Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen

Summary

Hier beschreiben wir Protokolle mit fluoreszierenden Lipidsensoren und Liposomen, um festzustellen, ob ein Protein Phosphatidylserin oder Phosphatidylinositol-4-phosphat in vitroextrahiert und transportiert.

Abstract

Mehrere Mitglieder der evolutionär konservierten Oxysterol-bindenden Protein (OSBP)-verwandten Proteine (ORP) / OSBP-Homologe (Osch) Familie wurden kürzlich gefunden, um eine neuartige Lipidtransferprotein (LTP) Gruppe in Hefe und menschlichen Zellen darzustellen. Sie übertragen Phosphatidylserin (PS) aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) über PS/Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI(4)P)-Austauschzyklen in die Plasmamembran (PM). Dieser Befund ermöglicht ein besseres Verständnis dafür, wie PS, das für Signalprozesse entscheidend ist, in der Zelle verteilt ist, und die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen diesem Prozess und dem Phosphoinositidstoffwechsel (PIP). Die Entwicklung neuer fluoreszenzbasierter Protokolle war entscheidend für die Entdeckung und Charakterisierung dieses neuen zellulären Mechanismus in vitro auf molekularer Ebene. Dieser Artikel beschreibt die Herstellung und den Einsatz von zwei fluoreszierend markierten Lipidsensoren, NBD-C2_Lact und NBD-PH_FAPP, um die Fähigkeit eines Proteins zu messen, PS oder PI(4)P zu extrahieren und diese Lipide zwischen künstlichen Membranen zu übertragen. Zunächst beschreibt das Protokoll, wie hochreine Proben dieser beiden Konstrukte produziert, etikettiert und erhalten werden. Zweitens wird in diesem Artikel erläutert, wie diese Sensoren mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenleser verwendet werden können, um festzustellen, ob ein Protein PS oder PI(4)P aus Liposomen extrahieren kann, wobei Osh6p als Fallstudie verwendet wird. Schließlich zeigt dieses Protokoll, wie die Kinetik des PS/PI(4)P-Austauschs zwischen Liposomen definierter Lipidzusammensetzung genau gemessen und die Lipidtransferraten durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) mit einem Standardfluorometer bestimmt werden können.

Introduction

Die genaue Verteilung der Lipide zwischen verschiedenen Membranen und innerhalb der Membranen eukaryotischer Zellen^1,2 hat tiefgreifende biologische Implikationen. Die Entschlüsselung der Funktionsweise von LTPs ist ein wichtiges Thema in der Zellbiologie^3,4,5,6, und In-vitro-Ansätze sind von großem Wert, um dieses Problem anzugehen^7,8,9,10,

Protocol

1. Reinigung von NBD-C2_Lact

HINWEIS: Obwohl dieses Protokoll die Verwendung eines Zelldisruptors zum Aufbrechen von Bakterien beschreibt, kann es modifiziert werden, um andere Lysestrategien zu verwenden(z. B. eine französische Presse). Zu Beginn der Reinigung ist es obligatorisch, einen Puffer zu verwenden, der frisch entgast, filtriert und mit 2 mM Dithiothreitol (DTT) ergänzt wird, um die Oxidation von Cystein zu verhindern. Für den Proteinmarkierungsschritt ist es jedoch entscheidend, DTT vollständig zu entfernen. Viele Schritte müssen auf Eis oder in einem kühlen Raum durchgeführt werden, um einen Proteinabbau zu verm....

Results

Abbildung 1: Beschreibung der fluoreszierenden Lipidsensoren und In-vitro-Assays. (A) Dreidimensionale Modelle von NBD-C2_Lact und NBD-PH_FAPP basierend auf der Kristallstruktur der C2-Domäne von Rinderlactadherin (PDB-ID: 3BN6⁴⁸) und der NMR-Struktur der PH-Domäne des menschlichen FAPP1-P.......

