Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen aus dem Turner-Syndrom (45XO) fetaler Zellen zur nachgelagerten Modellierung neurologischer Defizite im Zusammenhang mit dem Syndrom

2.6K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/62240

⸱

4. Dezember 2021

 ,  ,  ,  , 
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von integrationsfreien iPS-Zellen aus fetalen Gewebefibroblasten durch Abgabe episomaler Plasmide durch Nukleofektion, gefolgt von der Beschreibung von Methoden zur iPSC-Charakterisierung und neuronalen Differenzierung.

Zusammenfassung

Chromosomale Aneuploidien verursachen schwere angeborene Fehlbildungen, einschließlich Fehlbildungen des zentralen Nervensystems und fetalem Tod. Das pränatale genetische Screening ist rein diagnostisch und klärt den Krankheitsmechanismus nicht auf. Obwohl Zellen von aneuploiden Föten wertvolles biologisches Material sind, das die chromosomale Aneuploidie trägt, sind diese Zellen kurzlebig, was ihre Verwendung für nachgelagerte Forschungsexperimente einschränkt. Die Generierung von modellen für induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) ist eine effektive Methode der Zellvorbereitung zur ständigen Erhaltung aneuploider Merkmale. Sie erneuern sich selbst und differenzieren sich zu spezialisierten Zellen, die an die Embryonalentwicklung erinnern. Daher dienen iPS-Zellen als hervorragende Werkzeuge, um frühe Entwicklungsereignisse zu untersuchen. Das Turner-Syndrom (TS) ist eine seltene Erkrankung, die mit einem ganz oder teilweise fehlenden X-Chromosom einhergeht. Das Syndrom ist gekennzeichnet durch Unfruchtbarkeit, Kleinwuchs, endokrine, metabolische, autoimmune und kardiovaskuläre Störungen und neurokognitive Defekte. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von Fibroblasten aus TS (45XO) fetalem Gewebe, die Erzeugung von integrationsfreien TSiPS-Zellen durch Abgabe von episomalen Reprogrammierungsplasmiden durch Nukleofektion mit anschließender Charakterisierung. Die reprogrammierenden TSiPS-Zellen wurden zunächst durch lebendzellige alkalische Phosphatase-Färbung gescreent, gefolgt von umfangreichen Untersuchungen nach Pluripotenz-Biomarkern. Ausgewählte Kolonien wurden mechanisch seziert, mehrmals durchquert und stabile, sich selbst erneuernde Zellen für weitere Experimente verwendet. Die Zellen exprimierten Pluripotenz-Transkriptionsfaktoren OCT4, NANOG, SOX2, Zelloberflächenmarker SSEA 4 und TRA1-81, die typisch für pluripotente Stammzellen sind. Der ursprüngliche 45XO-Karyotyp wurde nach der Neuprogrammierung beibehalten. Die TSiPS-Zellen waren in der Lage, embryoide Körper zu bilden und sich in Zellen von Endoderm, Mesoderm und Ektoderm zu differenzieren, die linienspezifische Biomarker exprimieren ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Die exogenen episomalen Plasmide gingen spontan verloren und wurden nach Passage 15 in Zellen nicht nachgewiesen. Diese TSiPS-Zellen sind eine wertvolle zelluläre Ressource für die Modellierung defekter molekularer und zellulärer Neuroentwicklung, die neurokognitive Defizite im Zusammenhang mit dem Turner-Syndrom verursachen.

