Name: Co-Kultur von Glioblastom-Stammzellen auf gemusterten Neuronen zur Untersuchung von Migration und zellulären Interaktionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Erfahren Sie die Co-Kultur von Glioblastom-Stammzellen auf gemusterten Neuronen zur Untersuchung von Migration und zellulären Interaktionen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung invasiver Kapazitäten.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole wird unterstützt von agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon ist Stipendiat des Universitätsklinikums Toulouse (CHU Toulouse).

Die schriftliche Einwilligung aller Patienten (vom Haukeland Hospital, Bergen, Norwegen, gemäß den Vorschriften der örtlichen Ethikkommission) wurde eingeholt. Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommissionen für Human- und Tierforschung der Universität Bordeaux. Trächtige Ratten wurden in der Tiereinrichtung der Universität Bordeaux untergebracht und behandelt. Die Euthanasie einer E18-getrhypten trächtigen Ratte wurde unter Verwendung von CO2durchgeführt. Alle Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission genehmigt. Alle kommerziellen Produkte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung der gemusterten Dias
<ol><li>Substratvorbereitung für die Mikrostrukturierung<ol>
<li>Behandeln Sie 18 mm kreisförmige Glasabdeckungen durch Luft-/Plasmaaktivierung für 5 min. Legen Sie die Abdeckel in eine geschlossene Kammer mit 100 μL (3-Aminopropyl)triethoxysilan in einen Ausstecher für 1 h.</li>
		<li>Mit 100 mg/ml Poly(ethylenglykol)-Succinimidylvalerat (Molekulargewicht 5.000 (Peg-SVA)) in 10 mM Carbonatpuffer, pH-> 8, für 1 h inkubieren. Ausgiebig mit Reinstwasser abspülen und unter einer chemischen Haube trocknen. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die Probe bei 4 °C im Dunkeln zur weiteren Verwendung gelagert werden.</li>
		<li>Fügen Sie den Photoinitiator, 4-Benzoylbenzyl-trimethylammoniumchlorid (PLPP), bei 14,7 mg / ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu. HINWEIS: Eine konzentrierte Form von PLPP, ein PLPP-Gel, kann ebenfalls verwendet werden. Dies führt zu einer kürzeren UV-Beleuchtungszeit (UV), die zum Abbau der PEG-Bürste erforderlich ist (100 mJ/mm2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Photoinitiator-Gelabscheidung<ol>
<li>Bereiten Sie eine Mischung aus 3 μL PLPP-Gel und 50 μL absolutem Ethanol vor, um sich in der Mitte des Objektträgers abzulagern. Legen Sie die Probe unter eine chemische Haube, bis das absolute Ethanol vollständig verdampft ist. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die Probe bei 4 °C im Dunkeln zur weiteren Verwendung gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Glasobjektträger-Mikrostrukturierung<ol>
<li>Montieren Sie den Abdeckr in einer Ludin-Kammer und legen Sie ihn auf die motorisierte Bühne eines Mikroskops, das mit einem Autofokussystem ausgestattet ist.</li>
		<li>Laden Sie Bilder, die den vorgesehenen Mikromustern entsprechen, in die Software. Wenden Sie diese Parameter an: Replikation 4 x 4 mal, Abstand von 200 μm, UV-Dosis von 1.000 mJ/mm2. Spülen Sie nach der automatischen UV-Beleuchtungssequenz das PLPP mit mehreren PBS-Waschungen weg. HINWEIS: Wenn PLPP-Gel verwendet wurde, entfernen Sie es durch ausgedehnte Wäschen mit entionisiertem Wasser, trocknen Sie es in einem Strom von N2und lagern Sie es bei 4 ° C.</li>
		<li>Mit Laminin (50 μg/ml in PBS) 30 min inkubieren. Ausgiebig mit PBS waschen. HINWEIS: Eine fluoreszierende Lösung aus gereinigtem grün fluoreszierendem Protein (GFP, 10 μg/ml in PBS) kann mit Laminin gemischt werden, um die Mikromuster durch Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung von Neuronen und GBM-Zellen für die Co-Kultur
