Hochauflösende Untersuchungen von Proteinen in natürlichen Membranen mittels Festkörper-NMR

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt robuste grundlegende Routinen, wie isotopenmarkierte Membranproteinproben präpariert und mit modernen Festkörper-NMR-Spektroskopiemethoden hochauflösend analysiert werden können.

Zusammenfassung

Membranproteine sind für die Zellfunktion lebenswichtig und stellen daher wichtige Angriffspunkte für Medikamente dar. Die Festkörper-Kernspinresonanzspektroskopie (ssNMR) bietet einen einzigartigen Zugang, um die Struktur und Dynamik solcher Proteine in biologischen Membranen zunehmender Komplexität zu untersuchen. Hier stellen wir die moderne Festkörper-NMR-Spektroskopie als Werkzeug vor, um die Struktur und Dynamik von Proteinen in natürlichen Lipidmembranen und auf atomarer Skala zu untersuchen. Solche spektroskopischen Untersuchungen profitieren von der Verwendung hochempfindlicher ssNMR-Methoden, d.h. proton-(¹H)-detektierter ssNMR und DNP (Dynamic Nuclear Polarization) unterstützter ssNMR. Unter Verwendung des bakteriellen Beta-Fass-Proteins BamA und des Ionenkanals KcsA stellen wir Methoden zur Herstellung isotopenmarkierter Membranproteine und zur Ableitung von Struktur- und Bewegungsinformationen mittels ssNMR vor.

Einleitung

Struktur- und Bewegungsstudien von Membranproteinen in physiologisch relevanten Umgebungen stellen eine Herausforderung für traditionelle strukturbiologische Techniken^{dar 1}. Moderne Festkörper-Kernspinresonanzspektroskopie (ssNMR)-Methoden bieten einen einzigartigen Ansatz für die Charakterisierung von Membranproteinen ^2,3,4,5,6,7 und werden seit langem zur Untersuchung von Membranproteinen eingesetzt, einschließlich membraneingebetteter Proteinpumpen⁸, Kanäle ^9,10,11 oder Rezeptoren ^12,13,14,15. Technische Fortschritte wie ultrahohe Magnetfelder >1.000 MHz, schnelle Drehfrequenzen mit magischen Winkeln >100 kHz und Hyperpolarisationstechniken¹⁶ haben die ssNMR als leistungsfähige Methode für die Untersuchung von Membranproteinen in Umgebungen mit ständig zunehmender Komplexität etabliert, von Liposomen über Zellmembranen bis hin zu ganzen Zellen. Zum Beispiel ist DNP zu einem leistungsfähigen Werkzeug für solche Experimente geworden (siehe Referenz 17,18,19,20,21,22,23,24,25). In jüngerer Zeit bietet ^{die 1}H-detektierte ssNMR zunehmend Möglichkeiten, Membranproteine mit hoher spektraler Auflösung und Empfindlichkeit zu untersuchen 25,26,27,28,29. Diese Arbeit beleuchtet zwei bakterielle Membranproteine, die an essentiellen Funktionen beteiligt sind, d.h. an der Proteininsertion und dem Ionentransport. Die entsprechenden Proteine, BamA 25,30,31,32,33 und KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39 (oder chimäre Varianten davon ^10,40) wurden mittels ssNMR untersucht Methoden seit mehr als einem Jahrzehnt.

Ein repräsentatives Protokoll für die Aufbereitung und ssNMR-Charakterisierung von Membranproteinen bakteriellen Ursprungs wird hier vorgestellt. Die verschiedenen Schritte des Protokolls sind in Abbildung 1 dargestellt. Zunächst wird die Expression, Isotopenmarkierung, Reinigung und Membranrekonstitution von BamA erläutert. Anschließend wird ein allgemeiner Arbeitsablauf für die Charakterisierung des Membranproteins mittels ssNMR vorgestellt; insbesondere die Zuweisung von Membranprotein-Rückgraten mittels ¹H-detektierter ssNMR bei schnellem Magic Angle Spining. Schließlich werden der grundlegende Aufbau und die Erfassung von Experimenten, die die dynamische Kernpolarisation (DNP) unterstützen und die Empfindlichkeit des ssNMR-Signals signifikant erhöhen, detailliert beschrieben.

