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Methodenartikel

Aktivität von posterioren Lateral Line Afferent Neuronen beim Schwimmen im Zebrafisch

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DOI:

10.3791/62233

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10. Februar 2021

 , 
1Department of Biology, University of Florida, The Whitney Laboratory for Marine Bioscience

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung von Veränderungen der afferenten Neuronenaktivität während motorischer Befehle in einem Modell-Wirbeltier-Haarzellsystem.

Zusammenfassung

Sensorische Systeme sammeln Hinweise, die für die Steuerung des Verhaltens unerlässlich sind, aber Tiere müssen entschlüsseln, welche Informationen biologisch relevant sind. Die Fortbewegung erzeugt reafferente Hinweise, die Tiere von relevanten sensorischen Hinweisen der Umgebung entwirren müssen. Wenn beispielsweise ein Fisch schwimmt, wird der aus Körperandulationen erzeugte Fluss von den mechanorezeptiven Neuromasten erkannt, die aus Haarzellen bestehen, aus denen das Seitenliniensystem besteht. Die Haarzellen übertragen dann flüssige Bewegungsinformationen vom Sensor über die sensorisch afferenten Neuronen an das Gehirn. Gleichzeitig wird die Folgeentladung des Motorbefehls an die Haarzellen weitergeleitet, um eine Reizüberflutung zu verhindern. Die Berücksichtigung der hemmenden Wirkung prädiktiver motorischer Signale während der Fortbewegung ist daher bei der Bewertung der Empfindlichkeit des Seitenliniensystems von entscheidender Bedeutung. Wir haben einen elektrophysiologischen In-vivo-Ansatz entwickelt, um gleichzeitig die aktivität des hinteren lateralen Line afferenten Neurons und der ventralen motorischen Wurzel bei Zebrafischlarven (4-7 Tage nach der Befruchtung) zu überwachen, die mehrere Stunden dauern können. Extrazelluläre Aufnahmen von afferenten Neuronen werden mit der Loose Patch Clamp-Technik erreicht, die Die Aktivität einzelner oder mehrerer Neuronen erkennen kann. Ventrale Wurzelaufnahmen werden durch die Haut mit Glaselektroden durchgeführt, um die Aktivität von Motoneuronen zu erkennen. Unser experimentelles Protokoll bietet das Potenzial, endogene oder evozierte Veränderungen des sensorischen Inputs über motorisches Verhalten in einem intakten, sich verhaltenden Wirbeltier zu überwachen.

Einleitung

Affente Neuronen mechanosensorischer Systeme übertragen während des Hörens und Gleichgewichts Informationen von Haarzellen an das Gehirn. Die Elektrophysiologie kann die Empfindlichkeit afferenter Neuronen durch direkte Aufnahmen aufdecken. Während das Patchen ganzer Zellen aus Haarzellen eine Herausforderung sein kann, ist die Aufzeichnung von nachgeschalteten afferenten Neuronen einfacher und ermöglicht die Beurteilung von Aktionspotentialen als Reaktion auf kontrollierte Stimulationen1,2,3. Stimulierende Haarzellen führen zu ihrer Ablenkung, die mechanosensorische Strukturen verändert und so eine Zunahme der Aktionspotentiale (Spikes) in verschiedenen Neuronenauslöst 4,5,6. In Abwesenheit äußerer Reize steigen afferent neuronen auch spontan aufgrund von Glutamatlecks aus den Haarzellen auf die afferenten postsynaptischen Terminals7,8und tragen nachweislich zur Aufrechterhaltung der Empfindlichkeit bei9,10. Die Patch-Clamp-Aufzeichnung der afferenten Aktivität ermöglicht die Beobachtung der Empfindlichkeit und Signaldynamik von Haarzellen, die mit Techniken mit geringerer zeitlicher Auflösung nicht möglich sind, wie z.B. in der Mikrophonik11,12 oder funktionellen Calcium-Bildgebung13,14,15. Das folgende Protokoll ermöglicht die Aufzeichnung afferenter Aktivität gleichzeitig mit motorischen Befehlen, um sofortige Veränderungen der Haarzellempfindlichkeit aufzudecken.

Zebrafische (Danio rerio) verwenden Haarzellen, die in Neuromasten enthalten sind, die das Seitenliniensystem bilden, um Wasserbewegungen relativ zu ihrem Körper zu erkennen, die in neuronale Signale übersetzt werden, die für die Navigation unerlässlich sind16,17,18, Raubtiervermeidung, Beutefang19,20und Schulung21. Der Wasserfluss kann auch durch die Bewegungen des Schwimmens22 , 23,24, Atmung22 , 25,26und Fütterung27selbst erzeugt werden. Diese Verhaltensweisen umfassen sich wiederholende Bewegungen, die Haarzellen ermüden und die Wahrnehmung beeinträchtigen können. Daher ist es entscheidend, dass das Seitenliniensystem zwischen externen (exafferenten) und selbst erzeugten (reafferenten) Strömungsreizen unterscheidet. Eine Folgeentladung schwächt selbst erzeugte Strömungssignale während der Fortbewegung bei Zebrafischen ab. Dieses hemmende prädiktive motorische Signal wird über absteigende Neuronen an die sensorischen Rezeptoren weitergeleitet, um den Eingang zu modifizieren oder die Verarbeitung des reafferenten Feedbacks zu unterbrechen28,29. Bahnbrechende Arbeiten, die zu unserem frühen Verständnis dieses Feedforward-Systems beitrugen, stützten sich auf In-vitro-Präparate, bei denen die Konnektivität und die endogene Aktivität des neuronalen Schaltkreises nicht aufrechterhalten wurden28,30,31,32,33,34,35. Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Erhaltung eines intakten neuronalen Schaltkreises, in dem die endogene Rückkopplungsdynamik aufrechterhalten wird, wodurch ein besseres Verständnis der Folgeentladung in vivo ermöglicht wird.