<ol><li>Kultur embryonaler Ratten-Hippocampus-Neuronen<ol>
<li>Sezieren Sie den Hippocampus embryonaler (E18) Ratten und übertragen Sie das Gewebe in eine Ausgewogene Salzlösung (HBSS) von Hank / 1 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) / Penicillin-Streptomycin-Lösung in einem 15-ml-Röhrchen. Entfernen Sie überschüssige Lösung, ohne den Hippocampus zu trocknen.</li>
		<li>5 ml Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit Penicillin (10.000 Einheiten/ml)/Streptomycin (10.000 μg/ml) und 1 mM HEPES zunehmen und 15 min bei 37 °C inkubieren. Waschen Sie 2x mit der HBSS / HEPES / Penicillin-Streptomycin-Lösung und lassen Sie das Gewebe 2-3 min in dieser Lösung bleiben.</li>
		<li>Dissoziieren Sie das Gewebe mit zwei flammpolierten Pasteur-Pipetten, indem Sie mit jedem Gewebe 10x auf und ab pipettieren und dabei darauf achten, das Schäumen zu minimieren. Zählen Sie die Zellen und bewerten Sie die Lebensfähigkeit der Zellsuspension. Platten Sie die Neuronen auf mikrostrukturierten Coverlips, wie unten angegeben. HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeitsrate beträgt 85-90% nach der Extraktion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zellkultur für Neuronen auf mikrostrukturierten Coverlips<ol>
<li>Rehydrieren Sie mikrostrukturierte Glasobjektträger mit PBS und inkubieren Sie das gesamte neuronale Zellkulturmedium.</li>
		<li>Säen Sie die hippokampalen Neuronen, die von E18 Sprague-Dawley-Ratten gewonnen werden, direkt über dem mikrostrukturierten Glasdeckel mit einer Dichte von 50.000 Zellen procm2 in neurobasalem Medium (NBM), angereichert mit 3% Pferdeserum. Legen Sie die mikrostrukturierten Neuronen für 48 h in den Inkubator (37 °C, 5% CO2). HINWEIS: Nach ~ 6 h können primäre Hippocampus-Neuronen gesehen werden, die an den Laminin-Mikromustern haften.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Co-Kultur menschlicher GBM-Stammzellen auf Neuronen HINWEIS: Für diese Studie wurden Membran-GFP-positive und kerntomaten-patientenbasierte GBM-Zellen gemäß den zuvor veröffentlichten Protokollen10gezüchtet.<ol>
<li>Wenn die kugelförmigen Zellen in Suspension wachsen, zentrifugieren Sie die Suspension für 5 min bei 200 × g. Waschen Sie die Sphäroide mit 5 ml PBS und inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 ml des Zelldissoziationsreagenzes (siehe Materialtabelle)für 5 min bei 37 °C.</li>
		<li>Fügen Sie 4,5 ml vollständiges NBM hinzu (ergänzt mit B27-Ergänzung, Heparin, Fibroblastenwachstumsfaktor 2, Penicillin und Streptomycin, wie zuvor beschrieben8), und zählen Sie die Zellen mit einer automatischen Zähltechnik.</li>
		<li>Säen Sie 1.000 GBM-Zellen über die mikrostrukturierte neuronale Kultur in NBM, angereichert mit 3% Pferdeserum. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, 5% CO2und 95% Luftfeuchtigkeit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Bildgebung lebender Zellen
<ol><li>Unmittelbar nach der GBM-Zellaussaat legen Sie die Probe auf die Bühne eines invertierten Mikroskops, das mit einer Thermostatkammer ausgestattet ist. Führen Sie Live-Cell-Bildgebung auf dem Mikroskop durch, das mit einer motorisierten Bühne zur Aufzeichnung mehrerer Positionen ausgestattet ist, indem Sie eine mehrdimensionale Erfassungs-Toolbox in der Software verwenden. Erfassen Sie Hellfeld- und Epifluoreszenz-GFP/Tomatenbilder alle 5 Minuten über 12 h mit einem 20-fachen Objektiv in einer temperatur- (37 °C) und gasgesteuerten (5% CO2)Umgebung.</li>
</ol>4. Bildanalyse