Protokoll

1. Herstellung von einheitlich gekennzeichnetem BamA-P4P5 mit ²H, ¹³C, ¹⁵N gekennzeichnetem BamA-P4P5

HINWEIS: Während dieses Protokoll die Arbeit mit nicht-pathogenen gramnegativen Bakterien erfordert, ist die Einhaltung grundlegender biologischer Sicherheitsverfahren ein Muss, nämlich das Tragen von Schutzbrille, Laborkitteln, Handschuhen und die Befolgung institutioneller Standardarbeitsanweisungen für die Arbeit mit Mikroorganismen.

1. Es wird eine einzelne Kolonie von E. coli BL 21 Star (DE3) verwendet, die das für E. coli BamA-P4P5 kodierende Plasmid pET11aΔssYaeT enthält, um 50 ml Lysogenese-Bouillon zu impfen, die mit 50 μg/l Ampicillin ergänzt ist.
2. Wachsen Sie die Kultur bei 37 °C bei 200 U/min, bis ein OD₆₀₀ von 0,6 erreicht ist. Bei 2.000 x g für 10 min schleudern. Das Pellet wird in 50 ml M9 (siehe Tabelle 1) auf einen maximalen OD₆₀₀ von 0,1 resuspendiert.
   HINWEIS: Alle zukünftigen Wachstumsschritte finden unter den oben genannten Bedingungen statt, sofern nicht anders angegeben.
3. Vergrößern Sie die Kultur bis zu OD₆₀₀ von 0,5. Bei 2.000 x g 10 min bei Raumtemperatur schleudern. Das Pellet wird in 50 ml M9 mit einem Gehalt von 90 % D₂O (Rezeptur siehe Tabelle 1 ) auf einen maximalen OD₆₀₀ von 0,1 resuspendiert. Lass die Kultur über Nacht bei 30 °C bei 200 U/min wachsen.
4. Schleudern Sie die Kultur bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur herunter. Das Pellet in den vorgewärmten 50 mL 90 % D₂O M9 auf einen maximalen OD₆₀₀ von 0,1 resuspendieren. Wachsen, bis ein OD₆₀₀ von 1,0 erreicht ist.
5. Schleudern Sie die Kultur bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur herunter. Bereiten Sie 100 ml 100%iges_D2O M9-Medium mit isotopenangereicherten Mengen an nicht angereicherter Glukose und Ammoniumchlorid vor. Resuspendieren Sie in 100 % D₂O M9 Medium bis zu einem maximalen OD₆₀₀ von 0,1. Wachsen, bis ein OD₆₀₀ von 0,7 erreicht ist.
6. Schleudern Sie die Kultur bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur herunter. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 500 ml 100 % D₂O M9-Medium mit Isotopen (siehe Tabelle 1) bis zu einem Maximum OD₆₀₀ von 0,1 resuspendiert.
7. Lassen Sie die Kultur wachsen, bis ein OD₆₀₀ von 0,6-0,9 erreicht ist. Induzieren Sie mit 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). 4 h exprimieren und Zellen bei 4.000 x g für 15 min bei Raumtemperatur ernten.

2. Reinigung, Wiederfaltung und Bildung von BamA-P4P5-Proteo-Liposomen

HINWEIS: Alle Schritte dieses Abschnitts sollten in einem Abzug durchgeführt werden. Besondere Vorsicht ist geboten beim Öffnen der Röhrchen nach der Zentrifugation zur Begrenzung schädlicher Aerosole.

