Hier präsentieren wir einen einfach zu bedienenden Co-Kultur-Assay zur Analyse der Glioblastom-Migration (GBM) an gemusterten Neuronen. Wir entwickelten ein Makro in der FiJi-Software zur einfachen Quantifizierung der GBM-Zellmigration auf Neuronen und beobachteten, dass Neuronen die invasive Kapazität von GBM-Zellen modifizieren.
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Methodenartikel
Co-Kultur von Glioblastom-Stammzellen auf gemusterten Neuronen zur Untersuchung von Migration und zellulären Interaktionen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Glioblastome (GBMs), maligne Gliome des Grades IV, sind aufgrund ihrer aggressiven Eigenschaften eine der tödlichsten Krebsarten beim Menschen. Trotz signifikanter Fortschritte in der Genetik dieser Tumoren ist nicht gut bekannt, wie GBM-Zellen in das gesunde Gehirnparenchym eindringen. Insbesondere wurde gezeigt, dass GBM-Zellen über verschiedene Wege in den peritumoralen Raum eindringen; Das Hauptinteresse dieses Papiers ist der Weg entlang von White Matter Tracts (WMTs). Die Wechselwirkungen von Tumorzellen mit den peritumoralen Nervenzellkomponenten sind nicht gut charakterisiert. Hierin wurde eine Methode beschrieben, die den Einfluss von Neuronen auf die GBM-Zellinvasion bewertet. Dieser Artikel stellt einen fortschrittlichen Co-Kultur-In-vitro-Assay vor, der die WMT-Invasion nachahmt, indem er die Migration von GBM-stammähnlichen Zellen auf Neuronen analysiert. Das Verhalten von GBM-Zellen in Gegenwart von Neuronen wird durch ein automatisiertes Tracking-Verfahren mit Open-Source- und Free-Access-Software überwacht. Diese Methode ist für viele Anwendungen nützlich, insbesondere für funktionelle und mechanistische Studien sowie für die Analyse der Auswirkungen pharmakologischer Wirkstoffe, die die GBM-Zellmigration auf Neuronen blockieren können.
Einleitung
Primäre maligne Gliome, einschließlich GBMs, sind verheerende Tumore mit einer mittleren Überlebensrate von 12 bis 15 Monaten, die für GBM-Patienten berichtet werden. Die aktuelle Therapie beruht auf einer großen Tumormassenresektion und Chemotherapie in Verbindung mit einer Strahlentherapie, die die Überlebensrate nur um wenige Monate verlängert. Therapeutische Misserfolge sind eng mit einer schlechten Medikamentenabgabe über die Blut-Hirn-Schranke (BBB) und mit invasivem Wachstum in perivaskulären Räumen, Hirnhäuten und entlang der WMTs1verbunden. Perivaskuläre Invasion, auch vaskuläre Co-Option genannt, ist ein gut untersuchter Prozess, und ....
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Protokoll
Die schriftliche Einwilligung aller Patienten (vom Haukeland Hospital, Bergen, Norwegen, gemäß den Vorschriften der örtlichen Ethikkommission) wurde eingeholt. Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommissionen für Human- und Tierforschung der Universität Bordeaux. Trächtige Ratten wurden in der Tiereinrichtung der Universität Bordeaux untergebracht und behandelt. Die Euthanasie einer E18-getrhypten trächtigen Ratte wurde unter Verwendung von CO2durchgeführt. Alle Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission genehmigt. Alle kommerziellen Produkte sind in der Materialtabelle auf....
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Ergebnisse
Gemusterte Neuronen, die mit fluoreszierenden GBM-Zellen kokuliert wurden, wurden wie im Protokollabschnitt beschrieben vorbereitet und Tracking-Experimente durchgeführt. GBM-Zellen veränderten schnell ihre Form, während sie auf den Neuronen wanderten (Abbildung 1B: Panel 6 und Video 1). Zellen wanderten in einer zufälligen Bewegung entlang der neuronalen Erweiterungen (Video 1). Fluoreszierende GBM-Zellen und nicht fluoreszierende Neuronen .......
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Diskussion
Glioblastome dringen umfassend in das Parenchym ein, indem sie verschiedene Modi verwenden: Ko-Option der umgebenden Blutgefäße, interstitielle Invasion oder Invasion auf WMTs18. Dieser letztere Modus ist in der Literatur nicht gut charakterisiert, da es schwierig ist, geeignete In-vitro- oder In-vivo-Modelle im Zusammenhang mit der WMT-Invasion zu finden. Hier wurde ein vereinfachtes Modell vorgeschlagen, bei dem kultivierte Nagetierneuronen auf lamininbeschichteten Oberflächen .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole wird unterstützt von agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon ist Stipendiat des Universitätsklinikums Toulouse (CHU Toulouse).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| (3-Aminopropyl)-Triethoxysilan | Sigma | 440140-100ML | Die Aminogruppe ist nützlich für die Biokonjugation von mPEG-SVA |
| 96-Well-Rundbodenplatte | Sarstedt | 2582624 | Wird zur Herstellung von Sphäroiden verwendet |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Gelagert bei -20 &Grad; C (langfristig) oder 4 ° C (kurzfristig), Kugeldissoziationsenzym |
| B27 | Gibco | 12587 | Gelagert bei -20 &de; C, vor Gebrauch auftauen |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Gelagert bei -20 ° C, vor Gebrauch auftauen |
| Gräfin ZellzählkammerObjektträger | Invitrogen | C10283 | Zur Zellzählung |
| Deckgläser | Marienfeld | 111580 | Zellkultursubstrat |
| Exsikatorpatronen | Sigma | Z363456-6EA | Zur Reduzierung der Feuchtigkeit während der Behandlung von (3-Aminopropyl)-Triethoxysilan |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Gelagert bei 4 ° C |
| Fidschi-Software, MTrack2-Makro | ImageJ | Wird zur Analyse von Bildern | |
| verwendet Flachmann 75 cm & sup2; | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin-Natrium | Sigma | H3149-100KU | Gelagert bei 4 ° C |
| Laminin | 114956-81-9 | Fördert die neuronale Adhäsion | |
| Leonardo-Software | Laden von geplanten Mikromustern | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Automatisierungssoftware für die Mikroskopie |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Verdünnt in NBM für eine Endkonzentration von 2 % |
| Neurobasales Medium | Gibco | 21103-049 | Lagerung bei 4 & Grad; C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverses Mikroskop mit motorisiertem Tisch | ||
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Gelagert bei 4 &°; C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator zum Abbau der PEG-Bürste |
| Poly(ethylenglykol)-Succinimidylvalerat (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Wird als Antifouling-Beschichtung |
| verwendet PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digitales Mikrospiegelgerät (DMD)-basiertes UV-Projektionsgerät |
| Trypanblau 0,4 | ThermoFisher | T10282 | Wird zur Zellzählung verwendet |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Wird verwendet, um adhärente Zellen abzulösen |
Referenzen
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63
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Nachdrucke und Genehmigungen
