Methodenartikel

Verwendung von Hühnerembryon als leistungsfähiges Werkzeug bei der Beurteilung von Entwicklungskardiotoxizitäten

DOI:

10.3791/62189

⸱

21. März 2021

 ,  ,  , 
1School of Public Health, Qingdao University, 2Department of Pharmacology & Toxicology, Brody School of Medicine, East Carolina University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hühnerembryonen werden als klassisches Entwicklungsmodell in unserem Labor verwendet, um Entwicklungskardiotoxizitäten nach Exposition gegenüber verschiedenen Umweltkontaminanten zu bewerten. Expositionsmethoden und morphologische/funktionelle Bewertungsmethoden werden in diesem Manuskript beschrieben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hühnerembryonen sind ein klassisches Modell in Entwicklungsstudien. Während der Entwicklung von Hühnerembryonen ist das Zeitfenster der Herzentwicklung gut definiert, und es ist relativ einfach, eine präzise und rechtzeitige Exposition durch mehrere Methoden zu erreichen. Darüber hinaus ähnelt der Prozess der Herzentwicklung bei Hühnerembryonen Säugetieren, was auch zu einem Vierkammerherz führt, was es zu einem wertvollen alternativen Modell bei der Beurteilung von Entwicklungskardiotoxizitäten macht. In unserem Labor wird das Hühnerembryomodell routinemäßig bei der Bewertung von Entwicklungskardiotoxizitäten nach Exposition gegenüber verschiedenen Umweltschadstoffen verwendet, darunter Per- und Polyfluoralkylsubstanzen (PFAS), Feinstaub (PMs), Dieselabgase (DE) und Nanomaterialien. Die Belichtungszeit kann je nach Bedarf frei gewählt werden, vom Beginn der Entwicklung (Embryonaltag 0, ED0) bis zum Tag vor dem Schlüpfen. Zu den wichtigsten Expositionsmethoden gehören Luftzellinjektion, direkte Mikroinjektion und Luftzellinhalation (ursprünglich in unserem Labor entwickelt), und die derzeit verfügbaren Endpunkte umfassen Herzfunktion (Elektrokardiographie), Morphologie (histologische Bewertungen) und molekularbiologische Bewertungen (Immunhistochemie, qRT-PCR, Western Blotting usw.). Natürlich hat das Hühnerembryomodell seine eigenen Grenzen, wie z.B. die begrenzte Verfügbarkeit von Antikörpern. Da jedoch immer mehr Labore beginnen, dieses Modell zu verwenden, kann es verwendet werden, um signifikante Beiträge zur Untersuchung von Entwicklungskardiotoxizitäten zu leisten.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Hühnerembryo ist ein klassisches Entwicklungsmodell, das seit über zweihundert Jahren verwendet wird1. Das Hühnerembryo-Modell hat verschiedene Vorteile gegenüber traditionellen Modellen. Zunächst einmal war bereits vor über 70 Jahren die normale Entwicklung des Hühnerembros sehr deutlich im Hamburger-Hamilton Staging Guide2dargestellt worden, in dem insgesamt 46 Stadien während der Hühnerembryoentwicklung mit genauen zeitlichen und morphologischen Merkmalen definiert wurden, was den Nachweis abnormaler Entwicklungen erleichterte. Darüber hinaus weist das Hühnerembryomodell weitere Merkmale auf, wie z. B. relativ kostengünstig und redundant in der Menge, relativ genaue Expositionsdosiskontrollen, ein unabhängiges, geschlossenes System innerhalb der Schale und eine einfache Manipulation des sich entwickelnden Embryos, die alle sein Potenzial garantieren, als leistungsfähiges toxikologisches Bewertungsmodell verwendet zu werden.

