Methodenartikel

Primäre Mikroglia-Isolierung aus postnatalen Mausgehirnen

DOI:

10.3791/62237

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25. Februar 2021

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1Shanghai Key Laboratory of Psychotic Disorders, Shanghai Mental Health Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Division of Biology and Biomedical Science, Washington University in St. Louis, 3Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 4Department of Neurosurgery, Huashan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University, 5Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die primäre Zellkultur ist einer der primär genutzten Ansätze zur Erforschung der Mikrogliabiologie in vitro. In dieser Arbeit haben wir eine Methode zur einfachen und schnellen Isolierung von Mikroglia von der Maus am postnatalen Tag 1 (P1) bis zum P4 entwickelt.

Zusammenfassung

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Mikroglia sind die mononukleären Fresszellen im Zentralnervensystem (ZNS), die eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Regulierung des Entzündungsprozesses im ZNS spielen. Um die Mikrogliabiologie in vitro zu untersuchen, zeigen primäre Mikroglia große Vorteile im Vergleich zu immortalisierten Mikrogliazelllinien. Die Isolierung von Mikroglia aus dem postnatalen Gehirn von Mäusen ist jedoch relativ weniger effizient und zeitaufwändig. In diesem Protokoll bieten wir eine schnelle und einfach zu befolgende Methode zur Isolierung primärer Mikroglia aus dem neonatalen Mausgehirn. Die Gesamtschritte dieses Protokolls umfassen die Dissektion des Gehirns, die primäre Gehirnzellkultur und die Isolierung von Mikroglia. Mit diesem Ansatz können Forscher primäre Mikroglia mit hoher Reinheit erhalten. Darüber hinaus waren die geernteten primären Mikroglia in der Lage, auf die Lipopolysaccharid-Herausforderung zu reagieren, was darauf hindeutet, dass sie ihre Immunfunktion behielten. Gemeinsam haben wir einen vereinfachten Ansatz entwickelt, um primäre Mikroglia effizient und mit hoher Reinheit zu isolieren, der ein breites Spektrum an mikrogliabiologischen Untersuchungen in vitro ermöglicht.

Einleitung

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Mikroglia, die residenten Immunzellen im Zentralnervensystem (ZNS), spielen eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase, die auf die neuropathologischen Herausforderungen reagiert1. In jüngster Zeit wurden intensive Untersuchungen durchgeführt, um die physiologischen Funktionen von Mikroglia herauszufinden, z.B. bei der Alzheimer-Krankheit2. Derzeit ermöglicht das Transkriptionsprofil von Mikroglia mit der Einzelzellauflösung, das während der ZNS-Entwicklung, des Alterns und der Krankheit erhalten wurde, ein besseres Verständnis der Mikrogliafunktion in gesunden und kran....

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Protokoll

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Alle tierexperimentellen Verfahren wurden vom Ausschuss für Tierversuche und dem institutionellen Verwaltungsausschuss für die Pflege von Versuchstieren an der Shanghai Jiao Tong Universität genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leid der Tiere so gering wie möglich zu halten.

1. Vorbereitung von Kulturpuffer, Kolben und Deckgläsern

  1. Nährmedium und Mikroglia-Kulturmedium: Ergänzen Sie DMEM mit 10 % FBS, um das Kulturmedium herzustellen. Das Mikroglia-Kulturmedium wird hergestellt, indem dem DMEM 10 % FBS und 20 % LADMAC-konditioniertes Medium zugesetzt werden. Fügen Sie 1% Pe....

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Ergebnisse

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Primäre Mikroglia, die an Tag 7 und Tag 35 nach der Zellaussaat aus CX3CR1+/GFP entnommen wurden, wurden in Abbildung 1 gezeigt. Wie in der Immunfluoreszenzfärbung des Mikroglia-/Makrophagenzellmarkers IBA1 gezeigt, sind alle IBA1-positiven Zellen positiv für die GFP-Signale und negativ für S100β (Astrozytenmarker) und CC1 (Oligodendrozytenmarker), was darauf hindeutet, dass es sich bei den gereinigten GFP-positiven Zellen tatsächlich um Mikroglia handelt. Als nächstes wurde festg.......

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Diskussion

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Dieses Protokoll basiert auf den zuvor beschriebenen Methoden mit einigen Modifikationen11. Tipps zur Verbesserung der Lebensfähigkeit und Reinheit isolierter Mikroglia sind wie folgt aufgeführt. Achten Sie zunächst darauf, eine Kontamination bei der Vorbereitung von Puffern für die Gewebeisolierung und Zellkultur zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die chirurgischen Werkzeuge, Behälter und Kunststoffgeräte steril sind. In der Regel führen wir die Hirndissektio.......

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Offenlegungen

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Alle Autoren gaben an, dass es keine Interessenkonflikte gibt. Alle Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

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Die Autoren möchten den Helden im Kampf gegen den COVID-19-Ausbruch ihren Respekt zollen. Die Autoren danken Fang Lei (Fudan University) für das hervorragende Labormanagement, Dr. Zikai Zhou, Dr. Jing Li und Dr. Guiqing He (Shanghai Mental Health Center) für die Diskussion über die Isolierung von Mikroglia. Zu guter Letzt zeigen die Autoren ihre Dankbarkeit und ihren Respekt gegenüber allen Tieren, die in dieser Studie geopfert wurden. Diese Studie wurde unterstützt durch das National Key R&D Program of China (Grant No. 2017YFC0111202) (B.P.), die National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31922027) (B.P.) und (Grant No. ....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zellsiebe, 40 & Mikro; mThermoFisher Scientific22-363-547
DNase I Sigma11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco von Life TechnologiesC11995500BT
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Gibco von Life Technologies14190-144
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco von Life Technologies10099141
Papain, SuspensionSangon BiotechPapain, Suspension
Penicillin-Streptomycin 100X LösungHycloneSV30010
Poly-D-LysinThermoFisher ScientificA3890401

Referenzen

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  1. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  2. Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. Microglia in neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 6 (4), 193-201 (2010).
  3. Parker, K. R., et al.

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Schlagwörter

Primary MicrogliaMicroglia IsolationPostnatal Mouse BrainBrain DissectionBrain Cell CultureMicroglial BiologyCentral Nervous SystemImmune FunctionIn Vitro MicrogliaMicroglia Purity
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