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt, wie die Aktivität von afferenten Neuronen und Motoneuronen in Larvenzebrafischen gleichzeitig überwacht werden kann. Die Charakterisierung der afferenten Signaldynamik vor, während und nach motorischen Befehlen liefert Einblicke in die endogene Rückkopplung des zentralen Nervensystems in Echtzeit, die die Empfindlichkeit der Haarzellen während der Fortbewegung moduliert. Dieses Protokoll beschreibt, welche Materialien vor Experimenten vorbereitet werden müssen und beschreibt dann, wie Zebrafischlarven gelähmt und vorbereitet werden können. Das Protokoll wird beschreiben, wie eine stabile lose Patch-Aufzeichnung von afferenten Neuronen und extrazellulären ventralen Wurzelaufnahmen (VR) von Motoneuronen erstellt werden kann. Repräsentative Daten, die mit diesem Protokoll gewonnen werden können, werden von einer beispielhaften Person präsentiert und die Analyse wurde an mehreren Replikaten des experimentellen Protokolls durchgeführt. Die Vorverarbeitung der Daten erfolgt mithilfe von benutzerdefinierten Skripten in MATLAB. Insgesamt ist dieses experimentelle In-vivo-Paradigma bereit, ein besseres Verständnis des sensorischen Feedbacks während der Fortbewegung in einem Modell-Wirbeltier-Haarzellsystem zu liefern.

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Protokoll

Alle Tierpflege und -experimente wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Florida genehmigt wurden.