HINWEIS: Mit Fidschi wurden zweidimensionale (2D) Bildstapel halbautomatisch vorverarbeitet oder mit einem hausgemachten und benutzerfreundlichen Tool (verfügbar unter dieser Adresse: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), das in IJ1-Makrosprache geschrieben ist (Abbildung 2A). Der automatisierte Workflow und die verfahren sind in Abbildung 2Bzusammengefasst.
<ol><li>Neuronale Netzwerkanalyse (Abbildung 2Bi)<ol>
<li>Wählen Sie ein Bild des Stapels aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Netzwerkwerkzeug, um das entsprechende Dialogfeld Optionen zu öffnen, und passen Sie die Einstellungen an (z. B. Schwellenwert = Dreieck, Li, Huang..., Gaußsche Unschärfeund Medianfilter = 1, 2, 3...), um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie dann auf OK.</li>
		<li>Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Netzwerk-Tool, um das folgende Verfahren automatisch zu aktivieren.<ol>
<li>Duplizieren Sie das ausgewählte Bild und teilen Sie es in drei Farbkanäle auf (Rot-Grau-Grün).</li>
			<li>Wählen Sie den Graukanal (Hellfeld) aus und führen Sie eine Kontrastdehnungsverbesserung (CSE) durch, um die Trennung zwischen verschiedenen Bereichen zu verbessern. Verwenden Sie den Sobel-Kantendetektor (SED), um den 2D-Signalverarbeitungsfaltungsvorgang auszuführen, der bereits unter dem Befehl "Kante suchen" gruppiert ist.</li>
			<li>Wenden Sie für die Doppelfilterung (F) einen Gaußschen Unschärfe- und Medianfilter an, um das Rauschen zu reduzieren und das Objektsignal zu glätten. Konvertieren Sie in Maske (CM), indem Sie angepasste Schwellenwertalgorithmen ausführen, um ein binäres Bild (BIN-grey) mit schwarzen Pixeln (Zellbereich) und weißen Pixeln (Hintergrund) zu erhalten. Skelettieren Sie (Sk) den Zellbereich in ein einfaches Netzwerk (NET) und filtern Sie Partikel (EP) in einem NET-Bild, indem Sie kleine, nicht vernetzte Partikel entfernen.</li>
			<li>Führen Sie für rote und grüne Kanäle (Kern und Membran) eine Doppelfilterungdurch, konvertieren Sie mit der angepassten Schwellenwertmethode in Maske und lassen Sie BIN-grün die Zellmorphologie mit dem Befehl Partikel analysieren bestimmen.</li>
			<li>Führen Sie alle Kanäle mit ihrem Interessenbereich (ROI) mit dem OR-Operator (Combine) zusammen und stellen Sie ihre Anfangsfarbe in ein einfaches RGB-Bild um.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Einzelzellmotilitätsanalyse (Abbildung 2Bii)<ol>
<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Einzelzellen-Tracking-Werkzeug, um das entsprechende Dialogfeld Optionen zu öffnen, und passen Sie die Einstellungen an (z. B. Trailtyp = Kern oder Membran, Schwellenwert = Dreieck, Li, Huang..., Z-Projektion = Maximale Intensität, Summenscheiben..., Gaußsche Weichzeichner und Medianfilter = 1, 2, 3...), um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie dann auf OK.</li>
		<li>Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Single Cell Tracking-Tool, um das folgende Verfahren automatisch zu aktivieren.<ol>
<li>Entfernen Sie den grauen Kanal. Wenden Sie eine Z-Projektion auf den Stapel an, die ein Bild generiert, das einem Bildstapel entsprechend der Zeit entspricht (T-Stapel). Doppelklicken Sie auf die von Zellen hinterlassenen Spuren und konvertieren Sie sie in Mask. Entfernen Sie kleine Partikel in das BIN-Rot/Grün-Bild.</li>
			<li>Wählen Sie mithilfe des ROI jede Kontur der Zellablaufverfolgung aus, und aktivieren Sie im Dialogfeld Optionen das Kontrollkästchen Kantenerkennung überspringen, um diesen Vorverarbeitungsschritt für nachfolgende Schritte zu überspringen.</li>
			<li>