Einleitung

Aneuploidien führen beim Menschen zu Geburtsfehlern/angeborenen Fehlbildungen und Schwangerschaftsverlust. ~ 50% -70% der Proben aus Schwangerschaftsverlusten zeigen zytogenetische Anomalien. Aneuploide Embryonen, die früh in der Schwangerschaft verloren gehen, können nicht einfach für experimentelle Analysen gewonnen werden, was die Notwendigkeit erhöht, andere Modelle zu entwickeln, die die menschliche Embryogenese genau repräsentieren. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), die aus Zellen gewonnen wurden, bei denen genetische Störungen diagnostiziert wurden, wurden verwendet, um die repräsentativen genetischen Unregelmäßigkeiten und ihre Folgen für die fetale Entwicklung zu modellieren1,2,3,4. Diese iPS-Zellen ähneln Epiblastenzellen des sich entwickelnden Embryos und können die frühen Ereignisse der Embryonenbildung rekapitulieren. Sie ermöglichen das Verständnis und die Charakterisierung des Entwicklungsprogramms von Zelllinien und Mustern in frühen Säugetierembryonen. iPS-Zellen, die zuvor aus Hautfibroblasten und Amniozyten aus pränatalen diagnostischen Tests von Aneuploidie-Syndromen wie Monosomie X (Turner-Syndrom), Trisomie 8 (Warkany-Syndrom 2), Trisomie 13 (Patau-Syndrom) und partieller Trisomie 11 abgeleitet wurden; 22 (Emanuel-Syndrom) haben wertvolle Erkenntnisse über gescheiterte Entwicklungen geliefert4.

Das Turner-Syndrom (TS) ist eine seltene Erkrankung, die durch weibliche Unfruchtbarkeit, Kleinwuchs, endokrine und metabolische Störungen, ein erhöhtes Risiko für Autoimmunerkrankungen und eine Prädisposition für Herz-Kreislauf-Erkrankungen gekennzeichnet ist5. Obwohl es das einzige überlebensfähige Monosomie-Syndrom ist, ist es auch tödlich für den sich entwickelnden Embryo, der spontane Abtreibungen verursacht6. Überlebende Individuen mit TS zeigen einen Grad der Veränderung von X-chromosomalem Material in ihren Zellen. Karyotypen reichen vom vollständigen Verlust eines X-Chromosoms (45,XO) bis hin zu Mosaiken wie 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, das Vorhandensein von Ringchromosomen, das Vorhandensein von Y-chromosomalem Material usw.5.

Die Diagnose des Syndroms erfolgt im Allgemeinen durch Karyotypisierung von Blut von symptomatischen Personen und Chorionzottenbiopsie (CVS), um frühe Aneuploidie-Syndrome zu erkennen. Da Aneuploidie-Syndrome für ~ 30% der spontanen Abtreibungen verantwortlich sind, ist es Routine, das Produkt der Empfängnis (POC) nach einer spontanen Abtreibung zu karyotypisieren. Diese fetalen Zellen, einschließlich der Chorionzotten, die die zytogenetische Anomalie besitzen, und die daraus abgeleiteten iPS-Zellen bieten eine wertvolle Quelle für biologisches Material zur Untersuchung der Aneuploidie-Syndrome4,6. TS iPS-Zellen wurden zuvor aus Amniozyten durch retrovirale Reprogrammierung4, Fibroblasten von Chorionzotten (erhalten durch pränatale Diagnostik) durch retrovirale Reprogrammierung6, aus mononukleären Blutzellen7 durch Sendai-Virus-Reprogrammierung und aus Hautfibroblasten von TS-Individuen durch lentivirale Reprogrammierung4 . Da das Hauptaugenmerk unseres Labors auf dem Verständnis von Entwicklungsstörungen liegt, haben wir TS iPSCs aus POC erzeugt, insbesondere die Chorionzottenkomponente einer spontanen Abtreibung8. Alle aus diesem fötalen Gewebe isolierten Zellen hatten einen 45XO-Karyotyp und ergaben iPS-Zellen mit dem gleichen Karyotyp. Diese iPS-Zellen sind einzigartig, da sie die ersten sind, die von einem abgetriebenen Fötus erzeugt werden und eine wertvolle Ressource zur Untersuchung von aneuploidiebedingten Schwangerschaftsfehlern darstellen. Dieser Artikel bietet eine detaillierte Methodik der Erzeugung von iPS-Zellen aus dieser einzigartigen Zellquelle durch episomale Reprogrammierung.