Bei der Kardiotoxizität weist der Hühnerembryo ein Vierkammerherz auf, ähnlich wie Säugetierherzen, aber mit dickeren Wänden, was eine einfachere morphologische Beurteilung ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht der Hühnerembryo eine Entwicklungsinhalationsexposition, die in Säugetiermodellen nicht möglich ist: Im späteren Entwicklungsstadium wechselt der Hühnerembryo von der inneren Atmung zur externen Atmung (Sauerstoff über die Lunge erhalten); Letzteres erfordert, dass der Embryo mit dem Schnabel in die Luftzellmembran eindringt und beginnt, Luft zu atmen3, wodurch die Luftzelle zu einer Mini-Inhalationskammer wird. Unter Ausnutzung dieses Phänomens können die toxikologischen Wirkungen von Gasverunreinigungen auf das Herz (und andere Organe) bewertet werden, ohne dass spezielle Inhalationskammerinstrumente erforderlich sind.

In diesem Manuskript werden mehrere Expositions- / Endpunktbewertungsmethoden beschrieben, die alle dazu dienen, den Hühnerembryo zu einem leistungsfähigen Werkzeug bei der Beurteilung der Entwicklungskardiotoxizität nach Exposition gegenüber Umweltkontaminanten zu machen.

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Protokoll

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Alle beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Qingdao University genehmigt. In unserem Labor wurden die Eier in zwei Inkubatoren bebrütet. Eier wurden aufrecht im Inkubator gehalten und zufällig in die Regale gestellt. Die Inkubationsbedingungen für die Eier waren wie folgt: Die Inkubationstemperatur begann bei 37,9 ° C und sank allmählich auf 37,1 ° C im Laufe der Inkubation; die Luftfeuchtigkeit begann bei 50% und stieg allmählich auf 70%.

1. Expositionsmethoden

HINWEIS: Die Exposition von Umweltkontaminanten gegenüber Hühnerembryonen kann auf verschiedene Arten erreicht werden. In diesem Abschnitt werden drei routinemäßig verwendete Methoden ausführlich beschrieben.

