen Systems, ausgeführt. Beide haben periphere Organe, die von sensorischen Neuronen besiedelt sind, die G-Protein-gekoppelte Rezeptoren exprimieren, die in der Lage sind, chemische Signale zu binden, die die Nasenhöhle erreichen. Obwohl die molekularen Eigenschaften dieser Rezeptoren gut verstanden sind, ist nur wenig über ihre verwandten spezifischen Liganden bekannt. Das hier beschriebene Verfahren kombiniert den in situ Hybridisierungsnachweis von olfaktorischen oder vomeronasalen Rezeptoren mit dem Immunnachweis des phosphorylierten ribosomalen Proteins S6 (pS6) - einem Marker für die neuronale Aktivierung. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Neuronen zu identifizieren, die nach einem einzigen Ereignis der Exposition gegenüber gereinigten oder komplexen chemischen Reizen aktiviert wurden, die von den Riechorganen erkannt wurden. Wichtig ist, dass diese Technik die Untersuchung von Neuronen ermöglicht, die in biologisch relevanten Kontexten ausgelöst wurden. Idealerweise sollte diese Methode verwendet werden, um die Molekularbiologie des Geruchssystems zu untersuchen und das Geruchsverhalten zu untersuchen.

Einleitung

Chemosignalisierung ist die am weitesten verbreitete Form der Kommunikation bei Tieren. Bei Säugetieren wird die Erkennung chemischer Signale hauptsächlich durch den Geruchssinn vermittelt und ist von größter Bedeutung für die Nahrungssuche, die Lokalisierung möglicher Paarungspartner und die Vermeidung potenzieller Raubtiere 1,2,3. Das olfaktorische System der Maus wird weiter in verschiedene Subsysteme unterteilt, die jeweils ihre eigenen anatomischen, physiologischen und molekularen Eigenschaften haben4. Unter diesen sind das Hauptolfaktorische System (MOS) und das akzessorische Geruchssystem (AOS) die am besten untersuchten und besser charakterisierten.

Das MOS ist hauptsächlich für den Nachweis flüchtiger chemischer Moleküle verantwortlich, die die Nasenhöhle erreichen. Dies wird durch olfaktorische sensorische Neuronen (OSNs) erreicht, die die sensorische Schnittstelle des Systems bevölkern - das olfaktorische Hauptepithel (MOE). Jedes OSN exprimiert einen von Tausenden von Geruchsrezeptoren (ORs) auf monogene und monoallelische Weise5. Darüber hinaus neigen OPs dazu, breit abgestimmt zu sein6, und ein einzelner Odorant kann an mehr als einen OP binden, wodurch ein kombinatorischer Code für Gerüche7 erzeugt wird.

Das AOS wiederum ist hauptsächlich für den Pheromon- und Kairomonnachweis verantwortlich. Diese Liganden aktivieren vomeronasale sensorische Neuronen (VSNs) im vomeronasalen Organ (VNO). VSNs in der apikalen Zone des VNO exprimieren Rezeptoren aus der vomeronasalen Rezeptor-1-Familie (V1Rs)8, während Neuronen in der basalen Zone die vomeronasale Rezeptor-2-Familie (V2Rs)9 exprimieren. Wichtig ist, dass gezeigt wurde, dass einige VSNs mehr als einen vomeronasalen Rezeptor koexprimieren 10,11,12.

Trotz aller verfügbaren Informationen über die molekularen Eigenschaften von ORs und VRs ist das Wissen über ihre verwandten Liganden noch sehr begrenzt. Die Identifizierung spezifischer olfaktorischer Neuronen, die für die Erkennung eines Moleküls oder komplexen Reizes verantwortlich sind, ist eine wichtige Aufgabe für diejenigen, die den Geruchssinn, das olfaktorische Verhalten und die physiologischen Reaktionen untersuchen. Es wurden mehrere Strategien zur Entwaisung von Geruchsrezeptoren versucht, darunter Calcium-Imaging7, Einzelzell-RNA-Sequenzierung13,14, heterologe Rezeptorexpression15 und Strategien, die auf unmittelbaren frühen Genen (IEGs) basieren16. In jüngerer Zeit wurden einige Techniken eingesetzt, um die modulatorischen Wirkungen von Geruchsstoffen in sensorischen Neuronen zu bewerten, wobei in vivo Calcium-Imaging17,18 und mit Fluoreszenzproteinen markierte Einzelzell-RNA-Sequenzierungsstrategien19 verwendet wurden. Die meisten dieser Techniken erfordern einen künstlichen Aufbau oder werden an dissoziierten Neuronen durchgeführt, so dass es unmöglich ist, Verhaltensweisen, die durch die verwendeten Gerüche ausgelöst werden, gleichzeitig zu bewerten.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Identifizierung von sensorischen Neuronen, die nach einem einzigen Ereignis der Geruchsexposition aktiviert werden, indem Ribosonden, die spezifische ORs oder VRs detektieren, mit der Immundetektion von phosphoryliertem S6-Ribosomenprotein (pS6), einem Proxy für die neuronale Aktivierung, kombiniert werden. Diese Methode ist eine zuverlässige Methode, um die Identität von sensorischen Neuronen, die durch verschiedene Chemosignale aktiviert werden, in einem biologisch relevanten Kontext zu untersuchen.

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Protokoll

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Tierprotokoll #1883-1 durchgeführt, das von der Universität Campinas (Institute of Biology's Institutional Animal Care and Use Committee - Committee for Ethics in Animal Use in Research) genehmigt wurde und den Richtlinien des föderalen Nationalen Rates für die Kontrolle von Tierversuchen (CONCEA) folgt.

