Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes

Shiqiao Ye; Xiaoping Wan; Juan Su; Akshar Patel; Blake Justis; Isabelle Deschênes; Ming-Tao Zhao

doi:10.3791/62206

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Methodenartikel

Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes

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DOI:

10.3791/62206

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12. Februar 2021

Shiqiao Ye¹^,² , Xiaoping Wan³ , Juan Su¹^,² , Akshar Patel¹^,²^,⁴ , Blake Justis¹^,²^,⁵ , Isabelle Deschênes³ , Ming-Tao Zhao¹^,²^,⁵^,⁶

¹Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, ²The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, ³Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, ⁴Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, ⁵MCDB Graduate Program, The Ohio State University, ⁶Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur robusten Erzeugung und Erweiterung menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patienteneigenen peripheren Blutes vor.

Zusammenfassung

Die Generierung patientenspezifischer Kardiomyozyten aus einer einzigen Blutentnahme hat ein enormes Interesse an der Präzisionsmedizin bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen geweckt. Die kardiale Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) wird durch definierte Signalwege moduliert, die für die embryonale Herzentwicklung essentiell sind. Zahlreiche kardiale Differenzierungsmethoden auf 2-D- und 3D-Plattformen wurden mit unterschiedlichen Wirkungsgraden und Kardiomyozytenausbeute entwickelt. Dies hat Ermittler außerhalb des Feldes verwirrt, da die Vielfalt dieser Methoden schwer zu verfolgen sein kann. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll vor, das eine robuste Erzeugung und Erweiterung von patientenspezifischen Kardiomyozyten aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) ausarbeitet. Wir beschreiben zunächst ein hocheffizientes iPSC-Reprogrammierungsprotokoll aus der Blutprobe eines Patienten unter Verwendung von Sendai-Virusvektoren ohne Integration. Wir beschreiben dann eine kleinmolekülvermittelte Monolayer-Differenzierungsmethode, die aus den meisten menschlichen iPSC-Linien robust schlagende Kardiomyozyten herstellen kann. Darüber hinaus wird ein skalierbares Kardiomyozyten-Expansionsprotokoll unter Verwendung eines kleinen Moleküls (CHIR99021) eingeführt, das von Patienten abgeleitete Kardiomyozyten für industrielle und klinische Anwendungen schnell erweitern könnte. Am Ende werden detaillierte Protokolle zur molekularen Identifizierung und elektrophysiologischen Charakterisierung dieser iPSC-CMs dargestellt. Wir erwarten, dass dieses Protokoll für Anfänger mit begrenztem Wissen über kardiovaskuläre Entwicklung und Stammzellbiologie pragmatisch ist.

Einleitung

Die Entdeckung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen hat die moderne kardiovaskuläre Medizin revolutioniert¹^,². Menschliche iPS-Zellen sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und alle Zelltypen im Herzen zu erzeugen, einschließlich Kardiomyozyten, Endothelzellen, glatte Muskelzellen und kardiale Fibroblasten. Patienten-iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) können als unbestimmte Ressourcen für die Modellierung genetisch vererbbarer Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) und die Prüfung der kardialen Sicherheit für neue Medikamente dienen³. Insbesondere sind die iPSC-CMs der P....