Discussion

Die Ergebnisse dieser Assays hängen direkt von den Signalen der fluoreszierenden Lipidsensoren ab. Daher ist die Reinigung dieser Sonden, die im Verhältnis 1:1 mit NBD und ohne freie NBD-Fluorophorkontamination markiert sind, ein kritischer Schritt in diesem Protokoll. Es ist auch obligatorisch zu überprüfen, ob das zu untersuchende LTP ordnungsgemäß gefaltet und nicht aggregiert ist. Die Menge an LTP, die in den Extraktionsassays getestet wurde, muss gleich oder höher als die von zugänglichen PS- oder PI(4)P-Molekülen s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-Cystein ≥ 97 % (FG)	Sigma	W326305-100G	Bereiten Sie eine 10 mM L-Cystein-Stammlösung in Wasser vor. Aliquots werden bei -20 ° gelagert; C
2 mL Braunes Fläschchen, PTFE/Rub Lnr, für die Lagerung von Lipiden in CHCL3	Wheaton	W224681
Glasperlen mit 4 mm Durchmesser	Sigma	Z265934-1EA
50 mL konisches Zentrifugenröhrchen	Falcon
Ä KTA-Reiniger	GE Healthcare		FPLC
Aluminiumfolie
Amicon Ultra-15 mit einem MWCO von 3 und 10 kDa	Merck	UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 mit einem MWCO von 3 und 10 kDa	Merck	UFC800324, UFC801024
Ampicillin			Bereiten Sie eine 50 mg/ml-Stammlösung mit gefiltertem und sterilisiertem Wasser vor und lagern Sie sie bei -20 & °C.
Bestatin	Sigma	B8385-10mg
BL21 Gold Kompetente Zellen	Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/ml)	Avanti Polare Lipide	810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P	Echelon Lipids	P-4016-3	Lösen Sie 1 mg C16:0/C16:0-PI(4)P Pulver in 250 &; Mikro; L von MeOH und 250 µ L von CHCl3. Vervollständigen Sie dann mit CHCl3 auf 1 mL. Die Lösung muss klar werden.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/ml)	Avanti Polare Lipide	840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/ml)	Avanti Polare Lipide	850375C-500mg
CaCl2	Sigma		Bereiten Sie 10 mM CaCl2 Stammlösung in Wasser vor.
Cell Disruptor	Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO	Carlo Erba	438601
Vollständiger EDTA-freier Proteaseinhibitor-Cocktail	Roche	5056489001
deionisiertes (Milli-Q) Wasser
Dimethylformamid (DMF), wasserfrei, >99% rein
DNAse I Rekombinant, RNAsefrei, in Pulverform	Roche	10104159001
DTT	Euromedex	EU0006-B	1 M DTT Stammlösung in Milli-Q Wasser herstellen. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor und lagern Sie sie bei -20 °C.
Econo-Pac Chromatographie-Säulen (1,5 & 12 cm).	Biorad	7321010
Elektroporationsküvette 2 mm	Ozyme	EP102
Elektroporator Eppendorf 2510	Eppendorf
Festwinkelrotor Ti45 und Ti45	Röhrchen Beckman	Spinnen der Batzeriallysate
Glasspritzen (10, 25 und 50 & Mikro) L) für das Fluoreszenzexperiment	Hamilton
Glasspritzen (25 , 100, 250, 500 und 1000 µ L) zur Handhabung von Lipid-Stammlösungen	Hamilton	1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN Typ3, 1001RN
Glutathion Sepharose 4B Kügelchen	GE Healthcare	17-0756-05
Glycerin (99% rein)	Sigma	G5516-500ML
Hämolyse-Röhrchen mit Kappe
HEPES, >99 % rein	Sigma	H3375-500G