1. Materialvorbereitung

  1. 1 L 3% H2O2 (v/v) in 1x PBS zubereiten. 100 mL, 10× PBS und 100 mL 30 %H2O2 in 500 mL Reinstwasser verdünnen. Vervollständigen Sie das Volumen mit Reinstwasser. Bereiten Sie diese Lösung unmittelbar vor der Verwendung vor.
  2. Bereiten Sie eine befeuchtete Kammer mit fusselfreien Labortüchern vor, die mit 5× SSC-Lösung angefeuchtet sind.
  3. Bereiten Sie Hybridisierungswaschlösungen vor: 5× SSC (bei 55 °C), 2× SSC (55 °C), 0,2× SSC (55 °C) und 0,1× SSC (55 °C und Raumtemperatur). Die entsprechenden Volumina von 20× SSC-Stammlösung in RNase-freiem Reinstwasser auflösen. Die verdünnten Lösungen werden vor Beginn jedes Versuchs frisch zubereitet.
  4. Immunhistochemische Blockierungslösung herstellen: 1× PBS/1 % BSA/0,1 % Triton X-100. Für 100 ml verdünnen Sie 10 ml 10 × PBS, 10 ml 10 % BSA und 3,33 ml 3 % Triton X-100 in 70 ml Reinstwasser. Vervollständigen Sie das Volumen mit Reinstwasser. Die verdünnten Lösungen werden vor Beginn jedes Versuchs frisch zubereitet.
  5. PTw-Lösung herstellen: 1× PBS/0,1 % Tween-20. Für 100 ml verdünnen Sie 1 ml 10 % Tween-20 und 10 ml 10 × PBS in 70 ml Reinstwasser. Vervollständigen Sie das Volumen mit Reinstwasser. Bereiten Sie diese Lösung vor Beginn jedes Experiments frisch zu.
  6. Bereiten Sie RNase-freie 0,1 M Triethanolaminlösung vor. Für 250 ml verdünnen Sie 3,33 ml Triethanolamin in Reagenzqualität in 200 ml RNase-freiem Reinstwasser unter Rühren (verwenden Sie bei der Zubereitung dieser Lösung RNase-freie Glaswaren und Magnetrührer). Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 8,0 ein. Ergänzen Sie das Volumen mit RNase-freiem Reinstwasser und lagern Sie es bis zur Verwendung lichtgeschützt. Bereiten Sie diese Lösung vor Beginn jedes Experiments frisch zu.
  7. Bereiten Sie RNase-freies 0,1 % H2O2 (v/v) in 1× PBS zu. Für 1 l verdünnen Sie 100 mL 10× PBS und 3,3 mL 30 % H2O2 in 500 mL RNasefreiem Reinstwasser. Vervollständigen Sie das Volumen mit RNase-freiem Reinstwasser. Bereiten Sie diese Lösung unmittelbar vor der Verwendung vor.
  8. Bereiten Sie RNase-freie Lösungen der folgenden Stoffe vor: 0,2 M HCl; 1 M Tris-HCl pH 8,0; 10 mg/ml Hefe-tRNA; 10 % Sicherheitsdatenblatt; 10× PBS; 100× Denhardts Lösung; 20× SSC; 50% Dextransulfat; 6 M HCl
  9. Bereiten Sie RNase-freie 4%ige Paraformaldehyd-Fixierlösung vor. Für 100 mL lösen Sie 4 g Paraformaldehyd in 80 mL 1× PBS. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M NaOH auf 7,4 ein. Vervollständigen Sie den Band mit 1× PBS. Diese Lösung muss vor Beginn jedes Versuchs frisch zubereitet werden.
    Vorsicht: Paraformaldehyd ist ein gefährlicher Stoff, der beim Einatmen potenziell schädlich sein kann. Bereiten Sie die Lösung unter einem Abzug vor und tragen Sie Schutzhandschuhe, Maske und Schutzbrille.
  10. Bereiten Sie RNase-freie Dissektionslösung vor: 30 % Saccharose/0,45 M EDTA, pH 8,0/1× PBS. Für 100 mL 30 g Saccharose in 60 mL RNase-freiem 0,5 M EDTA pH 8,0 auflösen. Fügen Sie 10 ml 10× PBS hinzu. Vervollständigen Sie das Volumen mit RNase-freiem 0,5 M EDTA pH 8,0.
  11. Bereiten Sie RNase-freie Messzylinder und Becher aus Glas oder Kunststoff vor.
  12. Bereiten Sie RNase-freie Prähybridisierungs- und Hybridisierungslösungen vor: 50 % deionisiertes Formamid (v/v)/600 mM NaCl/200 μg/ml Hefe-tRNA/0,25 % SDS (w/v)/10 mM Tris-HCl pH 8,0/1× Denhardt-Lösung/1 mM EDTA pH 8,0/10 % Dextransulfat (w/v). Für 10 ml in einem Messzylinder fügen Sie 5 ml deionisiertes Formamid, 1,2 ml 5 M NaCl, 200 μl 10 mg/ml Hefe-tRNA, 250 μl 10 % SDS, 100 μl 1 M Tris-HCl pH 8,0, 200 μl 50 × Denhardt-Lösung, 20 μl 500 mM EDTA pH 8,0 und 2 ml 50 % Dextransulfat (MW 500.000) hinzu. Vervollständigen Sie das Volumen mit RNase-freiem Reinstwasser. Bereiten Sie diese Lösung vor Beginn jedes Experiments frisch zu.
    HINWEIS: Dextransulfat ist sehr viskos. Es ist ratsam, zusätzliche 20 % des Gesamtvolumens der Hybridisierungs-/Prähybridisierungslösungen vorzubereiten, um Pipettierfehler zu berücksichtigen. Hefe-tRNA kann in der Prähybridisierungslösung weggelassen werden, falls gewünscht.
  13. Abdeckgläser aus thermoplastischen Laborfolien vorbereiten. Schneiden Sie rechteckige thermoplastische Laborfolienstücke 1-2 mm kürzer als die Länge und Breite eines Objektträgers.
  14. TN-Puffer vorbereiten: 100 mM Tris-HCl/150 mM NaCl. Für 100 mL 10 mL 1 M Tris-HCl pH 7,5 und 3 mL 5 M NaCl in 70 mL Reinstwasser verdünnen. Vervollständigen Sie das Volumen mit Reinstwasser. Bereiten Sie diese Lösung vor Beginn jedes Experiments frisch zu.
  15. Vorbereitung des TNB-Blockierungspuffers: 0,5 % Blockierungsreagenz A (w/v) im TN-Puffer. Für 200 mL 1 g Blockierungsreagenz A in 200 ml TN-Puffer auflösen (siehe Materialtabelle für kommerzielle Quelle für Blockierungsreagenz A).
  16. TNT-Puffer vorbereiten: 0,05 % Tween-20 im TN-Puffer. Für 1 l 5 ml 10 % Tween-20 in 950 ml TN-Puffer verdünnen. Vervollständigen Sie das Volumen langsam mit TN-Puffer, um Schaumbildung zu vermeiden. Bereiten Sie diese Lösung vor Beginn jedes Experiments frisch zu.
  17. Bereiten Sie Tyramid-Alexa 488 Arbeitslösung vor: 1× Amplifikationspuffer A/0,0015% H2O2/1:100 Tyramid-Alexa 488. Für 100 μl verdünnen Sie 1 μl 0,15 % H2O2 und 1 μl Tyramid-Alexa 488 in 98 μl Amplifikationspuffer A (siehe Materialtabelle für kommerzielle Quellen von Tyramid-Alexa 488 und Amplifikationspuffer A). Bereiten Sie diese Lösung unmittelbar vor der Verwendung vor.
  18. Bereiten Sie Tyramid-Alexa 555 Arbeitslösung vor: 1× Amplifikationspuffer A/0,0015% H2O2/1:100 Tyramid-Alexa 555. Für 100 μl 1 μl 0,15 % H, 2O2 und 1 μl Tyramid-Alexa 555 in 98 μl Amplifikationspuffer A verdünnen (siehe Materialtabelle für kommerzielle Quellen von Tyramid-Alexa 555 und Amplifikationspuffer A). Bereiten Sie diese Lösung unmittelbar vor der Verwendung vor.
  19. Tyramid-Biotin-Arbeitslösung herstellen: 1× Amplifikationspuffer B/0,0015 % H2O2/1:50 Tyramid-Biotin. Für 100 μl 1 μl 0,15 % H, 2O, 2 und 2 μl Tyramid-Biotin in 97 μl Amplifikationspuffer B verdünnen (siehe Materialtabelle für kommerzielle Quellen für Tyramid-Biotin und Amplifikationspuffer B). Bereiten Sie diese Lösung unmittelbar vor der Verwendung vor.
  20. Gläser bei 200 °C mindestens 4 h backen. Behandeln Sie nicht wegwerfbare Kunststoffartikel (einschließlich Objektträger, Coplin-Dosen und Spritzen) 15-30 Minuten lang mit 3 % H2O2 , gefolgt von einer gründlichen Reinigung unter RNasefreiem Wasser. Behandeln Sie Metallinstrumente aus Edelstahl, wie z. B. Präparierwerkzeuge, Pinzetten und Kryostaten-Probenhalter, 15 Minuten lang mit 3 % H2O2 , gefolgt von einer gründlichen Reinigung unter RNase-freiem Wasser. Reinigen Sie Bankoberflächen, Heizplatten und Trockenblöcke mit der RNase-Reinigungslösung.