  1. Luftzelleninjektion (Abbildung 1)
    HINWEIS: Dies ist die klassische Expositionsmethode für Hühnerembryonen4,5,6, die für eine Vielzahl von Materialien geeignet ist und in einem sehr breiten Zeitfenster vom Beginn der Entwicklung (embryonaler Tag Null, ED0) bis zum Tag vor dem Schlüpfen (ED20) durchgeführt werden kann. Als Vehikel wird Sonnenblumenöl verwendet. Frühere Studien haben gezeigt, dass keine signifikanten Veränderungen der Mortalität, Derrbarkeit oder des Körpergewichts zwischen unbehandelten Embryonen und Embryonen, denen Sonnenblumenöl injiziert wurde, beobachtet wurden7.
    1. Bereiten Sie die folgenden notwendigen Reagenzien / Werkzeuge vor: 75% Ethanol, Seidenpapier, Metallsonde (kann durch jede scharfe Metallnadel / Stick / Ahle ersetzt werden), geschmolzenes Paraffin, Bürste, Povidoniodidlösung, Pipette, Pipettenspitzen, Candling-Lampe, Dosiermischung. Bereiten Sie die Dosierungsmischung mit Sonnenblumenöl vor (empfohlen)4. Um andere Verdünnungsmittel zu verwenden, führen Sie eine Fahrzeugkontrolle durch (im Vergleich zu unbehandelten Embryonen).
    2. Reinigen Sie die Oberfläche der Eier mit Povidoniodidlösung (handelsübliche Povidoniodidlösung 1:5 verdünnt mit entionisiertem Wasser) und trocknen Sie die Eierschale mit Seidenpapier ohne Schrubben. Durch das Schrubben wird die Schutzschicht, die die Außenseite der Schale bedeckt, gebrochen.
    3. Kerzen Sie die Eier in einem dunklen Raum und markieren Sie die Luftzelle mit Bleistift. Eier mit Rissen auf der Schale ausschließen. Schließen Sie Eier mit Luftzellen an der Seite anstelle der stumpfen Spitze aus, da es sehr unwahrscheinlich ist, dass diese normal schlüpfen.
    4. Desinfizieren Sie den Luftzellenbereich mit 75% Ethanol und bohren Sie dann mit der Metallsonde ein kleines Loch in der Mitte des Luftzellenbereichs. Stecken Sie die Sonde nicht tief in die Luftzelle, da sonst die innere Membran beschädigt werden kann, sondern brechen Sie die Schale nur mit der Spitze der Sonde. Wenn das Loch nicht groß genug ist, um in eine feine Pipettenspitze zu passen, brechen Sie die Schale in der Nähe des vorhandenen Lochs erneut auf, bis das Loch groß genug ist, um das Einsetzen der 10 μL Pipettenspitze zu ermöglichen.
    5. Die Dosiermischung kräftig vortexen und sofort die Lösung zur Pipettenspitze ziehen. Das empfohlene Injektionsvolumen beträgt 1 μL pro 10 Gramm Ei (z. B. 5 μL Injektionsvolumen für ein 50-Gramm-Ei), da größere Injektionsvolumina hypoxische oder anoxische Bedingungen für den sich entwickelnden Embryo verursachen können. Berechnen Sie die Konzentration der Dosierlösung für die gewünschte mg/Ei kg Dosis.
    6. Setzen Sie die Pipettenspitze in das Loch ein, wobei die Spitze die innere Membran berührt. Die Dosiermischung langsam auswerfen, mindestens zehn Sekunden gedrückt halten (das viskose Öl vollständig dosieren lassen) und dann die Spitze entfernen.
    7. Versiegeln Sie das Loch mit einer Bürste und einem Tropfen geschmolzenem Paraffin. Achten Sie darauf, geschmolzenes Paraffin nicht auf die innere Membran zu tropfen.
    8. Nach dem Versiegeln legen Sie die Eier in den Inkubator, bis sie das gewünschte Embryonalstadium erreicht haben. Führen Sie bei sich bereits entwickelnden Embryonen den gesamten Prozess so schnell wie möglich durch, um einen möglichen Embryoverlust aufgrund niedriger Umgebungstemperaturen zu verhindern.
  2. Mikroinjektion (Abbildung 2)
    HINWEIS: Dies ist eine direktere Expositionsmethode, die zu einer definitiven Exposition gegenüber der interessierenden Substanz führt und besonders für Verbindungen mit kurzer Wirkungsdauer (z. B. Lentivirus) geeignet ist, da die klassische Luftzelleninjektion Zeit benötigt, damit die Verbindungen in die innere Membran eindringen. Diese Methode kann auch ausprobiert werden, wenn durch Luftzelleninjektion keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt werden konnten. Diese Methode eignet sich am besten für frühe Embryonen (bis ED2), kann aber auch an älteren Embryonen durchgeführt werden (mit höherem Risiko für Embryonenverlust).
    1. Bereiten Sie die folgenden notwendigen Reagenzien / Werkzeuge vor: 75% Ethanol, Povidoniodidlösung, Mikroinjektor (5 μL), Metallsonde (kann mit jeder scharfen Metallnadel / Stick / Ahle ersetzen sollte funktionieren), feine Zinnen, Klebeband. Bereiten Sie die Dosiermischung mit steriler Kochsalzlösung vor, die auch als Injektionskontrolle dient, ohne die Schlupffähigkeit wesentlich zu beeinträchtigen. Stellen Sie die Sterilität der Kochsalzlösung sicher, da eine kontaminierte Injektion die Mortalität dramatisch erhöht.
