Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Summary

Dieser Artikel stellt wesentliche Schritte der Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation vor. Diese Protokolle werden häufig verwendet, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren.

Abstract

Zellen sind kontinuierlich verschiedenen DNA-schädigenden Wirkstoffen ausgesetzt, die unterschiedliche zelluläre Reaktionen hervorrufen. Die Anwendung biochemischer und genetischer Ansätze ist unerlässlich, um zelluläre Ereignisse aufzudecken, die mit der Rekrutierung und Montage von DNA-Reparaturkomplexen an der Stelle von DNA-Schäden verbunden sind. In den letzten Jahren wurden mehrere leistungsfähige Werkzeuge entwickelt, um ortsspezifische DNA-Schäden zu induzieren. Darüber hinaus ermöglichen uns neuartige bahnbrechende Techniken, diese Prozesse auf der Ebene der Einzelzellauflösung sowohl mit festen als auch mit lebenden Zellen zu untersuchen. Obwohl diese Techniken zur Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse eingesetzt wurden, stellen wir hier die am weitesten verbreiteten Protokolle auf dem Gebiet der DNA-Reparatur, des Fluoreszenzimmunfärbungs (IF) und der Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) vor, die es in Kombination mit endonukleasebasierten ortsspezifischen DNA-Schäden ermöglichen, die genomische Belegung von DNA-Reparaturfaktoren gezielt und reguliert zu visualisieren und zu quantifizieren. beziehungsweise. Diese Techniken bieten den Forschern leistungsfähige Werkzeuge, um neuartige Proteine zu identifizieren, die an den beschädigten genomischen Locus gebunden sind, sowie ihre post-translationalen Modifikationen, die für ihre Feinabstimmung während der DNA-Reparatur erforderlich sind.

Introduction

Unser Genom wird ständig durch verschiedene DNA-schädigende Wirkstoffe herausgefordert. Diese Angriffe können von Umweltquellen wie UV-Licht oder Bestrahlung sowie von endogenen Quellen wie metabolischen Nebenprodukten, die durch oxidativen Stress oder Replikationsfehler verursacht werden, stammen^1,2. Diese Läsionen können die Integrität eines oder beider DNA-Stränge beeinträchtigen, und wenn die erzeugten Fehler persistent werden, führt dies häufig zu Translokationen und Genominstabilität, was zu Tumorgenese führen kann^3,4. Um die Integrität des Genom....

Protocol

1. Immundetektion spezifischer Proteine

1. Vorbereitung der Zellkultur und des Versuchsaufbaus
   1. Halten Sie U2OS-Zellen in Monoschichten in DMEM-Kulturmedium, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1% antibiotisch-antimykotischer Lösung.
      HINWEIS: Verwenden Sie für die Induktion von DNA-Schäden auf Endonukleasebasis holzkohlebehandeltes oder steroidfreies Medium, um Systemleckagen zu vermeiden.
   2. Züchten Sie Zellen in einer befeuchteten 5% CO₂ Umgebung bei 37 °C bis 80% Konfluenz, wobei das Medium alle 2-3 Tage erneuert wird.
   3. Saugen Sie das Medium an und waschen Sie die Zellen mit 1x PBS.....

Results

Die Untersuchung ortsgerichteter DSB-induzierter Reparaturprozesse in Zellen kann entweder durch stabile oder transiente Transfektion erreicht werden. Es ist jedoch zu beachten, dass eine stabile Transfektion eine homogene Zellpopulation gewährleistet, die eine einheitliche und damit zuverlässigere zelluläre Reaktion ergibt. Bei der transienten Transfektion nimmt nur ein kleiner Teil der Zellpopulation das Plasmid auf und erhält es, was Diversität in das Experiment einführt. Die Etablierung von ER-I-PpoI- oder ER-AsiSI-E.......

Discussion

Obwohl die DNA-Reparatur ein relativ neues Forschungsgebiet ist, erweitert sich unser Wissen mit Hilfe verschiedener biochemischer und mikroskopischer Methoden rasant. Die Erhaltung der genetischen Information ist für Zellen von entscheidender Bedeutung, da Mutationen, die in Genen auftreten, die an Reparaturprozessen beteiligt sind, zu den Hauptursachen für Tumorgenese gehören und daher die Aufklärung der wichtigsten Schritte von DNA-Reparaturwegen unerlässlich ist.

Biochemische Techniken (z........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-OHT	Sigma Aldrich	H7904
Agarose	Lonza	50004
Antibiotikum-Antimykotische Lösung (100 mal;), stabilisiert	Sigma Aldrich	A5955
Anti-gamma H2A. X (phospho S139) Antikörper	Abcam	ab26350
Rinderserumfraktion V-Albumin	Biosera	PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Gelb Ladepuffer	Thermo Fisher Scientific	10482035
DMEM mit 1,0 g/L Glukose, ohne L-Glutamin	Lonza	12-707F
Doxycyclin	Sigma Aldrich	D9891
Dynabeads™ M-280 Schaf Anti-Maus IgG	Invitrogen	11202D
Dynabeads™ M-280 Schaf Anti-Kaninchen IgG	Invitrogen	11204D
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Ethanol	Molar Chemicals	02910-101-340
Fötales Rinderserum (Herkunft aus Südamerika), EU-zugelassen	Gibco	ECS0180L
Formaldehyd 37% ige säurefreie	LösungSigma Aldrich	1.03999
GlutaMAX&Handel; Nahrungsergänzungsmittel	Thermo Fisher Scientific	35050038
Glycin	Sigma Aldrich	50046
IPure kit v2	Diagenode	C03010015
Isoamylalkohol	Sigma Aldrich	W205702
LiCl	Sigma Aldrich	L9650
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
Na-DOC	Sigma Aldrich	D6750
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Neocarzinostatin aus Streptomyces carzinostaticus	Sigma Aldrich	N9162
NP-40	Sigma Aldrich	I8896
PBS Pulver ohne Ca2+, Mg2+	Sigma Aldrich	L182-50-BC
Phenol	Sigma Aldrich	P4557
ROHRE	Sigma Aldrich	P1851
Polysorbat 20 (Tween 20)	Molar Chemicals	09400-203-190
KCl	Sigma Aldrich	P5405
ProLong&Trade; Gold Antifade Eindeckmittel mit DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36935
Proteaseinhibitor Cocktail Set I	Roche	11873580001
Proteinase K	Sigma Aldrich	P2308
P-S2056 DNAPKcs Antikörper	Abcam	ab18192
RNase A	Roche	10109169001
CH3COONa	Sigma Aldrich	S2889
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Trisacetat-EDTA-Puffer	Sigma Aldrich	T6025
Tris-HCl	Sigma Aldrich	91228
TRITON X-100	Molare Chemikalien	09370-006-340
Trypsin aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins	Sigma Aldrich	T4799
Trypsin-EDTA (0,5%), kein Phenolrot	Gibco	15400054