2. Synthese der Ribosonde

HINWEIS: Das folgende Verfahren zur Synthese von 1 kb Digoxigenin-markierten cRNA-Sonden für die in situ Hybridisierung mittels in vitro Transkription basiert auf den zuvor veröffentlichten Protokollen 20,21,22,23.

  1. Verwenden Sie geeignete Oligonukleotid-Primerpaare, um ein 1 kb großes DNA-Fragment aus dem interessierenden Gen (z. B. dem Geruchsrezeptor-Gen) zu amplifizieren. Wählen Sie Primerpaare aus, die eine Region amplifizieren, die in der zu detektierenden reifen mRNA vorhanden ist (z. B. die kodierende Sequenz des Gens). Eine Auswahl an Primern für verschiedene Geruchsrezeptoren finden Sie in der Materialtabelle. Einzelheiten zu Sonden zum Nachweis anderer vomeronasaler Geruchsrezeptoren finden Sie in früheren Publikationen16,21.
  2. Lassen Sie die PCR-Produkte auf einem 0,8%igen Agarose-Gel laufen und entfernen Sie die gewünschte 1 kb-Bande.
  3. Reinigen Sie das DNA-Fragment mit einem geeigneten Mini-Säulen-Aufreinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  4. Quantifizieren Sie das gereinigte DNA-Fragment und klonen Sie es in einen geeigneten PCR-Klonierungsvektor gemäß dem Protokoll des Herstellers. Es ist ratsam, Klonierungsvektoren zu verwenden, die T7- und SP6-RNA-Polymerase-Promotoren enthalten, die das klonierte Amplikon flankieren.
  5. Verwandeln Sie das rekombinante Plasmid durch chemische Umwandlung oder Elektroporation gemäß dem Protokoll des Herstellers in kompetente rekombinationsfreie Bakterien.
  6. Isolierte transformative Bakterienkolonien werden in reichhaltiges Medium eingesät und das Plasmid über ein DNA-Minipräparat gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert.
  7. Führen Sie eine Restriktionsverdauungsanalyse mit geeigneten Restriktionsenzymen und/oder eine Sanger-Sequenzierung durch, um die Identität und Ausrichtung des eingefügten DNA-Fragments gemäß dem Protokoll des Herstellers zu überprüfen.
  8. Führen Sie einen Restriktionsverdau durch, um 10 μg des Plasmids unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms zu linearisieren. Um eine Anti-Sense-Ribosonde nach der In-vitro-Transkription herzustellen, wird ein Restriktionsenzym verwendet, das die Plasmid-DNA am Ende des Inserts gegenüber dem RNA-Polymerase-Promotor verdaut, der sich stromabwärts der kodierenden Sequenz des Gens befindet. Um nach der In-vitro-Transkription Sense-Ribosonden herzustellen, wird ein Restriktionsenzym verwendet, das die Plasmid-DNA am Ende des Inserts gegenüber dem RNA-Polymerase-Promotor verdaut, der sich stromaufwärts der kodierenden Sequenz des Gens befindet.
  9. Führen Sie ein Aliquot des Plasmidlinearisierungsreaktionsprodukts auf einem 0,8%igen Agarosegel durch, um die Vollständigkeit des Aufschlusses zu bestätigen. Sobald die vollständige Linearisierung bestätigt ist, reinigen Sie den Rest der Reaktion mit einem säulenbasierten PCR-Aufreinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  10. Synthetisieren Sie Digoxigenin-markierte cRNA-Sonden durch In-vitro-Transkription unter Verwendung von 1-2 μg des linearisierten Plasmids als Matrize, dem entsprechenden Enzym (z. B. T7- oder SP6-RNA-Polymerase) und einem geeigneten Digoxigenin (DIG)-Markierungskit.
  11. Entfernen Sie das DNA-Template aus der Reaktion, indem Sie es 30 Minuten lang mit DNase I bei 37 °C verdauen.
  12. Aufreinigen Sie die cRNA-Sonden entweder mit einem Minisäulen-basierten RNA-Aufreinigungskit oder einem auf Gelfiltration basierenden Aufreinigungskit. Eluieren Sie die resultierende Sonde in 50 μl RNase-freiem Wasser.
  13. Quantifizieren Sie die resultierende Ribosonde, vorzugsweise mit fluorometrischen Methoden. In der Regel liegt die erwartete Ausbeute bei über 100 ng/μL.
  14. Führen Sie die Riboprobe auf einem automatisierten Elektrophoresesystem oder auf einem RNase-freien 0,8%igen Agarosegel aus, um die Sondenqualität und den Abbau zu überprüfen.
  15. Lagern Sie die synthetisierte Sonde bis zur Verwendung bei -80 °C.

3. Exposition von Mäusen gegenüber Geruchsreizen

  1. Halten Sie jedes Tier vor der Exposition mindestens 24 Stunden lang einzeln in einem sauberen Käfig. Entfernen Sie den Futterrost mindestens 2 Stunden vor der Exposition. Bei allen in dieser Studie verwendeten Tieren handelte es sich um 8-12 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse (Durchschnittsgewicht: 20 g).
  2. Bereiten Sie den entsprechenden Geruchsreiz vor. Verschiedene Reize können verwendet werden, um Riechneuronen im MOE (olfaktorisches Hauptepithel) oder VNO (vomeronasales Organ) zu aktivieren. Eine umfassende Liste der olfaktorischen Reize finden Sie in den anderen Publikationen3, 16, 22, 23, 24. Flüssige Reize wie chemische Lösungen, Urin oder rekombinante Proteinlösung können auf einer medizinischen Gaze oder einem Wattebausch abgelagert werden.
  3. Führen Sie den Geruchsreiz in den Käfig ein und lassen Sie das Tier 1 h lang ungestört.
  4. Euthanasieren Sie das Mausobjekt und sezieren Sie das MOE oder VNO schnell mit RNase-freien Präparierwerkzeugen.