1. Tauen Sie das Pellet auf Eis auf. Das Pellet wird in 20 ml kaltem Puffer 1 resuspendiert. Siehe Tabelle 2 für die Puffer.
2. Schleudern Sie die Lösung bei 4.000 x g für 20 min bei 4 °C herunter. Das Pellet wird in 20 ml kalt destilliertem H₂O resuspendiert. Die Suspension wird 10 Minuten lang auf Eis inkubiert.
3. Die Suspension bei 4.000 x g für 20 min bei 4 °C herunterschleudern. In 10 mL kaltem Puffer 2 resuspendieren und 30 min auf Eis inkubieren lassen.
4. Ergänzen Sie die Mischung mit weiteren 10 mL kaltem Puffer 2 und inkubieren Sie weitere 30 Minuten auf Eis. 0,5 % n-Dodecyl-B-D-Maltosid (DDM) zugeben und vorsichtig schwenken.
5. Die Probe wird auf Eis bei 13 kHz beschallt, bis sie 10 s lange Ein-/Aus-Impulse auslöst. Bei 25.000 x g für 20 min bei 4 °C runterschleudern. Dreimal mit 20 ml Puffer 3 waschen. Zentrifugieren Sie bei 25.000 x g für 20 min bei 4 °C.
6. Resuspendieren Sie das Pellet in 20 mL Puffer 4. Bei 37 °C 30 min inkubieren. Die Probe wird auf Eis bei 13 kHz beschallt, bis 10 s lange Ein-/Aus-Impulse abgegeben werden.
7. Die Probe bei 25.000 x g für 20 min bei 4 °C herunterschleudern. Die Schritte 2.4 bis 2.6 werden unter Wegfall der Zugabe des Proteaseinhibitors und der Inkubation bei 37 °C wiederholt.
8. Waschen Sie das Pellet mit 20 mL Wasser und zweimal mit Buffer 3. Bei 25.000 x g für 20 min bei 4 °C runterschleudern. Aliquotieren Sie die Suspension in 1 mL Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen 20 Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit auf einer Tischzentrifuge. Die Reinheit des Einschlusskörpers wird anhand von 10 % SDS-Page-Gel bewertet, siehe Abbildung 2A. Die erwartete Ausbeute für gereinigtes BamA-P4P5 dreifach (^{2 H,13 C,15}N) beträgt 30 mg/L.
9. Solubilisieren Sie Einschlusskörper in 200 μl Puffer 5 und 300 μl H₂O. Fügen Sie 6M Guanidiumchlorid (GdnCl) hinzu. Stellen Sie das Volumen des Mikrozentrifugenröhrchens auf 1 ml mit H₂O ein. Wirbeln Sie die Mischung vor und inkubieren Sie sie 4 h lang bei Raumtemperatur. Wirbeln Sie die Mikrozentrifugenröhrchen regelmäßig (alle 30 min) durch.
10. Bei 100.000 x g 1 h bei 4 °C schleudern. Verwenden Sie das Beer-Lambertsche Gesetz, um die Proteinkonzentration um 280 nm zu bestimmen. Der molare Extinktionskoeffizient beträgt 117.120 ^{M-1 cm-1}. Bei einer Konzentration von >100 μM mit 1x Puffer 5 mit 6 M GdnCl verdünnen. Das Protein in Puffer 6 schnell 10x verdünnen. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Verwenden Sie für die Ultrazentrifugation 1,5-ml-Röhrchen in Ultrazentrifugationsqualität.
11. Bestimmen Sie die Rückfaltungseffizienz mit einem semi-nativen SDS-Page-Gel. Nehmen Sie zwei 10-μl-Aliquote aus Schritt 2.10 und fügen Sie jedem Aliquot 10 μl Lameili-Puffer (Puffer 8) hinzu. Eine Probe 10 Minuten lang bei 95 °C kochen; Lassen Sie das andere Aliquot auf Eis. Anschließend führen Sie beide Proben bei 14 mA auf einem 10%igen SDS-Page-Gel durch. Den Stapel- und Laufteilen der Gele fehlen Reduktionsmittel und SDS. Die Proteinfärbung wird mit dem Coomassie-Farbstoff erreicht. Die erwarteten Ergebnisse sind in Abbildung 2B dargestellt.
12. Die Probe bei 4.000 x g für 20 min bei 4 °C herunterschleudern. Konzentrieren Sie die Probe mit einem 30-kDa-Zentrifugalfilter auf ein Arbeitsvolumen von 8 mL. Schleudern Sie die Probe bei 4.000 x g für 20 min bei 4 °C. Messen Sie die Proteinabsorption bei 280 nm. Bestimmen Sie wie in Schritt 2.10 die Proteinkonzentration.
13. Berechnen Sie die Menge an Lipiden, die für ein Lipid-Protein-Verhältnis von 10:1 (LPR-mol/mol) erforderlich ist. Aus einem Chloroform-Stamm wird die erforderliche Menge an Lipiden, wie in Schritt 2.12 berechnet, in einen 100-ml-Rundkolben (RBF) gegeben. Evakuieren Sie das Chloroform aus dem RBF unter einem sanften Stickstoffstrahl. RBF für 3 h auf Hochvakuum stellen. Hydratisieren Sie den Lipidfilm mit 1 mL Puffer 7. RBF 10 min bei 37 °C inkubieren.
14. Geben Sie die Proteinmischung (aus Schritt 2.12) in den RBF.
15. Das Protein-Lipid-Gemisch (aus Schritt 2.14) wird auf das Endvolumen von 50 ml in der RBF verdünnt. Puffer 7 mit 1x Proteaseinhibitor, gelöst in DMSO, verwenden und 30 min bei 37 °C inkubieren.
16. Dialysieren Sie 2 Wochen lang gegen 100 Volumina Puffer 7 (verwenden Sie einen Dialyseschlauch mit einem Molekulargewicht von 12-14 kDa). In den ersten 24 Stunden ist die Dialyse bei Raumtemperatur unter Zugabe von frischem Buffer 7 alle 8 Stunden durchzuführen. Wechseln Sie danach den Puffer einmal täglich und führen Sie die Dialyse bei 4 °C durch.