    2. Reinigen Sie die Eier wie in 1.1.2 beschrieben.
    3. Kerzen Sie die Eier wie in 1.1.3 beschrieben.
    4. Desinfizieren Sie den Luftzellenbereich mit 75% Ethanol und bohren Sie dann mit der Metallsonde ein kleines Loch in der Mitte des Luftzellenbereichs. Stecken Sie die Sonde nicht tief in die Luftzelle, da sonst die innere Membran beschädigt werden kann, sondern brechen Sie die Schale nur mit der Spitze der Sonde. Verwenden Sie dann die feine Zette, um das Loch vorsichtig zu vergrößern, bis der Durchmesser etwa 2 mm beträgt, was eine visuelle Bestätigung der inneren Membran ermöglicht.
    5. Laden Sie die Lösung in den Mikroinjektor (maximales Injektionsvolumen: 0,5 μL/10 g Ei. (z. B. 2,5 μL für ein 50 g Ei) und führen Sie die Nadel vorsichtig durch das Loch in die innere Membran für ca. 2-3 mm ein. Dosieren Sie die Lösung vorsichtig und entfernen Sie die Nadel. Halten Sie die Nadel so senkrecht wie möglich zur Membran.
    6. Versiegeln Sie das Loch mit einem kleinen Stück Klebeband. Decken Sie das Loch vollständig ab, um die Austrocknung und den Tod des Embryos während der anschließenden Inkubation zu verhindern. Vermeiden Sie jedoch Klebebandstücke, die zu groß sind, um Hypoxie zu verhindern.
    7. Nach dem Versiegeln legen Sie die Eier in den Inkubator, bis sie das gewünschte Embryonalstadium erreicht haben. Führen Sie bei sich bereits entwickelnden Embryonen den gesamten Prozess so schnell wie möglich durch, um einen möglichen Embryoverlust aufgrund niedriger Umgebungstemperaturen zu verhindern.
  3. Inhalation von Luftzellen (Abbildung 3)
    HINWEIS: Dies ist eine neuartige Inhalationsmethode, die die Luftzelle nutzt, aus der der Hühnerembryo im Spätstadium beginnt, Luft zu atmen. Es eignet sich für Gas- oder Aerosolexpositionen und kann sehr früh im Leben Inhalationsexpositionen erreichen und die Lunge mit dem Zielgas / Aerosol füllen, wenn sie sich zum ersten Mal im Leben öffnen.
    1. Bereiten Sie die folgenden notwendigen Reagenzien / Werkzeuge vor: Probenahmebeutel (PVF-Beutel, zur Lagerung von Gas- / Aerosolprobe vor der Exposition), Katheternadel, Spritze, Metallsonde (kann durch jede scharfe Metallnadel / Stick / Ahle ersetzt werden sollte funktionieren), Klebeband, Abzug.
    2. Reinigen Sie die Eier wie in 1.1.2 beschrieben und kerzen Sie sie wie in 1.1.3 beschrieben (es ist nicht notwendig, die Luftzelle vor der Inkubation zu markieren), und inkubieren Sie dann die Eier ohne Behandlung bis ED17.
    3. Kerzen Sie die Eier bei ED17, um den Luftzellenbereich zu markieren.
    4. Bei ED18 nehmen Sie ein Ei aus dem Inkubator, desinfizieren Sie den Luftzellenbereich mit 75% Ethanol und bohren Sie dann vorsichtig zwei kleine Löcher auf zwei Seiten der Luftzelle. Einer ist für die Injektion von Gas / Aerosol, der andere ist für die Ausstoßung von Luft. Kontrollieren Sie sorgfältig die Größe der Löcher, so dass die Größe des Injektionslochs gerade ausreicht, um die Katheternadel einzulegen, während der Durchmesser des Ausstoßlochs etwas größer ist (ca. 1 mm).
    5. Mit einer an der Katheternadel befestigten Spritze vorsichtig 10 ml Zielgas/Aerosol aus dem Injektionsloch injizieren. Injizieren Sie Luft für eine Inhalationskontrollgruppe, die keine signifikanten Unterschiede zu einer negativen Kontrollgruppe aufweisen sollte8. Drücken Sie Druck auf die Katheternadel aus (bei entsprechendem Druck kann die elastische Nadel gegen die Schale gedrückt werden), um das Auslaufen aus dem Injektionsloch zu minimieren. Verschließen Sie beide Löcher sofort mit Klebeband und bringen Sie das Ei in den Inkubator zurück.
      HINWEIS: Dieses Verfahren sollte in einem Abzug durchgeführt werden, um das Einatmen von Gas / Aerosol durch den Bediener zu verhindern.
    6. Wiederholen Sie den beschriebenen Vorgang nach einer Stunde, um sicherzustellen, dass die gesamte Luftzelle mit Zielgas / Aerosol gefüllt ist (optional).
    7. Wiederholen Sie den beschriebenen Vorgang bei ED19 erneut (optional). Die Wiederholung der Belichtung hilft, eine konsistente Belichtung bis zum Schlüpfen zu gewährleisten. Notieren Sie die Schraffurzeit für eine ungefähre Abschätzung der Expositionsdauer.
    8. Sobald die gewünschten Expositionen durchgeführt und versiegelt wurden, legen Sie die Eier zum Schlüpfen in den Inkubator. Minimieren Sie die Zeit, die das Ei außerhalb des Inkubators verbringt, um den Tod durch niedrige Umgebungstemperatur zu verhindern.