Die frühen Methoden der iPSC-Generierung verwendeten virale Transduktion und Transposons, um die Reprogrammierungsfaktoren zu liefern. Methoden zur Induktion von Zellen zur Pluripotenz haben sich von der Integration retroviralerVektoren 9,erregbaren lentiviralenVektoren 10,11 und Transposon-basierten Methoden12 zu nicht-integrierenden adenoviralenVektoren 13 und Sendai-Virus-basierten Vektoren14entwickelt. Retrovirale und lentivirale Reprogrammierung, obwohl effizient, beinhaltet die Integration der Reprogrammierungsfaktoren in die Wirtschromosomen, was zu Insertionsmutationen führt, die unvorhergesehene Auswirkungen in den iPS-Zellen haben. Darüber hinaus verhindert die virale Reprogrammierung die translationale Anwendung von iPS-Zellen. RNA-basierte Systeme15 und direkte Proteinabgabe16 wurden untersucht, um die potenziellen Risiken, die mit der Verwendung von Viren und DNA-Transfektionen verbunden sind, vollständig zu eliminieren. Diese Methoden haben sich jedoch als ineffizient erwiesen.

Im Jahr 2011 berichteten Okita et al. über eine verbesserte Effizienz der Reprogrammierung durch episomale Plasmide, die mit TP53-Unterdrückung über shRNA verstärkt wurden. Sie ersetzten cMYC auch durch nicht transformierendes LMYC (small cell lung carcinoma associated MYC), um die Sicherheit der hiPS-Zellen zu erhöhen. Diese episomalen Plasmide exprimieren 5 Reprogrammierungsfaktoren: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC und shRNA für TP5317,18. Diese Vektoren werden extrachromosomal beibehalten und gehen bei kontinuierlicher Kultur von den reprogrammierten Zellen verloren, wodurch die Linien innerhalb von 10-15 Passagen transgenfrei werden. Die Nukleofektion ist eine spezialisierte Form der Elektroporation, die Nukleinsäuren direkt in den Kern der Wirtszellen abgibt. Es ist eine effiziente Methode zur Abgabe der reprogrammierenden Plasmide in verschiedene Zelltypen. Episomale Plasmide sind kostengünstig und kompensieren die hohen Kosten der Nukleofektion. Diese Methode ist effizient und reproduzierbar unter optimierten Bedingungen und liefert stabile iPS-Zellen aus einer Vielzahl von somatischen Zellen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode zur Erzeugung von iPS-Zellen aus Fibroblasten, die aus fetalem Gewebe durch Nukleofektion von episomalen Reprogrammierungsplasmiden isoliert wurden. Hier sind die detaillierten Protokolle für die Fibroblastenisolierung aus fetalen Chorionzotten, Plasmidreinigung, Nukleofektion, Pflücken von Kolonien von der Reprogrammierungsplatte und Etablierung stabiler iPS-Zellen.

Es ist wichtig, das Vorhandensein von Pluripotenzmerkmalen in den neu erzeugten iPS-Zellen zu bestätigen. Dazu gehören der Nachweis von pluripotenzbezogenen Faktoren (z. B. alkalische Phosphataseexpression, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-Cadherin; in der Regel mit Immunfluoreszenz- oder Genexpressionsassays gezeigt), die Identifizierung der drei Keimschichten durch In-vitro-Differenzierungstests zur Validierung ihres Differenzierungspotenzials, die Karyotypisierung zur Bestimmung des Chromosomengehalts, die STR-Typisierung zur Feststellung der Identität mit Elternzellen, die Überprüfung des Verlusts exogener Gene. und strengere In-vivo-Assays wie Teratombildung und tetraploide Komplementierung. Hier beschreiben wir Charakterisierungsprotokolle der Karyotypisierung, die alkalische Phosphatasefärbung lebender Zellen, den Nachweis von pluripotenzbezogenen Biomarkern durch Immunfluoreszenz, In-vitro-Differenzierungsassays und Methoden zum Nachweis des Verlusts exogener Gene19.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

FCV wurden vom Manipal Hospital, Bengaluru, unter der Genehmigung der Ethikkommission der Manipal Hospitals erhalten.

HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung aller Puffer und Lösungen.