4. Gewebedissektion und Einfrieren

  1. Präparieren Sie das MOE oder VNO unter einem Stereomikroskop mit Dissektionslösung.
    1. Entfernen Sie für das VNO die dicken Septumknochen, wobei die weicheren Knorpelschalen das Organ umgeben.
  2. Bereiten Sie die Probe für den Kryoschnitt vor.
    1. Tupfen Sie die Probe auf einem Blatt Löschpapier trocken und legen Sie sie in eine histologische Kunststoffform, die Einbettmedium enthält.
    2. Ordnen Sie für VNO jedes Organ vertikal an und ziehen Sie es mit Hilfe einer 1-ml-Spritze an den Boden der Kunststoffform (Abbildung 1A).
    3. Für MOE legen Sie es mit der cribriformen Platte nach unten auf den Boden der Kunststoffform.
    4. Entfernen Sie die überschüssigen Blasen um die Probe herum, da diese das Schneiden beeinträchtigen können.
    5. Frieren Sie die Proben auf Trockeneis ein.
    6. Lagern Sie den Probenblock bei -80 °C.
      HINWEIS: Gefrorene Proben können mehrere Monate gelagert werden, bevor sie geschnitten werden.
  3. Führen Sie einen Kryoschnitt durch.
    1. Schalten Sie den Kryostaten ein und stellen Sie die Temperatur mindestens 4 h vor der Verwendung auf -23 °C ein.
    2. Entferne den gefrorenen Block aus der histologischen Kunststoffform und schneide ihn mit einer Rasierklinge ab.
    3. Lassen Sie 5 mm um die Probe herum, da dies die Handhabung des Schnitts erleichtert (Abbildung 1B).
    4. Verwenden Sie ein Einbettmedium, um den Block am Probenhalter des Kryostaten zu befestigen.
    5. Sammeln Sie 16-μm-Schnitte auf positiv geladenen Objektträgern.
    6. Lagern Sie die Objektträger bei -80 °C.
      HINWEIS: Objektträger können vor der In-situ-Hybridisierung mehrere Monate lang bei -80 °C gelagert werden.

5. Schritt-für-Schritt-In-situ-Hybridisierungsprotokoll

  1. Trocknen Sie die Objektträger 10 Minuten lang mit einem Fön. Verwenden Sie den warmen Strahl, um die Objektträger aufzutauen, und wechseln Sie dann zu einem Strahl mit Raumtemperatur, bis das Einbettmedium undurchsichtig ist.
  2. 500 μl pro Objektträger RNase-freie 4%ige Paraformaldehyd-Fixierlösung zugeben und 15 Minuten lang bei 23-26 °C inkubieren, um die histologischen Schnitte zu fixieren.
  3. Waschen Sie die Objektträger zweimal in RNase-freiem 1× PBS für jeweils 5 Minuten.
  4. 500 μl RNase-freies 0,2 M HCl pro Objektträger zugeben und 10 min bei 23-26 °C inkubieren.
  5. Waschen Sie die Objektträger zweimal in RNase-freiem 1× PBS für jeweils 5 Minuten.
  6. 500 μl RNase-freies 0,1 % H2O2/1× PBS pro Objektträger zugeben und 30 min bei 23-26 °C inkubieren. Führen Sie diesen Schritt im Dunkeln durch, um eine lichtinduzierte Degradation von Wasserstoffperoxid zu verhindern.
  7. Waschen Sie die Objektträger zweimal in RNase-freiem 1× PBS für jeweils 5 Minuten.
  8. Führen Sie eine Acetylierung durch, indem Sie die Objektträger in ein Glas mit 250 ml RNase-freiem Triethanolamin 0,1 M, pH 8,0 und einem magnetischen Rührstab in einem Abzug geben. 625 μl Essigsäureanhydrid unter ständigem Rühren zugeben. Drehen Sie die Rührgeschwindigkeit herunter, geben Sie weitere 625 μl Tropfen für Tropfen auf die Objektträger, schalten Sie dann das Rühren aus und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.
  9. Waschen Sie die Objektträger zweimal in RNase-freiem 1× PBS für jeweils 5 Minuten.
  10. Waschen Sie die Objektträger einmal in RNase-freiem 1× PBS bei 60 °C für 5 min.
  11. Führen Sie eine Prähybridisierung durch, indem Sie die Objektträger nacheinander von 1× PBS entfernen und jeden von ihnen mit fusselfreiem Laborpapier trocken tupfen. Pipettieren Sie 400 μl Prähybridisierungslösung auf jeden Objektträger und legen Sie ihn in eine befeuchtete Kammer, die auf 60 °C in einem Wasserbad oder einem beheizten Ofen vorgewärmt wird. Bei 60 °C 1 h inkubieren.