2. Methoden zur Endpunktbewertung

HINWEIS: Nach Exposition von Kontaminanten von Interesse für den sich entwickelnden Embryo können mehrere Toxizitätsparameter bewertet werden, einschließlich der Kardiotoxizität. In diesem Abschnitt werden zwei häufig verwendete spezifische Methoden ausführlich beschrieben.

  1. Elektrokardiographie (Abbildung 4)
    HINWEIS: Es ist unmöglich, eine nicht-invasive Elektrokardiographie bei schlüpfenden Hühnern aufgrund des Vorhandenseins von Federn zu machen. Daher ist die subkutane Implantation von Elektroden unerlässlich und erfordert eine Anästhesie. Die im Labor verwendete Dosis beträgt 33 mg/kg Pentobarbital durch intraperitoneale Injektion (einige Hühner benötigen möglicherweise eine Dosiserhöhung von bis zu 50%). Diese Methode führt zu einer stabilen Elektrokardiographie bei über 90% der Tiere, was eine Analyse der Herzfrequenz ermöglicht.
    1. Bereiten Sie die folgenden notwendigen Reagenzien/Werkzeuge vor: 1% (10 mg/ml) Pentobarbitallösung in Kochsalzlösung, Spritze, elektrische Waage, Heizung (falls erforderlich), ein Elektrokardiographie-Instrument (z. B. BL-420E+) mit zweikanaligen Metallnadelelektroden.
    2. Wiegen Sie die Hühner mit einer Waage und berechnen Sie das notwendige Volumen der Pentobarbitallösung und injizieren Sie die Hühner. Für ein Huhn, das 30 g wiegt, werden 0,1 ml Pentobarbitallösung benötigt. Stellen Sie sicher, dass die Injektion auf der seitlichen Seite des Bauches erfolgt, da sich das Eigelb in der Mitte befindet und die Injektion dort möglicherweise nicht wirksam ist.
    3. Warten Sie, bis die injizierten Hühner betäubt sind (halten Sie das Huhn in der Hand, wenn der Hals keine Spannung hat und der Kopf frei geschwungen werden kann, ist die Betäubung ausreichend). Hühner auf den Operationstisch legen (Heizungen sind notwendig, wenn die Raumtemperatur unter 20 °C liegt).
    4. Führen Sie zwei Nadelelektroden von zwei Seiten des Abdomens subkutan ein. Stellen Sie sicher, dass die Nadeln nicht in die Bauchhöhle gelangen, indem Sie die Haut ein wenig anheben und von dort aus die Nadel einführen. Drücken Sie die Nadel nach dem Einsetzen vorsichtig nach vorne, bis sie die Seite der Brusthöhle erreicht. Achten Sie darauf, dass die Nadel nicht tief in den Körper eindreckt oder aus der Haut herausragt.
    5. Nehmen Sie die Messungen mit dem Elektrokardiographie-Gerät vor. Andere ähnliche Instrumente, die elektrokardiographisch fähig sind, können verwendet werden.
    6. Wenn die Hühner geopfert werden sollen, führen Sie nach der Elektrokardiographie eine Euthanasie durch, da sie bereits unter Betäubung stehen. Wenn Hühner überleben sollen, legen Sie sie wieder in ihre Käfige und wärmen Sie sie bis zum Aufwachen. Die Rückgabe an den Inkubator ist eine weitere Option.
  2. Histomorphometrie (Abbildung 5)
    HINWEIS: Es wird eine spezielle Methode entwickelt, um die rechtsventrikuläre Wandstärke in Querabschnitten des Herzens zu beurteilen. Die morphologische Beurteilung der Abmessungen des rechten Ventrikels mittels Echokardiographie ist aufgrund der unregelmäßigen Form des rechten Ventrikels nicht 100% genau, und diese Methode kann als gute Ergänzung bei den morphologischen Bewertungen für den rechten Ventrikel dienen.
    1. Bereiten Sie die folgenden notwendigen Reagenzien / Werkzeuge vor: 4% phosphatgepuffertes Formaldehyd, scharfe Klinge, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Papiertuch, elektrische Waage, kleine Schere, allgemeine histologische Verarbeitungsmittel (abgestuftes Ethanol, Xylol, Paraffin).
