Methodenartikel

Abschätzung von Urin-Nanokristallen beim Menschen mittels Calciumfluorophor-Markierung und Nanopartikel-Tracking-Analyse

DOI:

10.3791/62192

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9. Februar 2021

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1Department of Urology, University of Alabama at Birmingham

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ziel dieser Studie war es, festzustellen, ob die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) Kalzium im Urin, die Nanokristalle von gesunden Erwachsenen enthält, nachweisen und quantifizieren kann. Die Ergebnisse der aktuellen Studie deuten darauf hin, dass NTA ein potenzielles Werkzeug zur Abschätzung von Urin-Nanokristallen während einer Nierensteinerkrankung sein könnte.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nierensteine werden weltweit bei Erwachsenen und Kindern immer häufiger. Die häufigste Art von Nierenstein besteht aus Calciumoxalat (CaOx) Kristallen. Kristallurie tritt auf, wenn Urin mit Mineralien (z. B. Kalzium, Oxalat, Phosphat) übersättigt wird und der Nierensteinbildung vorausgeht. Standardmethoden zur Beurteilung der Kristallurie in Steinbildnern umfassen Mikroskopie, Filtration und Zentrifugation. Diese Methoden detektieren jedoch in erster Linie Mikrokristalle und keine Nanokristalle. Es wurde angenommen, dass Nanokristalle für Nierenepithelzellen schädlicher sind als Mikrokristalle in vitro. Hier beschreiben wir die Fähigkeit der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), menschliche Harnnanokristalle nachzuweisen. Gesunde Erwachsene wurden mit einer kontrollierten Oxalatdiät gefüttert, bevor sie eine Oxalatladung tranken, um die Nanokristalle im Urin zu stimulieren. Urin wurde für 24 Stunden vor und nach der Oxalatbelastung gesammelt. Die Proben wurden verarbeitet und mit Ethanol gewaschen, um die Proben zu reinigen. Urin-Nanokristalle wurden mit dem calciumbindenden Fluorophor Fluo-4 AM gefärbt. Nach der Färbung wurden Größe und Anzahl der Nanokristalle mit NTA bestimmt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass NTA Nanokristallurie bei gesunden Erwachsenen effizient nachweisen kann. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass NTA eine wertvolle Früherkennungsmethode für Nanokristallurie bei Patienten mit Nierensteinerkrankungen sein könnte.

Einleitung

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Harnkristalle bilden sich, wenn urin mit Mineralien übersättigt wird. Dies kann bei gesunden Personen auftreten, ist aber häufiger bei Personen mit Nierensteinen1. Das Vorhandensein und die Ansammlung von Harnkristallen kann das Risiko erhöhen, einen Nierenstein zu entwickeln. Insbesondere tritt dies auf, wenn Kristalle an Randalls Plaque binden, nukleieren, sich ansammeln und im Laufe der Zeitwachsen 2,3,4. Kristallurie geht der Nierensteinbildung voraus und die Beurteilung der Kristallurie kann einen prädiktiven Wert in Nierensteinmalern haben3,5. Insbesondere wurde die Kristallurie als nützlich angesehen, um das Risiko eines erneuten Auftretens von Steinen bei Patienten mit einer Geschichte von Calciumoxalat, dieSteine 6,7enthält, vorherzusagen.

Es wurde berichtet, dass Kristalle die Nierenepithel- und zirkulierende Immunzellfunktion negativ beeinflussen8,9,10,11,12,13. Es wurde bereits berichtet, dass zirkulierende Monozyten aus Calciumoxalat (CaOx) Nierensteinmalern die zelluläre Bioenergetik im Vergleich zu gesunden Personen unterdrückt haben14. Darüber hinaus reduzieren CaOx-Kristalle die zelluläre Bioenergetik und stören die Redox-Homöostase in Monozyten8. Der Verzehr von oxalatreichen Mahlzeiten kann kristalline Kristallurie verursachen, die zu Nierentubulischäden führen und die Produktion und Funktion von Makromolekülen im Urin verändern kann, die vor Nierensteinbildung schützen15,16. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Harnkristalle in Form und Größe variieren können, abhängig vom pH-Wert und der Temperatur des Urins17,18,19. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Harnproteine das Kristallverhalten modulieren20. Daudon et al.19schlugen vor, dass die Kristallurie-Analyse bei der Behandlung von Patienten mit Nierensteinerkrankungen und bei der Beurteilung ihres Ansprechens auf Therapien hilfreich sein könnte. Einige konventionelle Methoden, die derzeit zur Verfügung stehen, um das Vorhandensein von Kristallen zubewerten,umfassen Polarmikroskopie21,22, Elektronenmikroskopie23, Partikelzähler3, Urinfiltration24, Verdampfung3,5 oder Zentrifugation21. Diese Studien haben wertvolle Einblicke in das Nierensteinfeld in Bezug auf Kristallurie geliefert. Eine Einschränkung dieser Methoden war jedoch die Unfähigkeit, Kristalle mit einer Größe von weniger als 1 μm zu visualisieren und zu quantifizieren. Kristalle dieser Größe können das Wachstum von CaOx-Steinen beeinflussen, indem sie an Randalls Plaque befestigt werden.