Isolieren Sie den roten Kanal(Trailtyp = Nucleus) auf dem ursprünglichen Stack. Wählen Sie einen ROI aus und entfernen Sie den äußeren Bereich. Filtern Sie alle Bilder doppelt und konvertieren Sie sie in Maske (BIN-rot). Bestimmen Sie die X/Y-Position des Mittelpunkts jedes binarisierten Kerns.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berechnen Sie mit einem bereits veröffentlichten Makro für die Tabellenkalkulationssoftware13die mittlere quadratische Verschiebung, das Richtungsverhältnis und die Durchschnittsgeschwindigkeit für diese Zelle.</li>
	</ol></li>
	<li>Tracking-Analyse mehrerer Zellen (Abbildung 2Biii)<ol>
<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Tracking-Tool, um das entsprechende Dialogfeld Optionen zu öffnen und passen Sie die Einstellungen (z. B. Schwellenwert = Dreieck, Li, Huang..., Gaußsche Weichzeichner und Medianfilter = 1, 2, 3...) an, um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie dann auf OK.</li>
		<li>Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Tracking-Tool, um das folgende Verfahren automatisch zu aktivieren.<ol>
<li>Entfernen Sie den grauen Kanal.</li>
			<li>
Teilen Sie die roten und grünen Kanäle auf, filternSie doppelt und konvertieren Sie sie in Maske.</li>
			<li>Zusammenführen der Kanäle mit Image Calculator... Befehl mit dem AND-Operator, wobei nur das Kernsignal in den Membranen übrig bleibt. HINWEIS: Mehrere Plugins in Fidschi können verwendet werden, um die X/Y-Position mehrerer Zellen in diesem binären vorverarbeiteten Bild gleichzeitig zu bestimmen (siehe Materialtabelle).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berechnen Sie mit einem zuvor beschriebenen Makro13das Trajektoriendiagramm, die mittlere quadratische Verschiebung, das Richtungsverhältnis und die durchschnittliche Geschwindigkeit für diese Zellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Sphäroidalmigration auf der Neuralmatte (Abbildung 2Biv)<ol>
<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Migrationswerkzeug, um das entsprechende Dialogfeld Optionen zu öffnen und passen Sie die Einstellungen an (z. B. Schwellenwert = Dreieck, Li, Huang..., Gaußsche Unschärfe und Medianfilter = 1, 2, 3...), um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie dann auf OK.</li>
		<li>Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Migrationstool, um das folgende Verfahren automatisch zu aktivieren.<ol>
<li>Entfernen Sie den roten Kanal.</li>
			<li>
Teilen Sie die grünen und grauen Kanäle auf.</li>
			<li>Zeichnen Sie für den grauen Kanal manuell die Kontur der neuronalen Matte und messen Sie ihre Fläche.</li>
			<li>Für den grünen Kanal filtern Sie den Stapel doppelt und konvertieren Sie ihn in Maske. Entfernen Sie den Bereich außerhalb des Musters (BIN), und bestimmen Sie den binarisierten Zellbereich für jedes Bild. HINWEIS: Die oben beschriebenen Parameter werden kalibriert, indem Sie ihre Werte durch Linksklick auf das symbol von Interesse ändern. Diese Verarbeitung kann manuell erfolgen. Für eine große Anzahl von Bildern (ca. hundert pro Aufnahme), Kanäle (in der Regel 3 Kanäle) und Verarbeitungsschritte wäre jedoch ein automatisiertes oder halbautomatisches Tool vorzuziehen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Glioblastome dringen umfassend in das Parenchym ein, indem sie verschiedene Modi verwenden: Ko-Option der umgebenden Blutgefäße, interstitielle Invasion oder Invasion auf WMTs18. Dieser letztere Modus ist in der Literatur nicht gut charakterisiert, da es schwierig ist, geeignete In-vitro- oder In-vivo-Modelle im Zusammenhang mit der WMT-Invasion zu finden. Hier wurde ein vereinfachtes Modell vorgeschlagen, bei dem kultivierte Nagetierneuronen auf lamininbeschichteten Oberflächen ...