1. Vorbereitung von Materialien für elektrophysiologische Aufnahmen

  1. Machen Sie eine Aufnahmeschale mit Silikonelastomerboden.
    1. Geben Sie eine dünne Schicht selbstmischendem Silikonelastomerkomponenten (z. B. Sylgard) in eine Gewebekulturschale mit Deckglasboden, bis sie mit dem Rand des flachen Brunnens auffliegt. Etwa 0,5 ml sind ausreichend.
    2. Decken Sie das Gericht ab und härten Sie es mindestens 48 h bei Raumtemperatur aus.
  2. Machen Sie Dissektionsstifte.
    1. Stellen Sie eine negative Ladung (5 V) für ein 100-ml-Becherglas aus Ätzmittel (3M KOH) mit einem DC-Netzteil bereit und befestigen Sie einen Wolframdraht (0,002 Zoll; 50,8 μm Durchmesser) am positiv geladenen Ausgang.
      ACHTUNG: Negative und positive Drähte sollten während dieses Vorgangs nicht miteinander in Kontakt treten, da Sie Gefahr laufen, Funken zu erzeugen, die eine potenzielle Brandgefahr darstellen könnten.
    2. Ätzen Sie Wolframdraht, indem Sie schnell und wiederholt die Spitze des Drahtes in das Ätzbad tauchen, bis sich die Spitze zu einem scharfen Punkt verengt. Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop den Draht etwa 1 mm von der Spitze entfernt mit einer rasiermesserscharfen Klinge mit gerader Kante. Wiederholen Sie dies noch drei weitere Male und setzen Sie dann die Stifte mit einer feinen Pinzette in die ausgehärtete Aufnahmeschale ein.
  3. Bereiten Sie Aufnahmeelektroden vor.
    1. Ziehen Sie ein Kapillarrohr aus Borosilikatglas (Innendurchmesser: 0,86 mm, Außendurchmesser: 1,50 mm) mit einem horizontalen Mikropipettenzieher mit Kastenfilament in Elektroden mit einer Spitze mit einem Durchmesser von 30 μm und leichter Verjüngung(Abbildung 1 Ai),die verwendet werden, um affelinete Neuronen aus der hinteren Seitenlinie aufzunehmen.
    2. Ziehen Sie ein zusätzliches Kapillarrohr aus Borosilikatglas in ein Elektrodenpaar mit kleineren Spitzendurchmessern (1-5 μm). Halten Sie eine Elektrode in jeder Hand und führen Sie die Spitzen vorsichtig übereinander, um sie in einen Winkel von ~ 30 ° zu brechen. Polieren Sie die abgeschränkte Spitze mit einer Mikroschmiede, bis sie glatt ist. Der endgültige Spitzendurchmesser sollte zwischen 30-50 μm liegen und wird als ventrale Wurzel (VR) Aufzeichnungselektrode verwendet(Abbildung 1 Aii).
    3. Markieren Sie die Seite der VR-Elektrode mit der Vorderkante mit permanenter Tinte, um die Spitzenöffnung beim Einführen der Elektrode in den Pipettenhalter der Kopfbühne nach unten auszurichten (Schritt 3.2).
      HINWEIS: Die mechanische Modifikation der VR-Aufzeichnungselektrode ist ungenau und Schritt 1.3.2 kann mehrere Versuche erfordern, bis vor dem Polieren eine geeignete Spitzenmorphologie erreicht ist. Die VR-Aufzeichnungselektrode ist abgeschrägt, um sich der Körperkurve der Larven anzupassen. Einmal hergestellt, kann die VR-Aufzeichnungselektrode wiederholt verwendet werden, solange die Spitze zwischen den Experimenten klar und sauber bleibt.
  4. Generieren Sie das Protokoll in elektrophysiologischen Aufzeichnungsprogrammen.
    1. Stellen Sie sicher, dass die rechte Kopfbühne mit dem Kanal 1-Eingang auf der Rückseite des Mikroelektrodenstrom- und Spannungsklemmenverstärkers für die afferenten Neuronenaufnahmen und die linke Kopfbühne mit dem Kanal 2-Eingang für die VR-Aufnahmen verbunden ist.
      HINWEIS: Computerspezifikationen für den Strom- und Spannungsklemmverstärker erfordern mindestens 1 GHz oder einen besseren Prozessor, Windows XP Pro oder Mac OS X 10.46.6, CD-ROM-Laufwerk mit 512 MB RAM, 500 MB Festplattenspeicher und 2 USB-Anschlüsse.
    2. Öffnen Sie die computergesteuerte Verstärkersoftware.
    3. Stellen Sie Kanal 1 und Kanal 2 auf den aktuellen Klemmmodus ein, indem Sie für jeden Kanal auf die IC-Taste klicken.
    4. Geben Sie die folgenden Parameter unter den Registerkarten I-Clamp 1 und I-Clamp 2 ein. Primärausgang: 100x AC Membranpotential (100.000 mV/mV), Verstärkung:1.000, Bessel:1 kHz , AC:300 Hz , Scope: Bypass . Sekundärausgang: 100x AC Membranpotential (100 mV/mV), Verstärkung:1 , Tiefpassfilter: 10 Hz.
    5. Speichern Sie kanalparameter als Ch1_Aff und Ch2_VR.
    6. Installieren und öffnen Sie die Patch clamp Elektrophysiologie-Software.
    7. Klicken Sie auf Konfigurieren und wählen Sie Lab Bench, um die analogen Signale einzurichten, indem Sie Ch1_Aff und Ch2_Vr zu Digitizer-Kanälen (z. B. Analog IN #0 und Analog IN #1) hinzufügen, die über ein BNC-Koaxialkabel mit den entsprechenden Kanal 1- und Kanal 2-Skalierten Ausgängen des Verstärkers verbunden sind. Klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Die Mindestcomputeranforderungen für den Digitizer sind: ein Prozessor mit 1 GHz oder höher, Windows XP Pro oder Mac OS X 10.46.6, CD-ROM-Laufwerk 512 MB RAM, 500 MB Festplattenspeicher und 2 USB-Anschlüsse.
    8. Klicken Sie auf Acquire und wählen Sie New Protocol.
    9. Wählen Sie auf der Registerkarte Modus/Rate die Option Lückenfreiaus. Legen Sie unter Aufnahmemodusdie Testlänge entweder auf Verfügbaren Speicherplatz verwenden (d. h. bis zum Anhalten aufzeichnen) oder eine gewünschte festgelegte Dauer (hh:mm:ss)fest, und legen Sie dann die Abtastrate pro Signal (Hz) auf 20.000 fest, um die Auflösung zu maximieren.
    10. Wählen Sie auf der Registerkarte Eingänge die zuvor konfigurierten analogen IN-Kanäle (in Schritt 1.4.6) und Ch1_Aff und Ch2_VR für den entsprechenden Kanal aus.
    11. Wählen Sie auf der Registerkarte Ausgänge die Option Cmd 0 bzw. Cmd 1 für Kanal #0 bzw. Kanal #1aus.
      1. Schließen Sie Den Kanal 1-Befehl am Verstärker über ein BNC-Koaxialkabel an den Analogausgang 0 am Digitizer an und wiederholen Sie für Kanal 2 Den Befehl zum Analogausgang 1.
    12. Die übrigen Registerkarten können unter den Standardeinstellungen verbleiben. Klicken Sie auf OK und speichern Sie das Protokoll.

2. Lösungsvorbereitung

  1. Hanks Lösung vorbereiten: 137 mM NaCL, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4,0,44 mM KH2PO4,1,3 mM CaCl2,1,0 mM MgSO4,4,2 mM NaHCO4; pH 7,3. Verdünnen Sie Hanks Lösung auf 10%, indem Sie dem Schaft das entsprechende Volumen an entionisiertem Wasser hinzufügen.
  2. Extrazelluläre Lösung vorbereiten: 134 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2,1 mM CaCl2,10 mM Glukose, 10 mM HEPES-Puffer; pH 7,8 mit NaOH eingestellt. Vakuumfilter extrazelluläre Lösung durch den Filter mit 0,22 μm Porengröße.
  3. Bereiten Sie α -Bungarotoxin vor: 1 mg lyophilisiertes α-Bungarotoxin in 10 ml extrazellulärer Lösung auflösen, um eine Verdünnung von 0,1% zu erzeugen.
  4. Euthanasielösung zubereiten: 50% (mg / L) gepuffertes MS-222 in 10% iger Hank-Lösung.
    VORSICHT: α-Bungarotoxin ist ein starkes Neurotoxin, das die Muskeln lähmt, indem es cholinerge Rezeptoren blockiert. Handschuhe sind erforderlich und Augenschutz wird beim Umgang mit dem Gelähmten empfohlen.