Es wurde gezeigt, dass Nanokristalle im Vergleich zu größeren Mikrokristallen eine umfangreiche Verletzung der Nierenzellen verursachen25. Das Vorhandensein von Nanokristallen wurde im Urin unter Verwendung eines Nanopartikelanalysators26,27berichtet. Jüngste Studien haben fluoreszierend markierte Bisphosphatsonden (Alendronat-Fluorescein/Alendronat-Cy5) verwendet, um Nanokristalle mit nanoskaliger Durchflusszytometrie zu untersuchen28. Die Einschränkung dieses Farbstoffs besteht darin, dass er nicht spezifisch ist und an fast alle Arten von Steinen außer Cystein bindet. Daher kann die genaue Beurteilung des Vorhandenseins von Nanokristallen bei Einzelpersonen ein wirksames Werkzeug zur Diagnose von Kristallurie und / oder zur Vorhersage des Steinrisikos sein. Ziel dieser Studie war es, kalziumhaltige Nanokristalle (größe <1 μm) mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) nachzuweisen und zu quantifizieren. Um dies zu erreichen, wurde die NTA-Technologie in Kombination mit einem calciumbindenden Fluorophor, Fluo-4 AM, verwendet, um kalziumhaltige Nanokristalle im Urin gesunder Erwachsener nachzuweisen und zu quantifizieren.

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Protokoll

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Alle in dieser Arbeit beschriebenen Experimente wurden vom Institutional Review Board der University of Alabama at Birmingham (UAB) genehmigt. Gesunde Erwachsene (33,6 ± 3,3 Jahre alt; n = 10) wurden in die Studie aufgenommen, wenn sie ein normales blutintensives Stoffwechselpanel, Nicht-Tabakkonsumenten, nicht schwangere, einen BMI zwischen 20-30 kg /m2und frei von chronischen Erkrankungen oder akuten Krankheiten hatten. Gesunde Teilnehmer unterzeichneten vor Beginn der Studie eine schriftliche Einverständniserklärung.

1. Klinisches Protokoll und Urinsammlung

  1. Lassen Sie die Teilnehmer eine oxalatarme Diät konsumieren, die vom UAB Center for Clinical and Translational Sciences Bionutrition Core für 3 Tage zubereitet wird, und fasten Sie über Nacht, bevor Sie ihren Urin sammeln (24-Stunden-Probe).
  2. Lassen Sie die Teilnehmer am nächsten Tag ihre 24-Stunden-Urinprobe (Pre-Oxalat) zurückgeben, bevor sie eine Oxalatladung (Smoothie mit Obst und Gemüse, ~ 8 mM Oxalat) konsumieren. Lassen Sie die Teilnehmer anschließend ihren Urin für 24 Stunden sammeln (Post-Oxalat-Probe) und geben Sie ihren Urin am nächsten Tag zurück.
  3. Halten Sie alle Urinproben vor der Verarbeitung wie unten beschrieben und in Abbildung 1dargestellt bei Raumtemperatur (RT) .

2. Urinaufbereitung

HINWEIS: Alle verwendeten Materialien und Geräte sind in der Materialtabelleaufgeführt.
ACHTUNG: Tragen Sie beim Umgang mit klinischen Proben und Reagenzien jederzeit persönliche Schutzausrüstung. Insbesondere Handschuhe, Gesichts- und Augenschutz, Atemschutz und Schutzkleidung.

  1. Messen und aufzeichnen Sie den pH-Wert und das Volumen des Urins. Mischen Sie gründlich, bevor Sie 50 ml Urin in ein markiertes steriles 50 ml konisches Röhrchen geben.
  2. Zentrifugenprobe bei 1200 x g für 10 min bei RT mit einer Tischzentrifuge.
    HINWEIS: Halten Sie die Probe bei RT, um eine weitere Kristallbildung zu verhindern, da kühlere Temperaturen die Kristallisation fördern können.
  3. Entsorgen Sie den Überstand und waschen und resuspendieren Sie das Pellet erneut mit 5 mL 100% Ethanol. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1200 x g für 10 Minuten bei RT mit einer Tischzentrifuge.
  4. Entsorgen Sie den Überstand und schleudern Sie das Pellet in 1 ml 100% Ethanol wieder auf. Lagern Sie die Probe bei -20 °C für die spätere Verarbeitung ODER färben Sie die Probe wie unten beschrieben.
    HINWEIS: Es gibt keinen signifikanten Unterschied in den Datenpunkten (d. h. Partikelgröße/-konzentration) zwischen gelagerten oder frisch gefärbten Proben.

3. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)

  1. Probenvorbereitung
    1. Gold-Nanopartikel: Verwenden Sie Gold-Nanopartikel, um die Einstellungen am Instrument zu optimieren. Verdünnen Sie 100 nm große Goldnanopartikel 1:1000 in Reinstwasser.
    2. Menschlicher Urin: Verdünnen Sie Urinproben 20 Mal in Wasser, bevor Sie sie mit 5 mM Fluo-4 AM (einem Kalziumfluoreszenzfarbstoff) für 30 Minuten im Dunkeln färben. Analysieren Sie die Proben mit NTA.
    3. Herstellung von Calciumoxalat (CaOx) Kristallen wie zuvor beschrieben29. 10 mM Stammlösung (14,6 mg in 10 ml Wasser) auf 50 μM in Wasser verdünnen und die verdünnten Proben vor der Analyse 30 min im Dunkeln mit 5 mM Fluo-4 AM färben.
    4. Calciumphosphat (CaP)-Kristalle: 10 mM Stammlösung (50,4 mg in 10 ml Wasser) auf 50 μM in Wasser verdünnen und die verdünnten Proben vor der NTA-Analyse 30 min lang mit 5 mM Fluo-4 AM im Dunkeln färben.
  2. Geräte-Setup, Kameraeinstellungen und Datenerfassung
    HINWEIS: Die für diese Methode verwendete Computer- und Instrumenteneinrichtung ist in Abbildung 2 dargestellt.
    1. Schalten Sie den Computer und dann das Instrument ein. Öffnen Sie die Software und schalten Sie die Kamera ein.
    2. Sobald das Softwarefenster geöffnet ist, klicken Sie auf das Aufnahmesymbol in der oberen linken Ecke des Fensters, um den Aufnahmemodus zu starten. Die Initialisierung der Kamera dauert einige Sekunden.
    3. Reinigen Sie die Plattform, indem Sie zuerst Luft mit einer 1-ml-Spritze in sie pumpen, bis die Plattform sauber erscheint. Fügen Sie dem Gerät 2-3 Mal vorsichtig Wasser hinzu, indem Sie eine weitere 1-ml-Spritze verwenden, um Luftblasen zu entfernen.
      HINWEIS: Achten Sie sowohl auf luftige Blasen in der Plattform als auch im Schlauch. Es ist wichtig, dass vor und während des Probenlaufs keine Blasen im gesamten Gerät zu sehen sind. Wenn Blasen vorhanden sind, reinigen Sie die Plattform erneut mit Luft und Wasser.
    4. Sobald die Plattform sauber ist, fügen Sie Wasser hinzu, um die Oberfläche auf Verunreinigungen zu überprüfen, indem Sie die Kamera betrachten. Als nächstes fügen Sie Goldnanopartikel als Kontrolle zum Probenladepumpeninjektor hinzu, um das Instrument einzurichten.
    5. Passen Sie die Kameraebene auf dem Bildschirm oder am Knopf auf der rechten Seite des Instruments an, bis das Bild beginnt, farbige Pixel anzuzeigen, und reduzieren Sie dann die Kameraebene.
    6. Passen Sie dann den Bildschirm an, um das Bild zu optimieren. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Videobild. Halten Sie die linke Maustaste gedrückt und ziehen Sie das Bild nach oben und unten, um die gesamte Ansicht zu erhalten.
      HINWEIS: Das normale Kameraobjektiv und der Filter werden verwendet, um Goldnanopartikel und nicht gefärbte Proben zu bewerten.
    7. Stellen Sie die Infusionsgeschwindigkeit ein und fokussieren Sie die Kamera so, dass die Goldnanopartikel auf dem Kamerabildschirm sichtbar sind. Stellen Sie die Infusionsgeschwindigkeit für die Erstaufteilung auf hoch (d. h. 500 μL / min) ein, um sicherzustellen, dass die Goldnanopartikel detektiert werden. Reduzieren Sie die Geschwindigkeit nach der Erkennung auf 50 μL/min.
    8. Passen Sie die Kameraebene an, um die Partikel zu visualisieren. Bei nicht gefärbten Proben passen Sie die Bildschirmverstärkung auf Stufe 5 an, um den Kamerafokus zu erreichen, und stellen Sie die Kameraebene auf 8 ein. Sobald der Fokus eingestellt ist, zeichnen Sie die Probe auf (d. h. 1 Messung für nur 60 Sekunden).
      HINWEIS: Der Fokus und die kontinuierliche Strömungsgeschwindigkeit sind wichtig, um klare und scharfe Bilder der Partikel zum Zählen zu erhalten.
    9. Reinigen Sie das Gerät nach der Optimierung erneut mit Wasser, bevor Sie die Proben entnehmen. Sehen Sie sich die Kamera an, um sicherzustellen, dass der Schlauch sauber ist und keine Partikel vorhanden sind.
      HINWEIS: Waschen Sie die Kammer zwischen jeder Probe, bis keine Partikel von der Kamera erkannt werden.
    10. Um gefärbte Proben zu analysieren, stellen Sie die Kamera auf die Filterposition ein, die den geeigneten Fluoreszenzfilter enthält. Laden Sie verdünnte und gefärbte Proben auf den Probenladepumpeninjektor und reduzieren Sie die Geschwindigkeit für die Analyse der Probe auf 20 μL/min.
    11. Als nächstes passen Sie die Bildschirmverstärkung und den Kamerapegel an, da dies wichtige Parameter sind. Stellen Sie bei gefärbten (fluoreszierenden) Proben die Bildschirmverstärkung auf 5 und die Kameraebene auf Stufe 13 ein.
      HINWEIS: Diese Parameter variieren je nach Probentyp und jede Probe muss optimiert werden, um den Fokus zu erhalten.
    12. Verwenden Sie die Standardmessung, um die Proben für 5 Aufnahmen pro Probe zu messen, wobei eine Erfassungsdauer 60 Sekunden beträgt.
    13. Speichern und speichern Sie Daten nach jeder Messung. Die Software speichert Bild- und Videodateien für jede Messung. Die Software liefert Ausgabedaten (z.B. Kristallgröße: 10 nM - 1000 nM und Konzentration) sowohl im Excel- als auch im PDF-Format.
    14. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Nanopartikeln für alle 5 Messwerte für jede einzelne Probe. Analysieren Sie die Daten mit Standardabweichung oder Standardfehler des Mittelwerts und verwenden Sie t-Tests für die gepaarte Analyse.