Primäre maligne Gliome, einschließlich GBMs, sind verheerende Tumore mit einer mittleren Überlebensrate von 12 bis 15 Monaten, die für GBM-Patienten berichtet werden. Die aktuelle Therapie beruht auf einer großen Tumormassenresektion und Chemotherapie in Verbindung mit einer Strahlentherapie, die die Überlebensrate nur um wenige Monate verlängert. Therapeutische Misserfolge sind eng mit einer schlechten Medikamentenabgabe über die Blut-Hirn-Schranke (BBB) und mit invasivem Wachstum in perivaskulären Räumen, Hirnhäuten und entlang der WMTs1verbunden. Perivaskuläre Invasion, auch vaskuläre Co-Option genannt, ist ein gut untersuchter Prozess, und die molekularen Mechanismen beginnen aufgeklärt zu werden; Der Prozess der GBM-Zellinvasion entlang von WMTs ist jedoch nicht gut verstanden. Tumorzellen wandern entlang der Scherer-Sekundärstrukturen in das gesunde Gehirn2. Tatsächlich beschrieb Hans-Joachim Scherer vor fast einem Jahrhundert die invasiven Wege des GBM, die heute als perineuronale Satellitose, perivaskuläre Satellitose, subpiale Ausbreitung und Invasion entlang des WMT bezeichnet werden (Abbildung 1A).
Einige Chemokine und ihre Rezeptoren, wie stromalzellabgeleiteter Faktor-1α (SDF1α) und C-X-C-Motiv-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4), aber nicht vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), scheinen an der WMT-Invasion beteiligt zu sein3. In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass eine transzelluläre NOTCH1-SOX2-Achse ein wichtiger Weg bei der WMT-Invasion von GBM-Zellenist 4. Die Autoren beschrieben, wie GBM-Stammzellen in das Gehirnparenchym an teilweise nicht myelinisierten Neuronen eindringen, was auf die Zerstörung von Myelinscheiden durch GBM-Zellen hindeutet. Ein Meilenstein wurde 2019 erreicht, als drei Artikel in der Zeitschrift Nature veröffentlicht wurden, die die Rolle der elektrischen Aktivität bei der Gliomentwicklung unterstreichen5,6. Bahnbrechende Arbeiten von Monje und Mitarbeitern beleuchten die zentrale Rolle der elektrischen Aktivität bei der Sekretion von Neuroligin-3, das die Gliomentwicklung fördert.
Winkler und Mitarbeiter beschrieben Verbindungen zwischen GBM-Zellen (Mikroröhrchen), die in invasiven Schritten entscheidend sind, und in letzter Zeit Interaktionen zwischen GBM-Zellen und Neuronen über neu beschriebene Neurogliom-Synapsen. Diese Strukturen begünstigen die glutamaterge Stimulation von α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) -Rezeptoren an der GBM-Zellmembran, die die Tumorentwicklung und -invasion fördern. Die Invasion von Tumorzellen ist ein zentraler Prozess bei der Verbreitung von Metastasen oder entfernten sekundären Herden, wie sie bei GBM-Patienten beobachtet wird. Es wurde festgestellt, dass mehrere Faktoren bei der GBM-Invasion wichtig sind, wie Thrombospondin-1, ein transformierender Wachstumsfaktor beta (TGFβ-reguliertes matrizelluläres Protein oder der Chemokinrezeptor CXCR3)7,8.
Hier wurde ein vereinfachtes biomimetisches Modell zur Untersuchung der GBM-Invasion beschrieben, bei dem Neuronen auf Spuren von Laminin gemustert und GBM-Zellen darauf gesät werden, als Einzelzellen oder als Sphäroide (Abbildung 1B). Die beiden experimentellen Einstellungen zielen darauf ab, die Invasion auf Neuronen zu rekapitulieren, die in GBM9,10,11beobachtet wird. Solche Modelle wurden in der Vergangenheit als ausgerichtete Nanofaser-Biomaterialien (Core-Shell-Elektrospinning) entwickelt, die es ermöglichen, die Zellmigration durch Modulation mechanischer oder chemischer Eigenschaften zu untersuchen12. Das in diesem Artikel beschriebene Co-Kulturmodell ermöglicht ein besseres Verständnis dafür, wie GBM-Zellen auf Neuronen entweichen, indem neue molekulare Wege definiert werden, die an diesem Prozess beteiligt sind.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl)-Triethoxysilan</td><td>Sigma</td><td>440140-100ML</td><td>Die Aminogruppe ist nützlich für die Biokonjugation von mPEG-SVA</td></tr><tr><td>96-Well-Rundbodenplatte</td><td>Sarstedt</td><td>2582624</td><td>Wird zur Herstellung von Sphäroiden verwendet</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>Gelagert bei -20 &Grad; C (langfristig) oder 4 &deg; C (kurzfristig), Kugeldissoziationsenzym</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>Gelagert bei -20 &de; C, vor Gebrauch auftauen</td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Gelagert bei -20 &deg; C, vor Gebrauch auftauen</td></tr><tr><td>Gräfin ZellzählkammerObjektträger</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Zur Zellzählung</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Marienfeld</td><td>111580</td><td>Zellkultursubstrat</td></tr><tr><td>Exsikatorpatronen</td><td>Sigma</td><td>Z363456-6EA</td><td>Zur Reduzierung der Feuchtigkeit während der Behandlung von (3-Aminopropyl)-Triethoxysilan</td></tr><tr><td>DPBS 10x</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>Gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Fidschi-Software, MTrack2-Makro</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Wird zur Analyse von Bildern</td></tr><tr><td>verwendet Flachmann 75 cm & sup2;</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td>Gelagert bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Laminin</td><td></td><td>114956-81-9</td><td>Fördert die neuronale Adhäsion</td></tr><tr><td>Leonardo-Software</td><td></td><td></td><td>Laden von geplanten Mikromustern</td></tr><tr><td>MetaMorph Software&nbsp;</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>NA</td><td>Automatisierungssoftware für die Mikroskopie</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>Verdünnt in NBM für eine Endkonzentration von 2 %</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Lagerung bei 4 & Grad; C</td></tr><tr><td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td><td></td><td></td><td>inverses Mikroskop mit motorisiertem Tisch</td></tr><tr><td>Penicillin - Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Gelagert bei 4 &°; C</td></tr><tr><td>PLPP</td><td>Alveole</td><td>PLPPclassic_1ml</td><td>Photoinitiator zum Abbau der PEG-Bürste</td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol)-Succinimidylvalerat (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio</td><td>VA-PEG-VA-5000-5g</td><td>Wird als Antifouling-Beschichtung</td></tr><tr><td>verwendet PRIMO</td><td>Alveole</td><td>PRIMO1</td><td>Digitales Mikrospiegelgerät (DMD)-basiertes UV-Projektionsgerät</td></tr><tr><td>Trypanblau 0,4</td>%<td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>Wird zur Zellzählung verwendet</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td>Wird verwendet, um adhärente Zellen abzulösen</td></tr></tbody></table>