3. Vorbereitung von Larven für elektrophysiologische Aufnahmen

  1. Zebrafischlarven immobilisieren.
    1. Verwenden Sie Larven aus der laborgezüchteten Population von Zebrafischen (Danio rerio; 4-7 Tage nach der Befruchtung) und beherbergen Sie sie in Embryolösung (10% Hank-Lösung) bei 27 ° C.
    2. Die Larve aus dem Gehäuse in eine kleine Petrischale (35 mm) mit einer großen Transferpipette übertragen und so viel wie möglich von der umgebenden Lösung entfernen.
      HINWEIS: Die Entfernung der Embryolösung verhindert die Verdünnung des Gelähmten und erhöht seine Wirksamkeit. Die Ecke eines Aufgabentuchs kann verwendet werden, um die verbleibende Embryolösung wegzutransportieren, und es ist wichtig, die Larven nicht zu kontaktieren oder Larven der Luft ausgesetzt zu lassen.
    3. Tauchen Sie Larven in 10 μL 0,1% α-Bungarotoxin für ca. 5 min.
      HINWEIS: Die Zeit, die zur Immobilisierung von Larven erforderlich ist, variiert zwischen den Präparaten. Ein gesundes Präparat hängt von der genauen Überwachung eines anhaltend schnellen Blutflusses und einer verminderten motorischen Reaktion ab. Eine kurze Überexposition gegenüber dem Gelähmten kann auch nach einer gründlichen Auswaschung zu einem langsamen Rückgang der allgemeinen Gesundheit des Präparats führen. Es ist am besten, eine Wäsche aufzutragen, bevor die Larve vollständig immobilisiert ist, während sie noch Anzeichen von subtilen Muskelvibrationen zeigt.
    4. Gelähmte Larve mit extrazellulärer Lösung waschen und 10 min baden.
      HINWEIS: Die Auswaschung ermöglicht es der Larve, von subtilen Muskelvibrationen zu einer vollständigen Lähmung überzugehen. Außerdem ist α-Bungarotoxin ein Antagonist des nikotinischen Acetylcholinrezeptors (nAChR) α9-Untereinheit, der eine kritische Komponente des endogenen Rückkopplungskreislaufs ist, den dieses Protokoll beobachtet; Dieser Effekt hat sich jedoch in Xenopus- und Zebrafisch-Haarzellen nach einem 10-minütigen Auswaschenvon 36,29als reversibel erwiesen.
  2. Stecken Sie Fisch in die Aufnahmeschale.
    HINWEIS: Eine Anästhesie (z. B. MS-222, Tricain) ist bei der Vorbereitung von Larvenzebrafischen (4-7 dpf) nicht erforderlich, da sie die Tiergesundheit beeinträchtigen. Tatsächlich sind Zebralarvenfische von bestimmten Wirbeltierprotokollen ausgenommen.
    1. Bewegen Sie die Larve mit einer Transferpipette aus dem extrazellulären Lösungsbad in die Silikonboden-Aufnahmeschale. Füllen Sie den Rest der Schüssel mit extrazellulärer Lösung.
    2. Positionieren Sie die Larven unter einem Stereomikroskop vorsichtig mit einer feinspitzigen Zette über der Mitte der Silikonmatte, seitlich nach oben, wobei das vordere und hintere Ende des Körpers von links nach rechts verläuft. Greifen Sie dann mit einer feinspitzigen Pinge einen geätzten Stift von der Silikonmatte und führen Sie den Stift orthogonal zum Silikon durch das dorsale Notochord der Larven direkt dorsal zum Anus ein. Führen Sie den zweiten Stift durch das Notochord in der Nähe des Schwanzendes ein und führen Sie den dritten Stift durch den Notochord dorsal der Gasblase ein (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Beim Einsetzen von Stiften ist es wichtig, auf die Mitte der Notochordbreite zu zielen, um zu verhindern, dass der Blutfluss beeinträchtigt oder die umgebende Muskulatur beschädigt wird. Das Notochord ist dorsal zum Nervus lateralioris, so dass bei richtiger Fixierung keine Schädigung der sensorischen Neuronen der Seitenlinie zu erwarten ist. Nach dem ersten Kontakt einsetzen, um das umliegende Gewebe nicht zu stören. Im Idealfall beträgt der Durchmesser des Stiftes weniger als die Hälfte der Breite des Notochords, um ein sauberes Einsetzen zu gewährleisten. Wenn die Pins diese Breite überschreiten, wiederholen Sie Schritt 1.2, bis die gewünschte Pinbreite erreicht ist. Wenn sich der Blutfluss nach dem Anheften verlangsamt, wiederholen Sie Schritt 1.3 mit einer neuen Probe.
    3. Setzen Sie den vierten Pin durch das otische Vesikel ein, während Sie eine leichte Drehung in Richtung des vorderen Pins bereitstellen, wenn der Pin in die Verkapselung einführt (Abbildung 1B). Wenn eine leichte Rotation angewendet wird, achten Sie auf das Gewebe zwischen dem Cleithrum und dem otischen Vesikel, um die Ansammlung von afferenten Somata freizulegen.
      HINWEIS: Das abgewinkelte Einsetzen des vierten Stifts soll die Exposition des hinteren lateralen Linien-Afferenten-Ganglions gewährleisten, das ansonsten durch das große otische Vesikel behindert wird.