1. Isolierung von Fibroblasten aus fetalen Chorionzotten (FCV)

  1. Probenentnahme und Gewebedesintegration in kollagenase
    1. FCV unter sterilen Bedingungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) sammeln und (bei Raumtemperatur) zur Zellkulturanlage transportieren.
    2. Die Zotten in eine 60 mm Petrischale geben und mehrmals (mindestens 4 mal) in PBS mit 1x Antibiotikum Antimykotika (PBS-AA) waschen. Entfernen Sie PBS-AA vollständig durch Pipettieren.
    3. Behandeln Sie die Chorionzotten mit 1 ml Kollagenasemischung (5 mg/ml) für 5 min bei 37 °C.
    4. Mit Zellkulturmedium, das 10% fötales Rinderserum (FBS) enthält, neutralisieren, in ein 15-ml-Röhrchen überführen und 5 Minuten lang bei 225 x g zentrifugieren, um die zerfallenen Zotten und freigesetzten Zellen als Pellet zu sammeln.
  2. Subkultur und Bestandserweiterung
    1. Plattenzersinkte Zotten zusammen mit freigesetzten Zellen in einem T25-Kulturkolben, der 5 ml vollständige Medien (z. B. AmnioMAX) enthält, und wachsen, bis eine konfluente Fibroblastenkultur erhalten wird.
    2. Erweitern Sie Fibroblasten in Kultur, um die Bestände für die Verwendung in nachfolgenden Transfektions- und Charakterisierungsexperimenten wie folgt vorzubereiten:
      1. 2 ml 0,05% Trypsin in den T25-Kolben mit FCV-Fibroblasten geben und bei 37 °C für 3-5 min inkubieren, um die Zellen zu dissoziieren.
      2. Neutralisieren Sie Trypsin nach der Inkubation durch Zugabe von FBS (im gleichen Volumen wie Trypsin).
        HINWEIS: Kulturmedium, das FBS enthält, kann auch verwendet werden, um Trypsin zu neutralisieren, wenn es in einem Trypsin:Medien-Verhältnis von 1:3 hinzugefügt wird.
      3. Sammeln Sie die dissoziierten Zellen in einem 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 225 x g für 5 min, um Zellpellets zu erhalten.
      4. Dekantieren Sie Überstand und resuspend Zellpellet in 1 mL komplettem Medium.
      5. Übertragen Sie je 500 μL auf 60 mm gewebekulturbehandelte Schalen und machen Sie das Volumen auf 5 mL auf. Dieses Spaltverhältnis von 1:2 wurde auch für nachfolgende Passagen verwendet.
  3. Kryokonservierung
    1. Enzymatische Dissoziation unter Verwendung von 0,05% Trypsin wie in den Schritten 1.2.2.1 - 1.2.2.3 beschrieben durchführen und Zellpellet erhalten.
    2. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 1 ml Gefriermischung, umfassend 1:9 Dimethylsulfoxid (DMSO): FBS.
    3. Geben Sie den Inhalt in ein steriles Kryovial und legen Sie die Durchstechflasche in einen Gefrierbehälter.
    4. Über Nacht bei -80 °C einfrieren und die Durchstechflaschen am nächsten Tag auf flüssigen Stickstoff (-196 °C) umfüllen.