3. Befüllen des ssNMR-Rotors

1. Nach Schritt 2.16 30-60 min bei 10.000 x g bei 4 °C zentrifugieren, so dass ein Pellet entsteht. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
   HINWEIS: Die unten beschriebene Technik wurde für einen 3,2-mm-Rotor optimiert, ist aber für fast jeden Rotordurchmesser anwendbar.
2. Pipettieren Sie die Probe in den Rotor und schleudern Sie sie vorsichtig mit einer Tischzentrifuge nach unten.
   HINWEIS: Abhängig von der Konsistenz der Probe kann entweder ein Verdichtungswerkzeug verwendet werden, um die Probe zu verdichten, oder ein Spatel anstelle einer Pipette, um die Probe in den Rotor zu geben.
3. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2-3x, bis der Rotor auf die richtige Höhe gefüllt ist, und prüfen Sie, ob noch genügend Platz für die Kappe vorhanden ist, wie durch die Markierungslinie auf dem Verdichtungswerkzeug angezeigt. Schließen Sie den Rotor mit dem Kappenpositionierungswerkzeug auf einer ebenen Fläche. Markieren Sie die Hälfte der Unterkante des Rotors.
   HINWEIS: Neue ssNMR-Rotorgenerationen sind mit einer dauerhaften Lasermarkierung am unteren Rand zur optischen Erfassung der Rotordrehfrequenz ausgestattet. Andernfalls wird die Verwendung eines Edding-Stifts empfohlen; da der MAS-Detektor speziell für Sharpie-Tinte optimiert wurde.
4. Überprüfen Sie mit einer Lupe, ob die Kappe gut platziert ist.