    2. Sobald tiere geopfert sind, verwenden Sie Wasser, um die Federn zu benetzen. Dies dient dazu, die mögliche Kontamination durch fliegende Federn beim Öffnen der Brust zu minimieren.
    3. Öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig, ohne das Herz zu beschädigen. Verwenden Sie eine kleine Schere, um das Gefäß zu schneiden und das Herz vorsichtig aus der Brusthöhle zu entfernen. Lassen Sie ein kleines Stück (ca. 1-2 mm) Gefäße am Herzen befestigt, da dies für die spätere Handhabung des Herzens bequem sein kann, ohne das Herz zu schädigen.
    4. Spülen Sie das Herz nach der Entfernung in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung aus, um Blut zu entfernen und den Muskel zu entspannen. Dann tauchen Sie das Herz auf papiertuch, bevor Sie es wiegen, um das Gewicht genau zu lesen. Das Herz für 24 Stunden bei Raumtemperatur in 10x Volumenfixiermittel (4% phosphatgepuffertes Formaldehyd) geben. Fixierte Gewebe können anschließend zu Paraffinblöcken verarbeitet oder jahrelang bei 4 °C gelagert werden (nicht empfohlen, wenn eine Immunhistochemie geplant ist).
    5. Schneiden Sie vor dem Einbetten das Gewebe in etwa 60% Länge des Herzens ab der Spitze (Abbildung 5A), um die nachfolgende Verarbeitung zu erleichtern. Für einen schnellen und vertikalen sauberen Schnitt wird eine Mikrotomklinge empfohlen. Für Hühner, die älter als einen Tag sind, machen Sie einen weiteren Schnitt mit einer Länge von etwa 25-30% von der Spitze, um das Eindringen von Paraffin zu erleichtern und das Gewebe in Gewebekassetten passen zu lassen.
    6. Verarbeiten Sie die Gewebe unter folgenden Bedingungen (nach Bedarf anpassen): 70% Ethanol für 1 h, 80% Ethanol für 1 h, 95% Ethanol für 1 h x2, 100% Ethanol für 30 min x2, Xylol für 5 min x2, Paraffin (Schmelzpunkt 52-54 °C) für 1,5 h, Paraffin (Schmelzpunkt 62-64 °C) für 1 h und dann die Gewebe in eine 3:1-Mischung aus Paraffin (Schmelzpunkt 62-64 °C) und Paraffin (Schmelzpunkt 52-54 °C) einbetten.
    7. Schnitten Sie das Gewebe mit einer Dicke von 6 μm. Bewahren Sie sorgfältig identische relative Positionen der Querschnitte auf, indem Sie das Vorhandensein und die Größe eines anatomischen Landmarks (septomarginale Trabecula) im rechten Ventrikel bestätigen. Bestätigen Sie eine Landmarke mit moderater Länge auf jedem Abschnitt(Abbildung 5B,Pfeil).
    8. Machen Sie zwei elektronische Lineale mit Logo-Programmierer: Lineal 1 ist eine gerade Linie mit 7 Radius-Messlinien, die am Mittelpunkt befestigt sind, mit 22,5° zwischen zwei benachbarten Messlinien. Lineal 2 besteht nur aus zwei senkrechten Linien in T-Form (Abbildung 5B).
    9. Messen Sie mit zwei Softwareprogrammen: Adobe Photoshop und ImageJ.
      1. Ändern Sie in Photoshop die Größe von Lineal 1 (KEINE Umformung), um die beiden Enden des Lineals an den beiden Enden der freien rechtsventrikulären Wand zu platzieren, sodass die sieben Maßlinien auf Lineal 1 jeweils auf die innere rechte Ventrikelwand treffen. Verwenden Sie dann Lineal 2, um senkrechte Messungen von der innen- zur äußeren Ventrikelwand durchzuführen (Abbildung 5B).
      2. Verwenden Sie ImageJ, um die sieben Messungen für jedes Herz durchzuführen.
    10. Analysieren Sie je nach Bedarf die sieben Messungen oder den Mittelwert für eine repräsentative rechtsventrikuläre Wandstärke. Normalisieren Sie sich auf das ganze Herzgewicht für spezifische ventrikuläre Wanddickenänderungen.