2. DNA-Isolierung und -Verifizierung von Plasmiden

  1. Bakterielle Zellvorbereitung
    1. Streakglycerinvorräte von E. coli enthalten die drei einzelnen Plasmide pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK und pCXLE-hUL (von Addgene) auf separaten Luria Bertani-Ampicillin-Agarplatten.
    2. Impfen Sie einzelne Kolonien in Starterkulturen von 5 ml Luria Bertani-Ampicillinmedium. 8 Stunden bei 37 °C unter Schütteln (10 x g) inkubieren.
    3. Impfen Sie 200 μL dieser Starterkultur in 100 ml Luria Bertani-Ampicillin-Medium. Über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubieren.
    4. Ernte über Nacht Bakterienkultur durch Zentrifugieren bei 6000 x g für 15 min bei 4 °C.
  2. Plasmidisolierung mit Midi-Plasmid-Reinigungskit
    1. Resuspend Bakterienpellet in 4 ml Resuspensionspuffer.
    2. Fügen Sie 4 ml Lysepuffer hinzu und mischen Sie gründlich, indem Sie 4-6 mal kräftig invertieren und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren.
    3. Fügen Sie 4 ml vorgekühlten Neutralisationspuffer hinzu und invertieren Sie das Röhrchen 4-6 Mal, um es gründlich zu mischen. 15 Min. auf Eis inkubieren.
    4. Zentrifuge bei ≥20.000 x g für 30 min bei 4 °C. Überstand in einem frischen Röhrchen auffangen und bei ≥20.000 x g für 15 min bei 4 °C erneut zentrifugieren.
    5. Richten Sie die Säule aus, indem Sie 4 ml Äquilibrierungspuffer auftragen.
    6. Wenden Sie den Überstand auf die Spalte an.
    7. Waschen Sie die Säule zweimal mit 10 ml Waschpuffer.
    8. Elute DNA mit 5 ml warmem (65 °C) Elutionspuffer.
    9. Niederschlag der DNA durch Zugabe von 3,5 ml Isopropanol zur eluierten DNA. Gut mischen. Zentrifuge bei ≥15.000 x g für 30 min bei 4 °C. Überstand vorsichtig dekantieren.
    10. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 2 ml 70% Ethanol und zentrifugieren Sie es bei ≥15.000 x g für 10 min. Überstand vorsichtig dekantieren.
    11. Pellet für 5-10 min an der Luft trocknen und DNA in einem geeigneten Volumen von PCR-Wasser lösen, um eine Endkonzentration von 1 μg/ml zu erhalten.
      HINWEIS: Lösen Sie DNA nicht in Puffern auf, da sie nicht für die Elektroporation geeignet ist. Alte Plasmid-DNA-Präparate ergeben keine reprogrammierten Kolonien.
  3. Plasmidverifikation durch EcoRI Restriktionsaufschluss
    1. Kombinieren Sie 15 μL nukleasefreies Wasser, 2 μL 10x Puffer, 1 μg Plasmid-DNA und 1 μL EcoRI-Enzym. Vorsichtig mischen.
    2. Die Mischung bei 37 °C für 15 min in einem Hitzeblock inkubieren.
    3. Mischen Sie die verdauten Plasmidproben mit 6x DNA-Gelbeladungsfarbstoff und Elektrophorrese auf 1% Agarosegel in 1x TAE-Puffer mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid. Fügen Sie eine Standard-DNA-Leiter hinzu. Stellen Sie sich das Gel vor, nachdem sich die DNA entsprechend aufgelöst hat. Erwartete EcoRI-Bandgrößen von pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F sind 6.834 bp, 3.758 bp und 1.108 bp; pCXLE-hUL sind 10.200 bp und 1.900 bp; pCXLE-hSK sind 10.200 bp und 2.500 bp.