  12. Erhitzen Sie genügend Hybridisierungslösung auf 60 °C, aliquotieren Sie 200 μl pro Objektträger in Mikrofugenröhrchen und erhitzen Sie sie 10 Minuten lang auf 85 °C.
  13. Geben Sie die geeignete(n) cRNA-Sonde(n) in die Röhrchen der Hybridisierungslösung (1 μg/ml pro Sonde) und denaturieren Sie sie 5 Minuten lang bei 85 °C.
  14. Für die Hybridisierung nehmen Sie einen Objektträger nach dem anderen aus der befeuchteten Kammer, tupfen Sie ihn trocken und legen Sie ihn auf eine 60 °C heiße Platte. Fügen Sie 200 μl Riboson-haltige Hybridisierungslösung hinzu und decken Sie den Objektträger mit einem Glasdeckglas ab. 12-16 h in der befeuchteten Kammer bei 60 °C inkubieren.
    HINWEIS: Lassen Sie die Objektträger nach der Prähybridisierung nicht abkühlen. Die Hybridisierungstemperatur muss für jede Sonde empirisch bestimmt werden. Als Ausgangspunkt wird Sixty Grad Celsius empfohlen, da es im Allgemeinen gut für 1-kb-Sonden funktioniert.
  15. SSC-Waschlösungen in separaten Gläsern auf 55 °C erhitzen und in ein Wasserbad mit der entsprechenden Temperatur stellen.
  16. Nachdem die Hybridisierung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Deckglas von jedem Objektträger mit einem Bad, das 5× SSC-Lösung bei 55 °C enthält. Halten Sie jeden Objektträger waagerecht in die warme SSC-Lösung. Wenn sich der Deckglas gelöst hat, kippen Sie den Schieber und lassen Sie den Deckglas auf den Boden fallen.
  17. Mit 2× SSC bei 55 °C 30 min in einem Slide Glas waschen.
  18. Mit 0,2× SSC bei 55 °C 20 min in einem Slide Jar waschen.
  19. Mit 0,1 × SSC bei 55 °C 20 min in einem Slide Jar waschen.
  20. Auf 0,1 × SSC bei 23-26 °C umfüllen und 3 min in einem Objektträgerglas inkubieren.
  21. In PTw 10 min in einem Diaglas waschen.
  22. Zweimal in TN Buffer waschen, jeweils 5 Minuten, in einem Objektträgerglas.
  23. Pipettieren Sie 600 μl TNB-Blockierungspuffer auf jeden Objektträger und inkubieren Sie ihn 3 Stunden lang bei 23-26 °C.
  24. Pipettieren Sie 500 μl Primärantikörperlösung (Peroxidase-konjugierter Anti-DIG-Antikörper, verdünnt 1:400 in TNB-Lösung) auf jeden Objektträger. Vorsichtig ein Stück thermoplastische Laborfolie auf jeden Objektträger legen und 12-16 h bei 4 °C inkubieren.
  25. Waschen Sie die Objektträger 6 Mal mit TNT-Puffer für jeweils 5 Minuten unter leichtem Rühren in einem Objektträgerglas.
  26. Pipettieren Sie 100 μl Tyramid-Biotin-Arbeitslösung auf jeden Objektträger. Mit thermoplastischen Laborfolien abdecken und 12 min bei 23-26 °C inkubieren.
    HINWEIS: Führen Sie diesen Inkubationsschritt gestaffelt mit 2 oder 3 Objektträgern pro Charge durch, um eine gute Kontrolle über die Inkubationszeiten zu ermöglichen. Die Dauer der Tyramid-Inkubation muss möglicherweise optimiert werden, abhängig von der Empfindlichkeit und Konzentration der cRNA-Sonde.
  27. Waschen Sie die Objektträger 6 Mal mit TNT-Puffer für jeweils 5 Minuten unter leichtem Rühren in einem Objektträgerglas.
  28. 200 μl Lösung, die Peroxidase-konjugiertes Streptavidin (SA-HRP, verdünnt 1:100 in TNB-Puffer) enthält, auf jeden Objektträger pipettieren und mit einem thermoplastischen Laborfilmdeckglas abdecken. Bei 23-26 °C 1 h inkubieren.
  29. Waschen Sie die Objektträger 6 Mal mit TNT-Puffer für jeweils 5 Minuten unter leichtem Rühren in einem Objektträgerglas.
  30. 100 μl Tyramid-Alexa 488 Arbeitslösung auf jeden Objektträger pipettieren, mit thermoplastischer Laborfolie abdecken und bei 23-26 °C 12 min im Dunkeln inkubieren.
  31. Waschen Sie die Objektträger 6 Mal mit TNT-Puffer für jeweils 5 Minuten unter leichtem Rühren in einem Objektträgerglas.
  32. Inkubieren Sie in 3% H2O2/1× PBS in einem Objektträgerglas für 1 h, um die Peroxidasen aus den vorherigen Schritten zu inaktivieren.
  33. Waschen Sie die Objektträger 6 Mal mit TNT-Puffer für jeweils 5 Minuten unter leichtem Rühren in einem Objektträgerglas.