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Ergebnisse

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Belichtungsergebnisse
Luftzellen-Injektion
Die Injektion von Luftzellen kann sich entwickelnde Hühnerembryonen effektiv verschiedenen Wirkstoffen aussetzen, die anschließend in den gesammelten Proben (Serum, Gewebe usw.) von Embryonen / schlüpfenden Hühnern nachgewiesen werden können. Hier ist ein Beispiel, bei dem Perfluoroctansäure (PFOA) in Luftzellen injiziert wurde und die Serum-PFOA-Konzentrationen dann mit Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie bestimmt wurden. Die Serumkonzentrati...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Hühnerembryo ist seit 200 Jahren ein klassisches Modell in Entwicklungsstudien1. Unsere in diesem Manuskript vorgestellten Methoden wurden bei der Bewertung mehrerer Umweltkontaminanten, einschließlich Perfluoroctansäure, Feinstaub und Dieselabgasen, mit Erfolg5,7,8,9,10,11,

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Grant No. 91643203, 91543208, 81502835).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4% phosphatgepuffertes FormaldehydfixiermittelBiosharp, Hefei, ChinaREF: BL539A
75% EthanolGuoyao, Shanghai, ChinaCAS:64-17-5
Biosignalisierungsmonitor BL-420E +Taimeng, Chengdu, ChinaBL-420E+
DurchleuchtungslampeZhenwei, Dezhou, ChinaWZ-001
EinwegspritzeZhiyu, Jiangsu, China
EierbrutkastenKeyu, Dezhou, ChinaKFX
Elektrische BalanceOHAUS, Shanghai, ChinaAR 224CN
Elektrothermischer InkubatorShenxian, Shanghai, ChinaDHP-9022
Ethanol absolutGuoyao, Shanghai, ChinaCAS:64-17-5
Fruchtbares HühnereiJianuo, Jining, China
Hämatoxylin- und Eosin-FärbekitBeyotime, Peking, ChinaC0105
Histologie ParaffinAladdin, Shanghai, ChinaP100928-500gSchmelzpunkt 52~54 & deg; C
Histologie ParaffinAladdin, Shanghai, ChinaP100936-500gSchmelzpunkt 62~64°
C IV KatheterKDL, Zhejiang, ChinaDie Katheter müssen aus weichem Kunststoff sein.
LentivirusGenechem, Shanghai, ChinaDie Lentiviren wurden von Genechem individuell entwickelt/synthetisiert.
Masson's Trichrom-FärbekitSolarbio, Peking, ChinaG1340
MetallsondeJinuotai, Peking, China
Mikroinjektor (5 uL)Anting, Shanghai, China
MikroskopCAIKON, Shanghai, ChinaXSP-500
MikrotomLeica, DeutschlandHistoCore BIOCUT
Mikrotom KlingeLeica,DeutschlandLeica 819
Pentobarbituales NatriumYitai Technology Co. Ltd.,  Wuhan, ChinaCAS: 57-33-0
Pipetter (10ul)Sartorius, Deutschland
PovidoniodidLongyuquan, Taian, China
SchereAnqisheng, Suzhou, China
Sterile KochsalzlösungKelun, Chengdu, China
SonnenblumenölMighty Jiage, Jiangsu, ChinaJedes handelsübliche Sonnenblumenöl für den menschlichen Verzehr sollte funktionieren
TapeM& G, Shanghai, China
Tedlar PVF-Beutel (5L)Delin, Dalian, China
Vortex-MischerSCILOGEX, Rocky Hill, CT, USMX-F
XylolGuoyao,Shanghai,ChinaCAS:1330-20-7

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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