3. Nukleofektion

  1. Zellpelletierung
    1. Kultur der isolierten fetalen Chorionzotten Fibroblasten in T25-Kolben in 5 ml vollständigem Medium bis zu 80-90% Konfluenz.
    2. Zellen zweimal mit PBS waschen und trypsinisieren, wie in den Schritten 1.2.2.1 - 1.2.2.3 beschrieben.
    3. Entfernen Sie den Überstand, resuspend Pellet in 5 ml reduziertem Serummedium (z. B. Opti-MEM). Zählen Sie Zellen mit Hämozytometer und nehmen Sie 106 Zellen für die Nukleofektion. Zentrifuge bei 225 x g für 5 min. Überstand vollständig entfernen.
  2. Reagenzienpräparation und Nukleofektion
    1. Herstellung des Nukleofektorreagenzes durch Mischen von 0,5 ml Ergänzung und 2,25 ml Nukleofectorlösung (beide im Kit enthalten).
    2. Fügen Sie 100 μL Nukleofectorlösung in einem 1,5 ml Röhrchen hinzu. Fügen Sie jeweils 1μg pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK und pCXLE-hUL in das Röhrchen hinzu. Resuspendieren Sie vorsichtig 106 Zellen (aus Schritt 3.1.2) in dieser Mischung.
    3. Übertragen Sie die Zell-DNA-Suspension in die Küvette und stellen Sie sicher, dass die Probe den Boden der Küvette (im Kit enthalten) ohne Luftblasen bedeckt. Die Küvette verschließen und in die Halterung einsetzen. Wählen Sie das Nukleofector-Programm U-23 (für hohe Effizienz) und bewerben Sie sich.
    4. Entfernen Sie die Küvette aus der Halterung und fügen Sie 1 ml komplettes Medium hinzu. Den Inhalt schonend in eine mit 60 mm Gewebekultur behandelte Petrischale geben, die mit 4 mL kompletten Medien (auf insgesamt 5 mL Medien) gefüllt ist. Inkubieren Sie die Zellen ineinem befeuchteten CO2-Inkubator bei 37 °C.
    5. Überprüfen Sie nach 24 h, ob sich die Zellen angeschlossen haben. Ersetzen Sie das Medium vollständig.
      HINWEIS: Die Zelltodrate ist in der Nukleofektion hoch und hinterlässt nur wenige lebensfähige Zellen, die sich anheften.
    6. Halten Sie die Zellen für 10 Tage in einem vollständigen Medium und wechseln Sie für die nächsten 20 Tage zu Pluripotenzmedien.
      HINWEIS: Visualisieren Sie Zellen regelmäßig, um morphologische Veränderungen in den reprogrammierenden Zellen (wie Epithelmorphologie und kompakte Koloniebildung) zu verfolgen, um zu bestätigen, ob das Experiment funktioniert. Rund 25 iPSC-Kolonien sind nach 20 Tagen Kultur in Pluripotenzmedien zu sehen.

4. Pflücken und Vermehren von iPSC-Kolonien

  1. Pflücken der Kolonie aus der Reprogrammierplatte
    1. Sezieren Sie die embryonalen stammzellähnlichen Kolonien, die in der Umprogrammierschale gebildet wurden, manuell mit gezogenen Glaspipetten oder 1 ml Spritzennadeln und übertragen Sie sie mit inaktivierten embryonalen Maus-Fibroblasten-Feedern mit Pluripotenzmedium auf eine zuvor vorbereitete Platte oder legen Sie feederfreie Kulturen auf Matrigel-beschichteten Platten mit mTESR-Medium fest.
      ANMERKUNG: Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus wurden durch enzymatische Isolierung aus Mausembryonen (seziert von 13-14 Tagen schwangeren weiblichen Mäusen) gewonnen und durch Mitomycin C-Behandlung mitotisch inaktiviert. Etablieren Sie einzelne Klonpopulationen, indem Sie einzelne Kolonien aus der Umprogrammierung von Tellern in separaten Schalen oder gemischten Klonpopulationen züchten, indem Sie viele Kolonien von der Reprogrammierungsplatte auf eine einzige Schüssel übertragen.
  2. Mechanische Übertragung von entstehenden Kolonien auf frische Feeder und Passaging zur Etablierung stabiler iPS-Zellen
    1. Vermehren Sie iPS-Zellen in Pluripotenzmedium, indem Sie jeden zweiten Tag füttern und alle 5-7 Tage 1: 3 teilen. Bereiten Sie die Bestände vor, indem Sie in einer Gefriermischung aus KnockOut Serum Replacement und DMSO im Verhältnis 9: 1 kryovorservieren.
      HINWEIS: KnockOut Serum Replacement wird in der Gefriermischung zur Kryokonservierung von iPS-Zellen anstelle von FBS verwendet, da Komponenten im FBS während der Langzeitkonservierung eine Differenzierung der pluripotenten Zellen induzieren könnten.

5. Charakterisierung von iPS-Zellen

HINWEIS: Charakterisierungsstudien einschließlich PCR und Immunfärbung für Pluripotenz-Biomarker wurden nach der fünften Passagenzahl durchgeführt. Die Karyotypisierung wurde bei einer späteren Passage durchgeführt.