co-kultur von glioblastom-stammzellen auf gemusterten neuronen zur untersuchung von migration und zellulären interaktionen

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Glioblastome (GBMs), maligne Gliome des Grades IV, sind aufgrund ihrer aggressiven Eigenschaften eine der tödlichsten Krebsarten beim Menschen. Trotz signifikanter Fortschritte in der Genetik dieser Tumoren ist nicht gut bekannt, wie GBM-Zellen in das gesunde Gehirnparenchym eindringen. Insbesondere wurde gezeigt, dass GBM-Zellen über verschiedene Wege in den peritumoralen Raum eindringen; Das Hauptinteresse dieses Papiers ist der Weg entlang von White Matter Tracts (WMTs). Die Wechselwirkungen von Tumorzellen mit den peritumoralen Nervenzellkomponenten sind nicht gut charakterisiert. Hierin wurde eine Methode beschrieben, die den Einfluss von Neuronen auf die GBM-Zellinvasion bewertet. Dieser Artikel stellt einen fortschrittlichen Co-Kultur-In-vitro-Assay vor, der die WMT-Invasion nachahmt, indem er die Migration von GBM-stammähnlichen Zellen auf Neuronen analysiert. Das Verhalten von GBM-Zellen in Gegenwart von Neuronen wird durch ein automatisiertes Tracking-Verfahren mit Open-Source- und Free-Access-Software überwacht. Diese Methode ist für viele Anwendungen nützlich, insbesondere für funktionelle und mechanistische Studien sowie für die Analyse der Auswirkungen pharmakologischer Wirkstoffe, die die GBM-Zellmigration auf Neuronen blockieren können.