4. Ventrale Wurzelaufzeichnung

  1. Legen Sie die gepinnte Larve unter das 10-fache Wasserimmersionsobjektiv auf ein DIC-Mikroskop (Differential Interference Contrast) mit fester Stufe und richten Sie die myseptalen Spalten der Muskelblöcke parallel zum linken Headstage-Annäherungsvektor aus (Abbildung 1B).
    1. Ein feststufiges DIC-Mikroskop, das auf einem optischen Lufttisch schwebt, verhindert am besten, dass Vibrationen die Aufnahmen stören. Mit einem motorisierten Positionierer kann sich das Mikroskop dann frei um die feste Stufe bewegen, in der die Vorbereitung und die Kopfbühnen montiert sind (Abbildung 1C).
    2. Legen Sie den Erdungsdraht in die Badlösung und stellen Sie sicher, dass er mit dem linken Kopfboden verbunden ist.
  2. Füllen Sie die VR-Aufnahmeelektrode mit 30 μL extrazellulärer Lösung unter Verwendung einer flexiblen Gel-Loading-Pipettenspitze und führen Sie sie in den linken Pipettenhalter des Kopfstages ein.
  3. Senken Sie die Aufzeichnungspipette mit einem Mikromanipulator in die Schalenlösung, während Sie einen positiven Druck (1-2 mmHg) ausüben, der von einem pneumatischen Wandler erzeugt wird. Vergewissern Sie sich bei 10-facher Vergrößerung, dass die Ausrichtung der Spitzenöffnung nach unten zeigt.
    1. Der pneumatische Wandler sollte über Silikonschläuche mit dem Pipettenhalteranschluss verbunden werden.
  4. Legen Sie die VR-Elektrode auf das Myoseptum
    1. Verwenden Sie den Mikromanipulator erneut, senken Sie die VR-Elektrodenspitze, bis sie die Position über der Larve hält. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf 40-fache Immersion.
    2. Bringen Sie die Elektrodenspitze über ein Myoseptum zwischen zwei Myomeren ventral zur Seitenlinie, bis der Spalt in der VR-Elektrodenspitzenöffnung zentriert ist (Abbildung 1D).
    3. Senken Sie die Pipette, bis die verzögerte Kante der Spitzenöffnung sanft mit dem Epithel in Kontakt steht. Manövrieren Sie die Pipette nach dem ersten Kontakt diagonal, um sicherzustellen, dass die Vorderkante Kontakt herstellt und eine Dichtung erzeugen kann.
    4. Unterdruck (~100 mm Hg) mit dem pneumatischen Wandler ausüben und halten.
      HINWEIS: Die richtige Ausrichtung der VR-Pipette relativ zum Myoseptum und der kontinuierliche Unterdruck optimieren die Erkennung der Motoneuronaktivität mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis durch die Haut.
  5. Erkennen Sie die Aktivität von Motoneuronen.
    1. Die linke Kopfbühne sollte an den Verstärker angeschlossen werden, der das verstärkte Signal an einen Digitizer weiterleitet, der das besagte Signal in die Patch clamp Elektrophysiologie-Software ausgibt, die auf einem benachbarten Computer überwacht werden soll (siehe Abschnitt 1.4).
    2. Klicken Sie in der Patch-Clamp-Software auf die Play-Taste in der Symbolleiste, um das VR-Signal zu überwachen (Abbildung 1E).
    3. Stellen Sie sicher, dass die VR-Aufzeichnung erreicht wird, sobald die Motoneuronaktivität mit gut stereotyper Burst-Signaldynamik beobachtet wird29,37 (Abbildung 1E).
      HINWEIS: Fiktive Schwimmkämpfe sind die Aktivitätsmuster der VR-Motoneuronen, die trotz gelähmter Präparate weiter übertragen werden. Daher sind fiktive Schwimmen ein zugängliches Mittel, um den Verhaltenszustand des Tieres zu bestimmen und bewegungsmotorische Parameter zu messen und gleichzeitig afferent neuronente Aufnahmen durchzuführen, die eine immobilisierte Vorbereitung erfordern. In unseren Händen wird eine gesunde Vorbereitung, sobald eine VR-Aufnahme erreicht ist, alle paar Sekunden freiwillige fiktive Schwimmkämpfe hervorrufen. Denken Sie daran, dass ein gesundes Präparat einen schnellen Blutfluss aufrechterhalten hat. Beachten Sie, dass die Erzielung eines ausreichenden VR-Signals mehrere Minuten dauern kann und sich das Signal-Rausch-Verhältnis nach der ersten Erkennung verbessern kann. Im Interesse der Zeit ist es akzeptabel, zu Abschnitt 5 überzugehen.
    4. Wenn nach Abschluss von Abschnitt 5 immer noch keine VR-Aufnahme erreicht wird, lassen Sie den Unterdruck los, heben Sie die Elektrode an und wiederholen Sie ab Schritt 4.4.2 auf einem anderen Myoseptum, wenn die Larvengesundheit noch optimal ist.