  1. Karyotypisierung
    1. Behandeln Sie eine konfluente 60 mm Petrischale aus iPS-Zellen mit Colcemid für 45 min im befeuchteten CO2 -Inkubator bei 37 °C.
    2. Ernte durch 0,05% Trypsin-Behandlung und Zentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und pipettieren Sie die übrig gebliebenen Mediumspuren, um das Zellpellet zu lösen.
    3. Fügen Sie 5 ml hypotonische Lösung hinzu. Mit invertierendem Röhrchen mischen und 20 Minuten bei 37 °C inkubieren. Zentrifuge bei 225 x g für 5 min.
      HINWEIS: Das erhaltene Pellet sollte flauschig erscheinen.
    4. Fügen Sie 2,5 ml Carnoys Fixierlösung langsam hinzu, während Sie klopfen, um das Pellet zu lösen.
    5. Bereiten Sie die Aufstriche für die Karyotypisierung vor, indem Sie die Zellsuspension auf saubere Glasobjektträger fallen lassen.
    6. Behandeln Sie die Objektträger 1 Minute lang mit 0,15% Trypsin und waschen Sie sie einmal mit PBS. Dann mit Giemsa-Lösung für 4 min färben und mit einer destillierten Wasserwäsche beenden. Akquise und Verarbeitung mit entsprechender Software.
  2. Demonstration des transgenen freien Status
    1. Genomische DNA-Isolierung
      1. 20 μL Protease in den Boden eines 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchens pipettieren.
      2. Geben Sie 200 μL TSiPS-Zellen, die in PBS resuspendiert sind, in das Mikrozentrifugenröhrchen.
      3. 200 μL Buffer AL in die Probe geben und für 15 s durch Pulswirbeln mischen.
      4. 10 min bei 56 °C inkubieren.
      5. Zentrifugieren Sie kurz das Mikrozentrifugenröhrchen, um Tropfen von der Innenseite des Deckels zu entfernen.
      6. 200 μL Ethanol (96-100%) in die Probe geben und erneut für 15 s durch Pulswirbeln mischen. Nach dem Mischen das Röhrchen kurz zentrifugieren, um Tropfen von der Innenseite des Deckels zu entfernen.
      7. Tragen Sie die Mischung aus dem vorherigen Schritt vorsichtig auf die Mini-Spin-Säule (in einem 2-ml-Auffangrohr) auf, ohne den Rand zu benetzen. Schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie bei 6000 x g für 1 min. Entsorgen Sie das Röhrchen, das das Filtrat enthält, und legen Sie die Mini-Spin-Säule in ein sauberes 2 ml Auffangrohr.
      8. Öffnen Sie vorsichtig die Mini-Spin-Säule und fügen Sie ohne Benetzung der Felge 500 μL Buffer AW1 hinzu. Verschließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie sie bei 6000 x g für 1 min. Legen Sie die Mini-Spin-Säule in ein sauberes 2 ml Auffangrohr und entsorgen Sie das Auffangrohr, das das Filtrat enthält.
      9. Öffnen Sie vorsichtig die Mini-Spin-Säule und fügen Sie 500 μL Buffer AW2 hinzu, ohne die Felge zu benetzen. Verschließen Sie die Kappe und die Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit (20.000 x g) für 3 min.
      10. Legen Sie die Mini-Spin-Säule in ein neues 2-ml-Auffangrohr und entsorgen Sie das alte Auffangrohr mit dem Filtrat. Zentrifugieren Sie mit voller Geschwindigkeit für 1 min, um die Möglichkeit eines möglichen Buffer AW2-Übertrags zu eliminieren.
      11. Legen Sie die Mini-Spin-Säule in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Auffangröhrchen, das das Filtrat enthält. Öffnen Sie vorsichtig die Mini-Spin-Säule und fügen Sie 200 μL Buffer AE oder destilliertes Wasser hinzu. Bei Raumtemperatur (15-25 °C) für 5 min inkubieren und dann bei 6000 x g für 1 min zentrifugieren.
    2. Transgenfreie Status-PCR (mit KAPA HiFi PCR Kit KR0368)
      1. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien ordnungsgemäß aufgetaut und gemischt sind.
      2. Bereiten Sie eine PCR-Mastermischung vor, die das entsprechende Volumen aller Reaktionskomponenten enthält, basierend auf Tabelle 2 (Reaktionen auf Eis einrichten).
      3. Übertragen Sie die entsprechenden Volumina von PCR-Master-Mix, Template und Primer auf einzelne PCR-Röhrchen.
      4. Einzelne Reaktionen abschließen, mischen und kurz zentrifugieren.
      5. Führen Sie eine PCR gemäß Tabelle 3 durch.
  3. Identifizierung von Pluripotenz-Biomarkern
    1. Färbung der alkalischen Phosphatase (AP)
      1. Bereiten Sie eine 1x AP-Live-Färbe-Arbeitslösung vor, indem Sie 3 μL 500x Stammlösung in 1,5 mL DMEM/F-12 pro 10cm2 Kulturfläche verdünnen.
      2. Entfernen Sie das Medium aus der iPSC-Kulturschale. Waschen Sie die Kultur einmal mit DMEM/F-12. Geben Sie die 1x AP-Lebendflecklösung auf die iPSCs. Bei 37 °C für 45 min inkubieren.
      3. Entfernen Sie den AP-Fleck und waschen Sie ihn zweimal mit DMEM/F-12. Fügen Sie frisches DMEM / F-12 hinzu und nehmen Sie es unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einem Standard-FITC-Filter innerhalb von 30-90 Minuten nach der Färbung auf.
    2. Immunostaining für Pluripotenz-Biomarker
      1. Konfluente iPSC-Kulturen mit 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 °C fixieren. Dreimal mit PBS Tween 20 (PBST) waschen, jeweils 5 min waschen.
      2. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,3% Triton X-100 in PBST für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dreimal mit PBST waschen.
        HINWEIS: Die Permeabilisierung sollte nur für intrazelluläre Antigene durchgeführt werden.
      3. Blockzellen mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) in PBST für 30 min bei Raumtemperatur. Färben Sie die Zellen über Nacht mit primären Antikörpern (verdünnt 1:1000 in 1% BSA). Nach der primären Antikörperinkubation dreimal mit PBST waschen.
      4. Inkubieren Sie Zellen mit dem sekundären Antikörper (verdünnt 1:1000 in 1% BSA) für 5 h bei Raumtemperatur. Dreimal mit PBST waschen.
      5. Markieren Sie die Kerne mit 0,5 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 1 Minute. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBST.
      6. Erfassen Sie Bilder unter dem Fluoreszenzmikroskop.