4. Probencharakterisierung mittels 2D ¹³C- ¹³C ssNMR-Spektroskopie

1. Setzen Sie den Rotor mit der automatischen Drehroutine der MAS-Einheit in den Magneten ein, drehen Sie die Probe auf die gewünschte MAS-Frequenz zwischen 10 und 20 kHz MAS, während Sie die Probe auf die eingestellte Temperatur von 270 K abkühlen. Stimmen Sie die Kanäle ¹H und ¹³C ab.
   ANMERKUNG: Bei der Wahl der MAS-Frequenz ist zu vermeiden, dass der chemische Verschiebungsabstand zwischen dem spektralen Cα-Bereich und dem Carbonylkohlenstoffbereich versehentlich an die Spinnfrequenz angepasst wird, d. h. die Rotationsresonanzbedingung erster Ordnung⁴¹ ist zu vermeiden.
2. Optimieren ^{Sie ein}1 ^H-13C Kreuzpolarisation⁴² (CP) Experiment, indem Sie die HF-Leistung auf dem Protonenkanal von 25-80 kHz variieren. Typische Parameter sind 45 kHz HF-Leistung bei ¹³C, 80-100 kHz heteronukleare ¹H-Entkopplung⁴³ während der Erfassung, 1,8-2,0 s Recycle-Verzögerung und 64 Scans.
   1. Optimieren Sie die CP-Kontaktzeit für maximale Signalempfindlichkeit an den aliphatischen Kohlenstoffen.
   2. Bestimmen Sie ¹H 90° Pulslänge im ¹³C-CP Experiment, indem Sie den Startimpuls mit vier multiplizieren, d.h. einen 360° Puls optimieren, und variieren Sie die Länge, bis das Signal verschwunden ist. Fügen Sie direkt nach dem CP-Transfer einen Rechteckpuls hinzu und optimieren Sie die ¹³C 90° Pulslänge analog.
3. Führen Sie ein ^{2D-13 C-13}C Protonengetriebenes Spindiffusionsexperiment (PDSD) wie PARIS mit einer Magnetisierungstransferzeit von 30 ms durch, um Korrelationen innerhalb der Reste zu erkennen und die Probenqualität zu messen. Übertragen Sie die Leistungspegel, die Kontaktzeit und die 90°-Pulslängen aus dem zuvor optimierten ¹³C-CP-Experiment. Verwenden Sie eine Erfassungszeit von 4-6 ms in der indirekten Dimension. Verarbeiten Sie das Spektrum mit quadrierten Sündenglockenfunktionen (QSIN) oder, für unempfindliche Proben, mit exponentieller Linienverbreiterung in beiden Dimensionen.
4. Extrahieren Sie Schichten isolierter Querpeaks und bestimmen Sie die Linienbreite in halben Höhen. Eine Linienbreite zwischen ~0,3 und 1,0 ¹³C ppm ist ein Hinweis auf eine gut geordnete Probe, ideal für die ssNMR-Charakterisierung, während eine Linienbreite über 1,0 ¹³C ppm auf eine Konformationsheterogenität hinweist, die die ssNMR-Charakterisierung beeinträchtigen kann. Das in Abbildung 3A gezeigte 2D CC PARIS-Spektrum von BamA ist ein Beispiel für ein wohlgeordnetes Protein, das qualitativ hochwertige Spektren liefert.