Illustra NAP 10 Entsalzungssäule	GE healthcare	GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)	Euromedex	EU0008-B	Bereiten Sie 1 M IPTG-Stammlösung in Milli-Qwater vor. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor und lagern Sie sie bei -20 °C.
K-Acetat	Prolabo	26664.293
Lennox LB Bouillonmedium ohne Glukose			Zubereitet mit Milli-Q-Wasser und autoklaviert.
Flüssiger Stickstoff	Linde
Methanol (MeOH) ≥ 99,8%	VWR	20847,24
MgCl2	Sigma		Bereiten Sie eine 2 M MgCl2 Lösung vor. Filtrieren Sie die Lösung mit einem 0,45 &μ; m Filter.
Mikroplatte 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding	Greiner Bio-one	655900
Mini-Extruder mit zwei 1 mL gasdichten Hamilton	Spritzen Avanti Polar Lipids	610023
Monochromator-basierter Fluoreszenzplatten-Reader	TECAN	M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylendiamin) (IANBD Amide)	Molekulare Sonden		Lösen Sie 25 mg IANBD in 2,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) und bereiten Sie 25 Aliquot von 100 & Mikro vor; L in 1,5 mL Schraubverschluss-Röhrchen. Schrauben Sie die Kappe nicht vollständig auf. Entfernen Sie dann DMSO in einem Gefriertrockner, um 1 mg trockenes IANBD pro Tube zu erhalten. Die Röhrchen werden verschlossen und bei -20 Grad gelagert; C im Dunkeln.
NaCl	Sigma	S3014-1KG
PBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1,8 mM KH2PO4, autoklaviert und bei 4 °C gelagert.
Birnenförmige Glaskolben (25 mL, 14/23, Duran-Glas)	Duran Group
Pepstatin	Sigma	p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid			Auf Anfrage in unserem Labor
erhältlich pGEX-PHFAPP Plasmid			Auf Anfrage in unserem Labor erhältlich
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) ≥ 98,5 % (GC)	Sigma	P7626-25g	Bereiten Sie eine 200 mM PMSF-Stammlösung in Isopropanol
Phosphoramidon	Sigma	R7385-10mg
Polycarbonat-Filtern (19 mm Durchmesser) mit einer Porengröße von 0,2 & Mikro m	Avanti Polar Lipids	610006
Poly-Prep Chromatographiesäule (mit einem Bettvolumen von 0-2 mL und einem 10 mL Reservoir)	Biorad	7311550
Vorfilter (10 mm Durchmesser).	Avanti Polar Lipids	610014
PyMOL	http://pymol.org/		Konstruktion der 3D-Modelle der Proteine (Abbildung 1A)
Quarzküvette für UV/sichtbare Fluoreszenz (Mindestvolumen von 600 &μ; L)	Hellma
Quarzküvetten	Hellma
Kühlzentrifuge  Eppendorf 5427R	Eppendorf
Rotationsverdampfer	Büchi	B-100
Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (1,5 mL)	Sarsted
Kleiner magnetischer PFTE-Rührstab (5 &; 2 mm)
Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss (0,5, 1 und 2 mL)	Eppendorf
SYPRO orange			Fluoreszenzfärbung zum Nachweis von Proteinen im SDS-PAGE Gel
Thermomixer	Starlab
THROMBIN, AUS MENSCHLICHEM PLASMA	Sigma	10602400001	Lösen Sie 20 Einheiten in 1 mL Milli-Q-Wasser auf und bereiten Sie 25 & micro; L Aliquots in 0,5 mL Eppendorf Röhrchen. Dann einfrieren und bei -80 °C lagern.
Tris, ultrareines	MP	819623
Ultrazentrifuge L90K	Beckman
UV/sichtbares Absorptionsspektrophotometer	SAFAS
UV/sichtbares Spektrofluorometer mit temperaturgesteuertem Küvettenhalter und Rührvorrichtung	Jasco oder Shimadzu	Jasco FP-8300 oder Shimadzu RF-5301PC
Vakuumkammer
Wasserbad	Julabo
XK 16/70 Säule gepackt mit Sephacryl S200HR	GE healthcare