6. pS6-Immunfärbung

  1. Pipettieren Sie 500 μl 4 % Paraformaldehyd/1× PBS-Lösung auf jeden Objektträger und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 23-26 °C, um die Schnitte zu fixieren.
  2. Pipettieren Sie 500 μl 1× PBS/0,1 % Triton X-100 auf jeden Objektträger und inkubieren Sie 5 Minuten lang, um die Schnitte zu permeabilisieren.
  3. Zweimal mit 1× PBS in einer Slide Dose waschen.
  4. Pipettieren Sie 2-3 Tropfen pro Abschnitt der im Handel erhältlichen Tyramid-Signalamplifikations-Blockierungslösung B (Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 23-26 °C.
  5. Pipettieren Sie 400 μl immunhistochemische Blockierungslösung auf jeden Objektträger und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 23-26 °C, um die Schnitte zu blockieren.
  6. 200 μl Kaninchen-Anti-pS6-Primärantikörperlösung (1:200 verdünnt in immunhistochemischer Blockierungslösung; Endkonzentration: 1 μg/ml) auf jeden Objektträger pipettieren, mit thermoplastischer Laborfolie abdecken und 12-16 h bei 4 °C inkubieren.
  7. 3 Mal mit 1× PBS/0,1% Triton X-100 waschen, jeweils 5 min in einem Objektträgerglas.
  8. Pipettieren Sie 2-3 Tropfen pro Objektträger der im Handel erhältlichen Peroxidase-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörperlösung (Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 1,5 h lang bei 23-26 °C.
  9. 3 Mal mit 1× PBS/0,1% Triton X-100 waschen, jeweils 5 min in einem Objektträgerglas.
  10. Die Objektträger trocken tupfen und 100 bis 200 μl Tyramid-Alexa 555 Arbeitslösung auf jeden Objektträger pipettieren, mit einem Stück thermoplastischer Laborfolie abdecken und 7 Minuten im Dunkeln inkubieren.
  11. Zweimal mit 1× PBS für jeweils 5 min in einem Objektträgerglas waschen.
  12. 500 μl verdünnte Kernfärbung (in 1× PBS) auf jeden Objektträger pipettieren und 30 Minuten lang bei 23-26 °C inkubieren.
  13. Zweimal mit 1× PBS bei 23-26 °C für je 5 min in einem Slide Glas waschen.
  14. Montieren Sie Dias mit Anti-Fading-Eindeckmedium und lassen Sie das Eindeckmedium 24 Stunden im Dunkeln aushärten.
  15. Lagern Sie die Objektträger bis zur Bildgebung bei der richtigen Temperatur, um ein Verblassen der Fluoreszenz zu vermeiden.

