Funktionelle Charakterisierung endogen exprimierter humaner RYR1-Varianten

Summary

Hier werden Methoden zur Untersuchung der funktionellen Wirkung von RYR1-Mutationen beschrieben, die endogen in immortalisierten menschlichen B-Lymphozyten und muskelbiopsiebasierten Satellitenzellen exprimiert werden, die in Myotuben differenziert sind.

Abstract

Mehr als 700 Varianten des RYR1-Gens wurden bei Patienten mit verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen identifiziert, darunter maligne Hyperthermie-Anfälligkeit, Kernmyopathien und zentronukleäre Myopathie. Aufgrund der vielfältigen Phänotypen, die mit RYR1-Mutationen verbunden sind, ist es von grundlegender Bedeutung, ihre funktionellen Wirkungen zu charakterisieren, um Varianten, die von Patienten getragen werden, für zukünftige therapeutische Interventionen zu klassifizieren und nicht-pathogene Varianten zu identifizieren. Viele Labore waren daran interessiert, Methoden zur funktionellen Charakterisierung von RYR1-Mutationen zu entwickeln, die in Patientenzellen exprimiert werden. Dieser Ansatz hat zahlreiche Vorteile, darunter: Mutationen werden endogen exprimiert, RyR1 ist nicht überexprimiert, die Verwendung von heterologen RyR1-exprimierenden Zellen wird vermieden. Da Patienten jedoch neben RYR1 Mutationen in verschiedenen Genen aufweisen können, ist es wichtig, Die Ergebnisse aus biologischem Material von Individuen mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund zu vergleichen. Das vorliegende Manuskript beschreibt Methoden, die entwickelt wurden, um die funktionellen Effekte endogen exprimierter RYR1-Varianten zu untersuchen: (a) Epstein-Barr-Virus immortalisierte menschliche B-Lymphozyten und (b) Satellitenzellen, die aus Muskelbiopsien gewonnen und in Myotuben differenziert wurden. Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration, die durch die Zugabe eines pharmakologischen RyR1-Aktivators ausgelöst werden, werden dann überwacht. Der ausgewählte Zelltyp wird mit einem ratiometrischen fluoreszierenden Calciumindikator beladen und intrazelluläre [Ca^2+]Veränderungen werden entweder auf Einzelzellebene durch Fluoreszenzmikroskopie oder in Zellpopulationen mit einem Spektrofluorometer überwacht. Die Ruhedosis-Wirkungskurven [Ca^2+]werden dann zwischen Zellen gesunder Kontrollen und Patienten mit RYR1-Varianten verglichen, was zu einem Einblick in die funktionelle Wirkung einer bestimmten Variante führt.

Introduction

Bis heute wurden mehr als 700 RYR1-Varianten in der menschlichen Bevölkerung identifiziert und mit verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter maligne Hyperthermie-Suszeptibilität (MHS), belastungsinduzierte Rhabdomyolyse, zentrale Kernerkrankung (CCD), Multi-Minicore-Erkrankung (MmD), zentronukleäre Myopathie (CNM)^1,2,3 ; Dennoch hinken Studien zur Charakterisierung ihrer funktionellen Effekte hinterher und nur etwa 10% der Mutationen wurden funktionell getestet. Verschiedene experimentelle Ansätze können verwendet werden, um die Auswirkungen ....

Protocol

Die nachfolgend beschriebenen Protokolle entsprechen den Ethikrichtlinien der Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.

1. Herstellung von Epstein Barr immortalisierten B-Lymphozyten-Zelllinien¹¹

1. Sammeln Sie nach Einverständniserklärung 30 ml Vollblut in EDTA-behandelten sterilen Röhrchen aus dem Probanden, der eine RYR1-Mutation trägt, und von gesunden Familienmitgliedern ohne Mutation.
   HINWEIS: Halten Sie alle Lösungen steril und arbeiten Sie in einer Gewebekulturhaube.
2. Isolierung mononukleärer Zellen aus Vollblut durch Dichtegradientenzentrifugationsmedien (z. B. Ficoll-Hypaque, 0,0....

Results

[Ca²⁺]_i Messungen in Populationen von EBV-immortalisierten B-Lymphozyten
Primäre B-Lymphozyten exprimieren die RyR1-Isoform, die während B-Zell-Antigenrezeptor-stimulierten Signalprozessen als Ca^{2+-Freisetzungskanal} fungiert¹⁷. Die Immortalisierung von B-Zellen mit EBV, ein Verfahren, das routinemäßig von Genetikern verwendet wird, um Zelllinien zu erhalten, die genomische Infor.......

Discussion

Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle wurden von mehreren Labors erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen von RYR1-Mutationen auf die Calciumhomöostase zu untersuchen. Die kritischen Schritte der in diesem Papier beschriebenen Ansätze befassen sich mit Sterilität, Zellkulturfähigkeiten und -techniken sowie der Verfügbarkeit von biologischem Material. Prinzipiell ist die Verwendung von EBV-immortalisierten B-Lymphozyten einfacher und ermöglicht es, Zelllinien zu erzeugen, die mutierte RyR1-Kanäle enthalten. Di.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Chlor-m-Kresol	Fluka	24940
Blutentnahmeröhrchen	Sarstedt	172202
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Koffein	Merk	102584
Cascade 125+ CCD-Kamera	Photometrie
Cascade 128+ CCD	Photometrie
Kreatin	Sigma-Aldrich	C-3630
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965092
DMSO	Sigma	41639
EGTA	Fluka	3778
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	Sigma-Aldrich	E9644
Ficoll Paque	Cytiva	17144002
Fötales Kälberserum	ThermoFisher Scientific	26140079
Fura-2/AM	Invitrogen Life Sciences	F1201
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630049
Pferdeserum	Thermo Fisher Scientific	16050122
Insulin	ThermoFisher Scientific	A11382II
Ionomycin	Sigma	I0634
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017015
Lanthan	Fluka	61490
Mikroperfusionssystem	ALA-Scientific	DAD VM 12 Ventilblock
Origin Software	OriginLab Corp	Software
Pennicillin/Streptomycin	Gibco Life Sciences	15140-122
Perfusionskammer POC-R	Pecon	000000-1116-079
Poly-L-Lysin	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	ThermoFisher Scientific	21875091
Spektrofluorimeter	Perkin Elmer	LS50
Thapsigargin	Calbiochem	586005
Gewebekulturschalen	Falcon	353046
Gewebekulturkolben	Falcon	353107
Gewebekultureinsätze	Falcon	353090
Trypsin/EDTA-Lösung	ThermoFisher Scientific	25300054
Visiview	Visitron Systems GmbH	Software
Zeiss Axiovert S100 TV-Mikroskop	Carl Zeiss AG
Zeiss Glasdeckgläser	Carl Zeiss AG	0727-016