5. Afferente Neuronenaufnahme

  1. Füllen Sie die afferenten Aufzeichnungselektrode mit 30 μL extrazellulärer Lösung; In den rechten Pipettenhalter(Abbildung 1B,C)und unter Anwendung eines über einen pneumatischen Wandlers erzeugten Überdruck (1-2 mm Hg) in die Schüssellösung einlegen.
  2. Lokalisieren und lose an einem hinteren lateralen Linienafferenten Ganglion befestigen.
    1. Senken Sie mit einem Mikromanipulator die afferentielle Elektrodenspitze ab, bis sie die Position über dem Cleithrum hält.
    2. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf 40-fache Immersion und lokalisieren Sie den Schnittpunkt des hinteren Seitenliniennervs und des Cleithrums. Folgen Sie dem Nervus lateral line anterior vom Cleithrum bis zu dem Ort, an dem die Fasern das hintere lateral line afferente Ganglion innervieren, erkennbar durch den diskreten Cluster von Soma (Abbildung 1F).
    3. Bringen Sie die Elektrodenspitze über das afferenten Ganglion und senken Sie die Pipette, bis die Spitze das Epithel kontaktiert. Manövrieren Sie die Elektrode vorsichtig so, dass der gesamte Spitzenumfang das affente Ganglion kontaktiert.
    4. Unterdruck (20-50 mm Hg) mit dem pneumatischen Wandler ausüben und halten.
      HINWEIS: Der Unterdruck, der auf das affente Ganglion ausgeübt wird, ist sanfter als der Saugdruck, der während der ventralen Wurzelaufzeichnung angewendet wird. Steigender Unterdruck kann das Signal-zu-Rauschen verbessern, aber die Gesundheit der afferenten Neuronen nimmt unter anhaltender aggressiver Absaugung ab, was die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Aufnahme verringert.
  3. Zeichnen Sie die affente Neuronenaktivität auf.
    1. Stellen Sie sicher, dass die richtige Kopfbühne in einer ähnlichen Reihenfolge wie in Schritt 4.5.1 beschrieben verbunden ist.
    2. Klicken Sie in pClamp10 auf die Schaltfläche Wiedergabe in der Symbolleiste, um verschiedene Neuronen und VR-Signale gleichzeitig zu überwachen.
    3. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Zelle, lose Patch-Aufzeichnung von afferenten Neuronen erreicht wird, sobald Spikes spontan auftreten, ungefähr alle 100-200 ms1,29 (Abbildung 1E).
    4. Erhöhen Sie allmählich den afferenten Neuronen-Aufzeichnungselektrodendruck wieder auf atmosphärisch (0 mm Hg) und halten Sie für den Rest der Aufnahme.

6. Datenerfassung

  1. Gleichzeitige Aufzeichnung.
    1. Sobald sowohl die Aktivität unterschiedlicher Neuronen als auch der Motoneuronen erkannt wurde, klicken Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen in der Symbolleiste in pClamp10, um gleichzeitig lückenlose Aufnahmen in beiden Kanälen aufzunehmen.
    2. Aufzeichnung für die gewünschte Dauer (Abbildung 1E).
      HINWEIS: Eine Aufnahme in einem gesunden Präparat kann viele Stunden dauern und auf äußere Reize reagieren.
    3. Speichern Sie die Aufzeichnung als unterstützten Dateityp (.abf, pClamp10), um Metadaten wie Erfassungsparameter beizubehalten.

7. Euthanasie

  1. Wenden Sie mit pneumatischen Wandlern einen Überdruck (10 mm Hg) auf affeniederte und VR-Aufzeichnungselektroden an und heben Sie die Elektroden mit den Mikromanipulatoren aus der Aufnahmeschale an.
  2. Übertragen Sie die Aufnahmeschale vom feststehenden DIC-Mikroskop auf das Sezierstereomikroskop.
  3. Entfernen Sie mit einer feinen Spitzenzette Wolframstifte aus Notochord und Otic-Kapsel und übertragen Sie die Larven mit einer Transferpipette in eine Petrischale (35 mm), die mindestens 5 ml Euthanasielösung für mindestens 5 Minuten enthält.

8. Vorverarbeitung und Datenanalyse

HINWEIS: Die Datenvorverarbeitung und -analyse erfordert ein grundlegendes Verständnis der Befehlszeilencodierung.