7. Mikroskopische Bildgebung

  1. Bildträger mit einem Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop, das mit entsprechenden Filtern für die verwendeten Fluorophore ausgestattet ist.

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Ergebnisse

Das derzeitige Protokoll zielt darauf ab, Mikroskopiebilder zu erhalten, in denen das interessierende Gen des Experimentators und der neuronale Aktivitätsmarker pS6 fluoreszenzmarkiert sind. Die beschriebene Methode beinhaltet die Tyramid-Signalverstärkung, die eine klare und starke Markierung mit wenig bis gar keinem Hintergrund erzeugt. Die pS6-Immunfärbung erscheint als zytoplasmatisches Fluoreszenzsignal, das normalerweise den gesamten neuronalen Zellkörper ausfüllt, während das in situ Hybridisierungssignal...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll identifiziert zuverlässig sensorische Neuronen, die durch chemische Signale im olfaktorischen System aktiviert werden, durch eine Kombination aus in situ Detektion von OR- oder VR-Rezeptoren mit Immundetektion von pS6, einem indirekten Marker für neuronale Aktivität. Der Experimentator muss besonders vorsichtig sein, um die Integrität der Histologie zu erhalten und alle Schritte vor der Hybridisierung unter RNase-freien Bedingungen durchzuführen. ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keinerlei konkurrierende Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken GAG Pereira und JA Yunes für die Ressourcen, APF Ferreira und WO Bragança für administrative und technische Hilfe und den Mitarbeitern der Life Sciences Core Facility (LaCTAD-UNICAMP) für die Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Sao Paulo Research Foundation (FAPESP; Fördernummern 2009/00473-0 und 2015/50371-0 für F.P.), durch PRP/UNICAMP (Fördernummern 2969/16, 725/15, 348/14 und 315/12 für F.P.), durch FAPESP-Stipendien für V.M.A.C. (2014/25594-3, 2012/21786-0, 2012/01689-0), T.S.N. (2012/04026-1) und durch das Stipendium der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) für T.S.N.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20x Amplifikationsverdünnungsmittel (Reaktionspuffer aus  Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost Kit)Thermo Fisher ScientificB40923 oder  B40922wird als Amplifikationspuffer A in Arbeitslösungen für die Signalverstärkung von Tyramid-Alexa 488 oder Tyramid-Alexa 555 bezeichnet
20x SSCMerck (Calbiochem)8310-OPn/a
30% Rinderserumalbumin (BSA)Merck (Sigma-Aldrich)A9576n/a
30% Wasserstoffperoxyd (H2O2)Merck (Sigma-Aldrich)H1009n/a
EssigsäureanhydridMerck (Sigma-Aldrich)320102n/a
AgaroseMerck (Sigma-Aldrich)A9539n/a
Amplifikationsverdünnungsmittel (aus dem TSA Biotin Kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAbezeichnet als Amplifikationspuffer B in Arbeitslösung für die Tyramid-Biotin-Signalverstärkung
Anti-pS6 (Ser 244/247) Kaninchen polyklonaler AntikörperThermo Fisher ScientificCat# 44-923G, RRID:AB_2533798n/a
Blocking-Puffer 1x (aus Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost Kit)Thermo Fisher ScientificB40923 oder  B40922als Blockierungslösung B im Entwicklungsschritt des Tyramid-Signals bezeichnet
Blockierungsreagenz (aus dem TSA Biotin Kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAals Blockierungsreagenz A in der Formulierung für TNB-Puffer
bezeichnet DAPI-KernfärbungThermo Fisher ScientificD1306n/a
Denhardt-Lösung (50x)Merck (Sigma-Aldrich)D9905n/a
Deoinisiertes FormamidMerck (Sigma-Aldrich)F9037n/a
Dextransulfatlösung (50%)Merck (Chemicon)S4030n/a
Ethylen-Diamin-Tetraessigsäure (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884n/a
Hoechst 33342 KernfleckThermo Fisher ScientificH1399n/a
Salzsäure (HCl)Merck ( Sigma-Aldrich)320331n/a
Geruchsstimulin/aPapes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020)n/a
ParaformaldehydMerck (Sigma-Aldrich)P6148n/a
Peroxidase-konjugierter Anti-Digoxigenin-Antikörper (Fab-Fragmente)Merck (Roche)11207733910;   RRID:AB_514500bezeichnet als Peroxidase-konjugierter Anti-DIG-Antikörper
Peroxidase-konjugierter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (polyHRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-Reagenz aus  Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost Kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Peroxidase-konjugiertes Streptavidin (aus TSA Biotin Kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
ProLong Gold Antifading-EindeckmittelThermo FisherScientific P36934als Antifading-Eindeckmedium bezeichnet
RNasefreies ReinstwasserThermo Fisher Scientific10977015n/a
Natriumchlorid (NaCl)Merck (Sigma-Aldrich)S9888n/a
Natriumdodecylsulfat (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)436143n/a
Natriumhydroxid (NaOH)Merck (Sigma-Aldrich)S8045n/a
SaccharoseMerck (Sigma-Aldrich)S0389n/a
TriethanolaminMerck (Sigma-Aldrich)T58300n/a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n/a
Trizma-Hydrochlorid (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n/a
Tween-20Merck (Sigma-Aldrich)822184n/a
Tyramid-Alexa 488 Konjugat (aus Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost Kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Tyramid-Alexa 555 Konjugat (aus dem Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost Kit)Thermo Fisher ScientificB40923n/a
Tyramid-Biotin Konjugat (aus dem TSA Biotin Kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Hefe tRNAMerck (Roche)10109495001n/a