Gemusterte Neuronen, die mit fluoreszierenden GBM-Zellen kokuliert wurden, wurden wie im Protokollabschnitt beschrieben vorbereitet und Tracking-Experimente durchgeführt. GBM-Zellen veränderten schnell ihre Form, während sie auf den Neuronen wanderten (Abbildung 1B: Panel 6 und Video 1). Zellen wanderten in einer zufälligen Bewegung entlang der neuronalen Erweiterungen (Video 1). Fluoreszierende GBM-Zellen und nicht fluoreszierende Neuronen ...

Hier präsentieren wir einen einfach zu bedienenden Co-Kultur-Assay zur Analyse der Glioblastom-Migration (GBM) an gemusterten Neuronen. Wir entwickelten ein Makro in der FiJi-Software zur einfachen Quantifizierung der GBM-Zellmigration auf Neuronen und beobachteten, dass Neuronen die invasive Kapazität von GBM-Zellen modifizieren.

Co-Kultur von Glioblastom-Stammzellen auf gemusterten Neuronen zur Untersuchung von Migration und zellulären Interaktionen

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Glioblastome sind verheerende Hirntumoren mit einem hohen invasiven Profil. Dieses Co-Kultursystem ahmt die Migration von Glioblastomzellen auf Neuronen nach, um einen der bei Patienten beobachteten invasiven Wege zu rekapitulieren. Die Geometrie und Zusammensetzung unseres Co-Culture-Modells wird präzise gesteuert.Es ermöglicht eine bessere Reproduzierbarkeit und auch eine einfache Quantifizierung komplexer biologischer Prozesse. Diese Methode kann an die klinische Diagnose angepasst werden, indem frisch dissoziierte Glioblastomzellen und Neuronen co-kultiviert werden. Es definiert einen klinischen Index, der als klinisches Ergebnis sehr wichtig ist.Unsere Methode kann auch verwendet werden, um andere wandernde Zellen wie Fibroblasten oder Immunzellen zu quantifizieren. Das Verfahren wird von Joris Guyon, einem Doktoranden aus meinem Team, demonstriert. Um ein Substrat für die Mikrostrukturierung herzustellen, behandeln Sie 18 Millimeter kreisförmige Glasabdeckungen fünf Minuten lang durch Luft- oder Plasmaaktivierung, bevor Sie die Abdeckschichten eine Stunde lang in einen Aussicker mit 100 Mikrolitern Triethoxysilan legen und dann eine Lösung von PEG-SVA mit 100 Milligramm pro M

co-culture-glioblastoma-stem-like-cells-on-patterned-neurons-to-study

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Eine Abschottung mikrofluidischen Vorrichtung zur Untersuchung von Krebsstammzellen Migration beschrieben. Diese neuartige Plattform schafft eine tragfähige zellulären Mikroumgebung und ermöglicht mikroskopische Visualisierung der lebenden Zelle Fortbewegung. Höchst beweglich Krebszellen isoliert sind, um molekularen Mechanismen von aggressiven Infiltration, was möglicherweise zur wirksameren zukünftige Therapien.

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Mit Abschottung Mikrofluidiksysteme und Live Cell Imaging

Dieses Video beschreibt einen Co-Kultur-Assay von Glioblastomzellen auf mikrostrukturierten Neuronen, die die Invasion der myelinisierten neuronalen Bahnen durch die Glioblastom-Stammzellen nachahmen, während sie auf Neuronen in den peritumoralen Räumen wandern. Dieser Assay kann helfen, die Auswirkungen von pharmakologischen Arzneimitteln zu analysieren, die die Wanderung von Glioblastomzellen auf Neuronen in einem Gliom hemmen.

Co-Kultivierung von Glioblastomzellen auf gemusterten Neuronen: Eine Technik zur Überwachung der Migration von Glioblastomzellen auf Hippocampus-Neuronen von Ratten in vitro

Die organotypischen Hirnschnitt Co-Kultur mit Karzinomzellen ermöglicht die Visualisierung morphologische Veränderungen durch Fluoreszenz sowie Hellfeld-(Video)-Mikroskopie während des Prozesses der Karzinomzellinvasion von Hirngewebe. Dieses Modellsystem ermöglicht auch für die Zellaustausch und die Wiederauffüllung Ansätze und bietet eine Vielzahl von Manipulationen und Analysen.