5. Zuweisung des Rückgrats durch ¹H-detektierte 3D-ssNMR-Spektroskopie

1. Erfassung von spektralen 2D-NH-Fingerabdrücken
   1. Füllen Sie die Probe in einen 1,3-mm-Rotor, wie oben beschrieben. Setzen Sie den Rotor in den Magneten ein, drehen Sie die Probe auf 10-20 kHz MAS und kühlen Sie die Probe auf die eingestellte Temperatur von 240-250 K oder niedriger ab, abhängig von den Spezifikationen des ssNMR-Sondenkopfes. Verwenden Sie die MAS-Einheitenschnittstelle, um die MAS-Frequenz schrittweise in Schritten von 5 kHz bis 60 kHz MAS zu erhöhen.
   2. Optimieren Sie die CP-Amplituden, Kontaktzeiten und 90°-Pulslängen in ¹³C- und ¹⁵N CP-Experimenten. Verwenden Sie Amplituden um 30-50 oder 70-100 kHz auf den heteronuklearen Kanälen und variieren Sie die Amplitude auf dem ¹H-Kanal von 80-180 kHz. Verwenden Sie eine Recyclingverzögerung von 0,7 bis 1,2 s zusammen mit einer heteronuklearen Protonenentkopplung von 15 kHz⁴⁴ mit geringer Leistung. Siehe auch Referenz⁴⁵ für weitere praktische Details zum Einrichten von CP ssNMR-Experimenten.
   3. Erfassen Sie ein 2D-NH-Experiment, ^{um die}1-H-Auflösung zu messen. Übertragen Sie die ¹⁵N-CP-Parameter und verwenden Sie eine Erfassungszeit von ca. 15 und 25 ms in den direkten und indirekten Dimensionen. Für die erste Übertragung von ¹H auf ¹⁵N CP ist die zuvor optimierte Kontaktzeit zu nutzen. Für den Rücktransfer ^{von 15}N auf ¹H ist eine Kontaktzeit von 0,7 bis 1,0 ms zu verwenden, um die Übertragung der Magnetisierung zwischen den Resten zu minimieren.
   4. Verwenden Sie 50-250 ms Wasser MISSISSIPPI Suppression⁴⁶, abhängig vom Wassergehalt der Probe. Verarbeiten Sie das Spektrum mit quadrierten Sündenglockenfunktionen (QSIN) in beiden Dimensionen. Extrahieren Sie Schichten isolierter Querpeaks und bestimmen Sie die Linienbreite in halben Höhen. Ein Beispiel für ein hochwertiges 2D-NH-Spektrum²⁵ ist für membraneingebettetes BamA-P4P5 in Figur 3B dargestellt.
2. Backbone-Zuweisungen
   1. Optimierung eines 1D-CP-Experiments mit ¹⁵N bis ¹³Cα⁴⁷. Platzieren Sie den 13-C-Träger in der Mitte des Cα-Bereichs bei etwa 55 ppm. Verwenden Sie eine ¹³C HF-Amplitude von 20 kHz und variieren Sie die ¹⁵N-Amplitude von 35 bis 45 kHz für eine maximale Übertragung auf die Cα-Signale und eine minimale Übertragung auf die Carbonylsignale. Optimieren Sie die Kontaktzeit von 3 bis 10 ms in Schritten von 1 ms.
   2. Führen Sie ein 3D-CαNH-Experiment durch. Übertragen Sie alle CP-Amplituden, Kontaktzeiten und Pulslängen aus den zuvor optimierten Schritten. Verwenden Sie ca. 10 ms und 30 ms in den Dimensionen indirekte und direkte Erfassung. Verarbeiten Sie das Spektrum mit quadrierten Sündenglockenfunktionen (QSIN) in allen drei Dimensionen.
   3. Optimierung eines 1D-Cα-zu-CO-DREAM-Magnetisierungstransfers⁴⁸. Beginnen Sie mit einem spezifischen CP-Transfer von ¹⁵N auf ¹³Cα. Übertragen Sie dann die Magnetisierung von Cα auf CO mit Hilfe einer Spinsperre auf dem ¹³C-Kanal. Variieren Sie die HF-Amplitude von 20 bis 35 kHz für eine optimale Übertragung. Optimieren Sie die Übertragungszeit von 4 auf 10 ms.
   4. Führen Sie ein 3D-Cα(CO)NH-Experiment durch. Übertragen Sie alle HF-Amplituden, Kontaktzeiten und Impulslängen aus den zuvor optimierten Schritten. Verwenden Sie ca. 10 ms und 30 ms in den Dimensionen indirekte und direkte Erfassung. Verarbeiten Sie das Spektrum mit quadrierten Sündenglockenfunktionen (QSIN) in allen drei Dimensionen.
   5. Wiederholen und adaptieren Sie die Schritte 1-4 für die analogen 3D-CONH- und CO(Cα)NH-Experimente. Verwenden Sie dieses Quartett von 3D-Experimenten für sequentielle Cα- und CO-Walks, um das Proteinrückgrat zuzuweisen, wie am Beispiel von KcsA in Abbildung 4²⁸ gezeigt.

6. Proteindynamik durch ¹H-detektierte ssNMR-Spektroskopie

1. Verwenden Sie für ¹⁵N T_1-Studien das zuvor optimierte 2D-NH-Experiment bei 60 kHz MAS und fügen Sie eine Verzögerung nach dem ersten Kreuzpolarisationsschritt ^{von 1}H auf ¹⁵N hinzu. Erfassen Sie eine Reihe von 2D-NH-Experimenten und variieren Sie die Verzögerung von 0 bis 16 s in Schritten von z. B. 0, 2, 4, 8 und 16 s.
2. Plotten Sie die normierten Intensitäten für aufgelöste Signale als Funktion der zunehmenden Verzögerungszeit. Passen Sie den Zerfall von T₁ an einzelne Exponentielle gemäß y = exp^(-x/T1) an, wobei y die Signalintensität zur Abklingzeit x ist.
3. Analog dazu ist für ¹⁵N T_1rho-Studien ein Spin-Lock-Impuls in das Pulsprogramm auf dem ¹⁵N-Kanal mit einer HF-Amplitude zwischen 15 und 20 kHz nach dem ersten ¹H bis ¹⁵N Kreuzpolarisationsschritt^26,49 aufzunehmen. Erfassen Sie eine Reihe von 2D-NH-Experimenten, variieren Sie die Verzögerung von 0 bis 150 ms und passen Sie den_{T1rho-Zerfall} aufgelöster Signale an einzelne Exponentiale an. Illustrative ¹⁵N T_1rho-Daten sind für membraneingebettete K⁺-Kanäle in Abbildung 5^27,28 dargestellt.