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Ergebnisse

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Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass NTA die mittlere Größe und Konzentration von kalziumhaltigen Nanokristallen im Urin im menschlichen Urin effizient nachweisen kann. Dies wurde durch die Verwendung der Fluorophor-, Fluo-4 AM- und Nanopartikel-Tracking-Analyse erreicht. Fluo-4 AM konnte sowohl an CaOx- als auch an CaP-Kristalle binden. Wie in Abbildung 3Agezeigt, wurden CaOx-Kristalle als zwischen 50 und 270 nm groß bestimmt und haben eine mittlere Konzentration von 1,26 x 109

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Diskussion

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NTA wurde in der vorliegenden Studie verwendet, um Nanokristalle im menschlichen Urin mit einer Kalziumbindungssonde, Fluo-4 AM, zu bewerten. Es gibt keine Standardmethode, um Nanokristalle im Urin nachzuweisen. Einige Forschungsgruppen haben Nanokristalle im Urin nachgewiesen und sich auf die Verwendung umfangreicher Protokolle oder Methoden verlassen, die in ihrer Fähigkeit, die Proben zu quantifizieren, begrenzt sind27,28. Diese Studie zeigt eine spezifische u...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken allen Studienteilnehmern und dem UAB CCTS Bionutrition Core und dem UAB High Resolution Imaging Service Center für ihre Beiträge. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse DK106284 und DK123542 (TM) sowie UL1TR003096 (National Center for Advancing Translational Sciences) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
TischzentrifugeJouan ZentrifugeCR3-12
Calciumoxalat-Monohydratzuvor beschrieben im Labor synthetisiert29. Bei RT lagern; Lager 10 mM
Calciumphosphatkristalle (Hydroxylapatit-Nanopulver)Sigma677418Bei RT lagern; Lager 10 mM
EthanolFischer Scientific AC615095000bei RT lagern; Aktie 100%
Fluo-4 AM*AAT Bioquest, Inc.20550Im Gefrierschrank lagern (-20°; C); Lager 5 mM
Gold NanopartikelSigma742031Lagern bei 2-8°; C
NanoSight InstrumentMalvern Instruments, UKNS300
SpritzenpumpeHarvard Apparatus98-4730
Virkon DesinfektionsmittelLanXESS Energizing Company, DeutschlandLSP
*Fluoreszenzfarbstoffe sind lichtempfindlich; Vorräte und Aliquote sollten im Dunkeln bei -20°C gelagert werden.
Wie

Referenzen

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