  1. Konvertieren Sie die Aufnahmedatei für die Vorverarbeitung.
    1. Installieren Sie die Matlab-Software.
    2. Laden Sie das benutzerdefinierte Skript abfload.m38 herunter und speichern Sie die Datei in demselben Ordner, in dem die Rohaufzeichnungsdatei gespeichert ist.
    3. Öffnen Sie im Matlab Editor-Fenster abfload.m und klicken Sie in der Symbolleiste auf Ausführen. Wählen Sie Ordner ändernaus, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
    4. Führen Sie die Funktion im Befehlsfenster mit der rohen Aufzeichnungsdatei als Eingabe aus,
      > [d,si,h] = abfload('[Name der Rohaufzeichnungsdatei].abf')
      und speichern Sie den Ausgabearbeitsbereich mit einem Dateinamen, der Larvenbezeichnung, Alter und Versuchsdatum enthält, z. B. [Probennummer]_[Alter in dpf]_[Name der rohen Aufzeichnungsdatei (standardmäßig auch experimentelles Datum enthalten)].
      HINWEIS: Der konvertierte Dateiname sollte nur unterStrichen abgegrenzte ganze Zahlen enthalten.
  2. Führen Sie eine Datenvorverarbeitung durch.
    1. Laden Sie das Matlab-Skript herunter AffVR_preprocess.m und zugehörigen Funktionen, die von den Autoren speziell geschrieben wurden.
    2. Öffnen Sie im Fenster Editor AffVR_preprocess.m.
    3. Passen Sie unter Variablendie Schwellenwerte für die Erkennung von Untergrenzen für Spitzen sowohl für affente als auch für VR-Aufnahmen(spk_detect_lb und vr_detect_lb,Zeilen 8 bzw. 14) in Abhängigkeit von der Aufzeichnung des Signal-Rausch-Verhältnisses an.
      HINWEIS: Die Spike-Erkennung beruht auf manuellen Schwellenwerten, um Signale von mehr als einem afferenten Neuron nach Amplitude zu sortieren und zu isolieren. Baseline-Rauschen und Aktivität von anderen Einheiten werden durch Schwellenwerte herausgefiltert, um nur Spitzenamplituden innerhalb eines Prozents (z. B. spk_detect_lb) des Maximums (z. B. spk_detect_ub) einzubeziehen. Thresholding sorgt auch für ein genaues Binning von motorischen Aktivitätsspitzen in Bursts und kollektive fiktive Schwimmkämpfe. Beginnen Sie im Allgemeinen mit einer Schwellenwert-Untergrenze von 0,5 und verringern Sie allmählich, bis eine genaue Erkennung erreicht ist. Wenn Sie beispielsweise spk_detect_lb auf 0,5 und spk_detect_ub auf 1,0 einstellen, werden alle Spitzen erkannt, die mindestens 50 % des Spitzenamplitudenmaximums entsprechen und Rauschen oder zusätzliche Neuronen mit niedrigeren Spitzenamplituden ausschließen (Abbildung 2A). Alternativ könnte man auch die spk_detect_ub von 1,0 senken, um Neuronen mit höheren Spike-Amplituden auszuschließen, um die Neuronen niedrigerer Spike-Amplituden zu isolieren. Die Vorverarbeitung der Figurenausgaben (siehe Schritt 7.2.6) informiert darüber, ob Anpassungen und Wiederholungen aus Schritt 7.2.2 erforderlich sind.
    4. Klicken Sie im Editorfenster auf Ausführen, um AffVR_preprocess.m auszuführen.
    5. Navigieren Sie zur zuvor konvertierten .mat-Datendatei (siehe Schritt 7.1.3); Wählen Sie aus und klicken Sie auf Öffnen, um die automatische Vorverarbeitung zu starten.
      HINWEIS: Während das benutzerdefinierte Skript ausgeführt wird, werden im Befehlsfenster Ausgaben angezeigt, die den Fortschritt durch Verarbeitungsschritte wie "Filtern von Daten ...", "Erkennen ventraler Wurzelaktivität ..." und "Generieren von Zahlen ..." informieren.
    6. Die von AffVR_preprocess.m generierten Zahlen visualisieren die Erkennung von afferenten Spitzen und VR und zeigen an, ob Analysevariablen angepasst werden sollten (Abbildung 2).
    7. Geben Sie "Y" auf der Tastatur ein, um vorverarbeitete Metadaten in einem preprocess_output Ordner zu speichern.
    8. Vorverarbeitete Daten werden automatisch wie data_out.xlsausgegeben.
  3. Analysieren Sie die vorverarbeiteten Daten wie gewünscht.

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Ergebnisse

Nachdem Zebrafischlarven richtig immobilisiert und die hintere Seitenlinie afferentes Ganglion und VR-Aufzeichnung erreicht wurde, kann die Aktivität sowohl in afferenten als auch in Motoneuronen gleichzeitig gemessen werden. Die Anzeige der Aufzeichnungskanäle über lückenlose Aufzeichnungsprotokolle (Schritt 1.4) zur kontinuierlichen Überwachung der Afferent- und VR-Aktivität. In Echtzeit kann gleichzeitig mit der VR-Aktivität, die auf fiktive Schwimmkämpfe hinweist, eine Abnahme der spontanen afferenten Spitzenrate beo...