7. Dynamische Kernpolarisation

HINWEIS: Die folgenden vorbereitenden Schritte beziehen sich auf die Verwendung eines kommerziellen DNP-Setups mit 3,2-mm-Saphir-MAS-Rotoren (Abbildung 6)²⁰. Die Verwendung von Zirkonoxid-Rotoren oder anderen DNP-Geräten kann zu einer geringeren DNP-Signalverbesserung führen.

1. Resuspendieren Sie das Membranproteinpellet (aus Schritt 3.1) in 50 μl deuteriertem DNP-Puffer (60 % (v/v) deuteriertes d8- und Glycerin und 15 mM AMUPol⁵⁰. Für Experimente bei 800 MHz empfehlen wir die Verwendung von 10 mM NATriPOL-3⁵¹. Siehe auch Referenz⁵² für weitere praktische Aspekte zu DNP ssNMR-Experimenten.
2. 10-20 min bei 100.000 x g bei 4 °C zentrifugieren, so dass ein Pellet entsteht. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
3. Kühle den Zentrifugaladapter und die 3,2 mm Saphir-MAS-Rotorkomponenten auf <4 °C vor. Die folgenden Schritte (7.4-7.7) müssen so schnell wie möglich ausgeführt werden, um zu verhindern, dass die DNP-Agenten reduziert werden.
4. Setzen Sie den 3,2 mm Saphirrotor in den Zentrifugenadapter ein und befüllen Sie ihn mit der Suspension der Proteo-Liposomen aus Schritt 7.2.
5. Pipettieren Sie die resuspendierte Membranproteinprobe vorsichtig mit einer 200-μl-Pipettenspitze gegen die Innenwand des Rotors. Lassen Sie die Lösung bis zum Boden des Rotors gleiten. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen bilden.
6. Schleudern Sie die Probe im Rotor 5-10 Minuten lang bei 4.500 x g bei 4 °C herunter. Entfernen Sie den Überstand mit überschüssigem DNP-Saft, indem Sie ihn vorsichtig herauspipettieren, ohne das Zellpellet zu beschädigen. Wiederholen Sie die Schritte 6.4-6.6, bis der Rotor voll ist.
7. Positionieren Sie den Abstandhalter aus Polytetrafluorethylen (PTFE) vorsichtig mit der Distanzschraube oben auf dem Rotor.
8. Setzen Sie den Rotor mit der Kappe nach unten in einen Rotorkolben⁵³ und tauchen Sie den Rotor in flüssigen Stickstoff. Lassen Sie den Rotor und die Probe mindestens 30-60 s einfrieren.
9. Starten Sie die Wärmetauschereinheit und kühlen Sie die DNP-Sonde auf ~90 K ab.
10. Stellen Sie das MAS-Gerät auf den manuellen Modus und stellen Sie die variable Temperatur (VT) auf 135 l/h und den Gasfluss in Lager und Antrieb auf ~6 l/h ein.
11. Aktivieren Sie Eject auf der MAS-Konsole.
12. Übertragen Sie die gefrorene Probe aus Schritt 7.8 aus der Flüssigkeit N2 in den Probenfänger und legen Sie sie in die Sonde (siehe auch Referenz⁵³).
13. Erhöhen Sie den Sondenlagerdruck (Bp) manuell auf ~500 mbar, bevor Sie den "Einsatz" einrasten. Dies ist für ein stabiles und sicheres Drehen des Rotors ratsam.
14. Erhöhen Sie die MAS-Rate auf den gewünschten Wert mit dem in Referenz⁵³ beschriebenen Verfahren.
15. Überprüfen Sie, ob DNP-Erweiterungen mit und ohne Mikrowellen unter Verwendung von Standard-1D-CP-Experimenten (siehe auch z. B. Referenz^51,54) (Abbildung 7) durchgeführt werden, bevor Sie mit mehrdimensionalen Experimenten fortfahren, z. B. 2D-CC-Experimente, die in Abschnitt 3 dieses Artikels beschrieben werden.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt repräsentative Gele für die Reinheit des Einschlusskörpers (Panel A) und die Rückfaltung von Einschlusskörpern (Panel B3). Abbildung 2 bestätigt die erfolgreiche Aufreinigung von ^{13 C,15}N-markiertem BamA-P4P5.