Co-Kultur-System mit einer Scheibe Organotypische Gehirn-und 3D-Sphäroid von Karzinomzellen

Protokoll zur Verbreitung von dissoziierten hochgradigen chirurgischen Gliomproben im serumfreien Neurosphärenmedium zur Auswahl für Zellen mit Krebsstammzellphänotyp. Für Proben, die nicht als Neurosphären wachsen, wird ein alternatives Protokoll vorgeschlagen. Eine Paraffin-Einbettungstechnik zur Aufrechterhaltung der 3D-Neurosphärenarchitektur für die Immunzytochemie wird beschrieben.

Optimierung der hochwertigen Gliom-Zellkultur von chirurgischen Proben für den Einsatz in klinisch relevanten Tiermodellen und 3D-Immunchemie

Aktuelle Ex-vivo- Modelle von Glioblastom (GBM) sind nicht für eine physiologisch relevante Untersuchung der menschlichen Tumorinvasion optimiert. Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung und Pflege von organotypischen Scheibenkulturen aus frischem menschlichem GBM-Gewebe vor. Es wird eine Beschreibung der Zeitraffer-Mikroskopie und der quantitativen Zellmigrationsanalyse-Techniken gegeben.

Ein menschliches Glioblastom Organotypisches Scheibenkulturmodell zur Untersuchung der Tumorzellmigration und patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Arzneimitteln

Um das bösartige Verhalten von Krebs zu verstehen, müssen genaue Modelle erstellt werden, wie Tumorzellen mit Komponenten der Tumormikroumgebung, wie z.B. Makrophagen, interagieren. Hier beschreiben wir zwei Methoden zur Untersuchung der Interaktion von Glioblastomzellen mit tumorassoziierten Makrophagen und Mikroglia, bei denen die Wirkung auf die Glioblastominvasion bewertet wird.

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Hier beschreiben wir Leben-Zelle bildgebende Verfahren um die Migration und Invasion von Glioblastom Gehirn Tumor-Stammzellen im Laufe der Zeit und unter mehreren Behandlungsbedingungen quantitativ zu messen.

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Hier präsentieren wir ein ex-vivo gemischtes monolayer Kultursystem zur Erforschung der Migration menschlicher Gliomzellen (hGC) in Echtzeit. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, Wechselwirkungen zwischen hGCs und myelinierten und nicht myelinierten Axonen innerhalb einer abgeteilten Kammer zu beobachten.

Echtzeit-Überwachung der Migration menschlicher Gliom-Zell auf Dorsalwurzel Ganglion Axon-Oligodendrozyten-Ko-Kulturen

Hier beschreiben wir einen einfach zu bedienenden Invasionstest für Glioblastom. Dieser Test eignet sich für glioblastom-Stammzellen. Ein Fidschi-Makro zur einfachen Quantifizierung von Invasion, Migration und Proliferation wird ebenfalls beschrieben.

Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Wir präsentieren ein 3D-Glioblastom-Migrationsmodell unter Verwendung von von Patienten abgeleiteten magnetischen Gliomsphären, die aus neu diagnostizierten und wiederkehrenden Tumoren erzeugt wurden. Diese Plattform ermöglicht die Visualisierung patientenspezifischer Migrationsdynamiken und die Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit. Der Test kann nach der Migration multiplexiert werden, um die Proteinlokalisierung und Expressionsmuster zu bewerten.

Reproduzierbarer 3D-Glioblastom-Migrationstest mit magnetischer Nanopartikel-vermittelter sphäroider Lokalisierung unter hypoxischen Bedingungen

Erfahren Sie die Co-Kultur von Glioblastom-Stammzellen auf gemusterten Neuronen zur Untersuchung von Migration und zellulären Interaktionen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung invasiver Kapazitäten.

Co-Kultur von Glioblastom-Stammzellen auf gemusterten Neuronen zur Untersuchung von Migration und zellulären Interaktionen

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