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Diskussion

Das beschriebene experimentelle Protokoll bietet das Potenzial, endogene Veränderungen des sensorischen Inputs über motorisches Verhalten in einem intakten, sich verhaltenden Wirbeltier zu überwachen. Insbesondere beschreibt es einen In-vivo-Ansatz zur Durchführung simultaner extrazellulärer Aufnahmen von lateralen line afferenten Neuronen und ventralen motorischen Wurzeln in Larvenzebrafischen. Spontane affente Aktivität wurde zuvor bei Zebrafischen ohne Berücksichtigung einer möglichen gleichzeitigen motorischen Aktivi...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Wir danken dem National Institute of Health (DC010809), der National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) und dem Whitney Laboratory for Marine Biosciences für J.C.L. Wir danken ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Liao Lab für anregende Diskussionen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 mL BecherglasPYREX1000Gefäß für Ätzmittel
10x WasserimmersionsobjektivOlympusUMPLFLN10xWniedrige Vergrößerung zur Positionierung von Larven und Aufnahmeelektrode
40x WasserimmersionsobjektivOlympusLUMPLFLN40XWhöhere Vergrößerung für die Positionierung der Elektrodenspitze und die Einrichtung einer Patch-Klemme
abfload.mErgänzende CodierungsdateiSpeziell geschriebenes MATLAB-Skript zum Konvertieren von elektrophysiologischen Rohaufzeichnungen in .mat-Dateien
AffVR_preprocess.mErgänzende CodierungsdateiSpeziell geschriebenes MATLAB-Skript zur Vorverarbeitung von Aufzeichnungsdaten
BNC-KoaxialkabelThorLabs2249-C-12zum Verbinden von Verstärker- und Digitizer-Kanälen; erfordert 4
Borosilikatglas-Kapillaren mit FilamentWarner InstrumenteG150F-3Innendurchmesser: 0,86, Außendurchmesser: 1,50; Kapillarglas zur Bildung von Aufzeichnungselektroden
burst_detectergänzende Codierungsdateibenutzerdefinierte MATLAB-Funktion, die zum Ausführen von AffVR_preprocess
m ComputerN/AN/AComputer sollte funktionieren
DC-NetzteilTenma72-420wird zum elektrischen Ätzen von Dissektionsstiften verwendet
Digitalisierer für ElektrophysiologieAxon Instruments, Molecular DevicesAxon DigiData 1440Aermöglicht die Erfassung von Patch-Clamp-Datenfilamenten
Sutter Instrument CompanyFB255B2,5-mm-Box-Filament für Mikropipettenzieher-Feinpinzetten
Fine Science ToolsDumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Artikel-Nr. 11295-10zur Manipulation von Larven und zum Einsetzen von Stiften
mit festem Tisch DIC MikroskopOlympusBX51WIMikroskop zur Visualisierung und Erstellung von Patch-Clamp-Aufzeichnungen
Flexible, konische PipettenspitzeFisher Scientific02-707-169Flexible Spitzen ermöglichen das Einführen in die Aufzeichnungselektrode, um extrazelluläre Lösung an der Spitze abzugeben
FluoroDishWorld Precision Instruments Inc.FD3510-100Aufnahmeschüssel mit Deckglasboden
KimWipeKimTech34155Arbeitstuch zum Ableiten von überschüssiger Flüssigkeit von Larven
Kwik-GardWorld Precision Instruments Inc.710172selbstmischendes Sylgard-Elastomer
MATLABMathWorksR2020bBefehlszeilensoftware für die Vorverarbeitung
von Daten MikroelektrodenverstärkerAxon Instruments, Molecular DevicesMultiClamp 700BPatch-Clamp-Verstärker für Zweikanal-Aufnahmen
MicroforgeNarishigeMF-830 Microforgezum Polieren von Mikromanipulator für Aufnahmeelektroden
SteuergerätSiskiyouMC1000-eR/T4-Achsen-Drehknopf-Koordinator zur Steuerung des Mikromanipulators
MikropipettenabzieherSutter Instrument CompanyFlaming/Brown P-97zum Einziehen von Kapillarglas in die Aufzeichnungselektroden
Mikroskop-SteuergerätSiskiyouMC1000epositioniert das Mikroskop um den festen Tisch und die Vorbereitung
motorisierter MikromanipulatorSiskiyouMX7600positioniert den Kopftisch und die daran befestigte Aufnahmeelektrode für die Patch-Clamp-Aufzeichnung
MultiClamp CommanderMolecular Devices2.2.2kann von Axon heruntergeladen werden MultiClamp 700B Commander Download-Seite
Optischer LufttischNewport CorporationVH3036W-OPTBreadboard-Isolationstisch zum Schwimmen des Mikroskops und zur Minimierung von Vibrationen während der Aufnahme
pCLAMPMolecular Devices10.7.0zum Download von Axon pCLAMP 10 Elektrophysiologie Datenerfassung & Analyse-Software Download-Seite
PermanenttintenmarkerSharpie-Bestellungvon amazon.comzur Markierung der Vorderkantenseite der VR-Elektrode, um die richtige Ausrichtung beim Einführen in den Pipettenhalter zu gewährleisten
PetrischaleFalcon35-3001zum Eintauchen von Larven in einen paralytischen
PipettenhalterMolecular Devices1-HL-U hält dieAufzeichnungselektrode und verbindet sie mit dem Kopftisch
pneumatischer SchallkopfFluke Biomedical InstrumentsDPM1Bzur Steuerung der Aufzeichnungselektrode Innendruck
KaliumhydroxidSigma-Aldrich221473-25GÄtzmittel zum Ätzen von Präparierstiften
SilikonschlauchTygon14-169-1ASchlauch zum Anschluss des pneumatischen Schallkopfs an den Pipettenhalter
spike_detectergänzende Codierungsdateibenutzerdefinierte MATLAB-Funktion, die für den Betrieb AffVR_preprocess
StereomikroskopsZeissStemi 2000-Cerforderlich ist, wird zur Visualisierung von Stiftspitzen und während der Vorbereitung von Larven
RasierklingeCanopusBestellung von amazon.comschneidet den Wolframdraht bei der Herstellung von Sezierstiften
swimbout_detectergänzende Codierungsdateibenutzerdefinierte MATLAB-Funktion, die für den Betrieb der
AffVR_preprocess-SpritzeBecton Dickinson Compoany309602gefüllt mit extrazellulärer Lösung zur Injektion in Aufzeichnungselektroden
TransferpipetteSigma-AldrichZ135003-500EAunsterile Einwegpipette zum Übertragen von Larven
Tricain, MethansulfonatSyndel12854Pharmazeutisches Anästhetikum zur Einschläferung von Larven mit hoher Dosierung.
WolframdrahtWorld Precision Instruments Inc.7155000,002 Zoll, 50,8 μ m Durchmesser; zur Herstellung von Präparierstiften
VakuumfiltrationseinheitSigma-AldrichSCGVU11REsterile Einweg-Vakuumfiltrationseinheiten zur Sterilisation extrazellulärer Lösungen für die Elektrophysiologie Elektrodenringer Spannungsklemme
Stromklemme KopftischMolecular DevicesCV-7Bgeliefert mit MultiClamp 700B Verstärker als linker und rechter Kopftisch &
alpha;-BungarotoxinThermoFisherB1601zur Immobilisierung der Larven vor der Aufnahme
erforderlich ist Jeder Carl verwendet gerade erforderlich ist

Referenzen

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