Figur 3A zeigt ein typisches 2D ^{13 C-13}C Spektrum eines wohlgeordneten Membranproteins, und Abbildung 3B z...

Diskussion

Membranproteine spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation lebenswichtiger zellulärer Funktionen sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Organismen. Daher ist das Verständnis ihrer Wirkmechanismen auf atomarer Auflösungsebene von entscheidender Bedeutung. Die bestehenden strukturbiologischen Techniken haben das wissenschaftliche Verständnis von Membranproteinen ziemlich weit vorangetrieben, sich aber stark auf experimentelle Daten gestützt, die von In-vitro-Systemen ohne...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ammoniummolibdat	Merck	277908
Ammonium-15N-Chlorid	Cortecnet	CN80P50
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9518
AMUpol	Cortecnet	C010P005
Benzonase	EMD Millipore Corp	70746-3
Borsäure	Merck	B6768
Bromphenolblau	Sigma	B0126
Calciumdichlorid	Merck	499609
Cholinchlorid	Sigma	C-1879
Kobaltchlorid	Merck	449776
Kupfersulfat	Merck	C1297
D-Biotin	, Merck	8512090025
Deuteriumoxid	Cortecnet	CD5251P1000
Dimethylsulfoxid	Merck	D9170
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma Aldrich	L6876
Folsäure	Sigma	F-7876
Glukose 13C + 2H	Cortecnet	CCD860P50
Glycerin	Honeywell	G7757
Glycerin (12C3, 99,95 % D8, 98 %)	Eurisotop	CDLM-8660-PK
Glycerin (nicht angereichert)	Honeywell	G7757-1L
Glycin	Sigma Aldrich	50046
Guanidinhydrochlorid	Roth Carl	NR.0037.1
Eisensulfat	Merck	307718
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid	Thermofisher	R0392
Lysogeny Bouillon	Merck	L3022
Lysozym	Sigma Aldrich	L6876
Magnesiumchlorid - Hexahydrat	Fluka	63064
Magnesiumsulfat	Merck	M5921
Monokaliumphosphat	Merck	1051080050
Myoinositol	Sigma	I-5125
n-Dodecyl-B-D-Maltosid	Acros Organics	3293702509
N,N-Dimethyldodecylamin N-oxid	Merck	40236
Nicatinamid	Sigma	N-3376
Panthotensäure	Sigma	21210-25G-F
Proteaseinhibitor	Sigma	P8849
Pyridoxal-HCl	Sigma Aldrich	P9130
Riboflavin	Aldrich	R170-6
Natriumchlorid	Merck	K51107104914
Natriumdihydrogenphospahte - Monohydrat	Sigma Aldrich	1,06,34,61,000
Natriumdodecylsulfat	Thermowissenschaftlich	28365
Natriumhydroxid	Merck	1,06,49,81,000
Saccharose	Sigma Life Science	S9378
Thiamin-HCl	Merck	5871
Tris-HCl	Sigma Aldrich	10,70,89,76,001
Zinkchlorid	Merck	208086
E.coli BL21 DE3*	New England Biolabs	C2527
1,5 mL Ultra-Röhrchen	Beckman Schar	357448
30 kDa Zentrifugalfilter	Amicon	UFC903024
3,2 mm Saphir DNP-Rotor mit Verschlüssen	Cortecnet	H13861
3,2 mm Tefloneinsatz	Cortecnet	B6628
3,2 mm Probenein- und -auspacker	Cortecnet	B6988
3,2 mm Normalwandiger MAS Rotor	Cortecnet	HZ16913
3,2 mm normalwandiger MAS-Rotor	Cortecnet	HZ09244
Werkzeugsatz für 3,2 mm Dünnwandrotor	Cortecnet	B136904
1,3 mm MAS-Rotor + Kappen	Cortecnet	HZ14752
1,3 mm Füllwerkzeug	Cortecnet	HZ14714
1,3 mm Probenpacker	Cortecnet	HZ14716
1,3 mm Kappenentferner	Cortecnet	HZ14706
1,3 mm Kappensatz Werkzeug	Cortecnet	HZ14744
Dialyseschlauch 12-14	kDa Spectra/Por	132703
Sharpie - Schwarz	Merck	HS15094