Kritische kommerzielle Assays und Tiere
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost KitThermo Fisher ScientificB40922n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost KitThermo Fisher ScientificB40923n/a
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)Merck (Roche)11175025910n/a
High Sensitivity RNA ScreenTape Analysereagenzien (Puffer, Leiter und Band)Agilent5067-5580, 5067-5581 und 5067-5579wird als automatisiertes Elektrophoresesystem bezeichnet
Maus: C57BL/6J InzuchtstammJackson LaboratoriesBest.-Nr.:   000664;   RRID:IMSR_JAX:000664)n/a
ProbeQuant G-50 MikrosäulenCytiva Biosciences28903408Aufreinigungskit auf Gelfiltration bezeichnet
QIAquick Gel-ExtraktionskitQiagen28506als Mini-säulenbasiertes Gel-Aufreinigungskit bezeichnet
RNeasy MinElute AufreinigungskitQiagen74204wird als Mini-säulenbasiertes RNA-Aufreinigungskit
bezeichnet TSA Biotin-KitAkoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Oligonukleotide
5' – AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr692
5' – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3'Integrated DNA Technologiesn/a
5'- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr124
5' – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – ATGGGAGCTAAATCAAACAA
GAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1509
5' – TAGAAAACCGATACCTTGTC
G – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1512
5' – GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr78
5' – CAGCTTCAATGTCCTTGTCA
G – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr691
5' – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
AGB – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr638
5' – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3'Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr569
5' – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r1
5' – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r2
5' – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3'Integrierte		DNA-Technologienn/a
5' – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC
CAC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r13
5' – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r89
5' – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC
A – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r118
5' – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r116
5' – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA
GA – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r28
5' – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA
CTGT – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r41
5' – CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r46
5' – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG
TG – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r69
5' – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3'Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r90
5' – CATATTCCACAGAAGT
TGGAC – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r107
5' – CCCTTGTTGCAAAATGAT
GATGTGA – 3'		Integrierte DNA-Technologienn/a
5' – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r83
5' – ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/a
Recombinant DNA
pGEM-T-Easy vectorPromegaA1360empfohlener PCR-Klonierungsvektor
Other materials1 mL
SpritzenFisher Scientific14-829-10Fn/a
Konische Röhrchen (15 mL und 50 mL)Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49Bn/a
Coplin-GläserFisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
KryostatLeica BiosystemsCMS 1850n/a
Präparierwerkzeuge und PinzettenRobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111n/a
Trockenbadn/an/a/a
Elektrophorese AusrüstungFisher Scientific09-528-110Bn/a
Feine PinselWinsor & Newton10269097n/a
Fluoreszenz- oder KonfokalmikroskopLeica MicrosystemsTCS SP5IIn/a
HeizplatteFisher ScientificHP88850200n/a
Befeuchtete Kammer (bei höheren Temperaturen muss sie in einem Tupperware-Behälter aus Kunststoff versiegelt werden)Thermo Fisher Scientific22-045-034n/a
Fusselfreie Labor-KimwipesKimberly-Clark34120bezeichnet als fusselfreies Labor-Seidenpapier
Mikrozentrifuge Eppendorf5401000013n/a
MauskäfigeInnoViveM-BTM, MVX1n/a
PCR ThermocyclerThermo Fisher Scientific4375786n/a
Pipette p1000, p200 und p20 EinwegspitzenFisher Scientific02-707-408, 02-707-411, 02-707-438n/a
Histologie-Einbettungsformaus Kunststoff Thermo Fisher Scientific22-19n/a
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238als hochempfindliche fluorometrische Methode bezeichnet
Rasierklingen oder SkalpelleFisher Scientific12-640n/a
RNA-Tapestation oder BioAnalyzerAgilent4200 TapeStation System oder 2100 Bioanalysator Instrumentn/a
RNasefreie Messzylinder und Becher aus Glas oder KunststoffFisher Scientific10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
StereomikroskopLeica MicrosystemsM80n/a
SuperFrost Plus ObjektträgerThermo Fisher Scientific12-550-15werden als positiv geladene Objektträger
bezeichnet ParafilmBemis FirmaPM999wird als thermoplastische Laborfolie bezeichnet
WasserbadThermo Fisher ScientificTSCIR19n/a
wird wird wird als wird n wird

Referenzen

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Neuronale Aktivierungolfaktorisches System der Mausphosphoryliertes S6Detektion chemischer StimuliG-Protein-gekoppelte Rezeptorenolfaktorisches Verhaltenvomeronasale Rezeptoren

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