6.In-vitro-Differenzierungstests

  1. Embryoide Körper (EB) Differenzierung
    1. Die iPSC-Kolonien in kleine Stücke schneiden, sammeln und in Petrischalen mit niedrigem Aufsatz im embryoiden Körpermedium aufzeichnen. Züchten Sie die Zellen für 15 Tage, indem Sie das Medium alle 3 Tage ersetzen.
      HINWEIS: Die Tag-15-EBs können direkt für den Nachweis der drei Keimschicht-Biomarker verwendet werden. Alternativ können spezifische Zelllinien mit Wachstumsfaktoren induziert werden, gefolgt von einem Biomarker-Nachweis.
  2. Endoderm (Hepatozyten) Differenzierung
    1. Züchten Sie die iPS-Zellen in Monolayer-Kulturen in Pluripotenzmedium.
    2. Nach dem Konfluent wechseln Sie für 2 Tage zu RPMI 1640-Medien mit 1x Insulin Transferrin Selenite und 100 ng / ml Aktivin A, gefolgt von einem Wachstum der RPMI 1640-Medien mit 30 ng / ml bFGF und 20 ng / ml BMP4 für 9 Tage. Ersetzen Sie medium alle 2 Tage.
    3. Ab Tag 10 ergänzen Medien mit 0,1 μM Dexamethason. Beenden Sie das Experiment am 20. Tag.
  3. Mesoderm (Kardiomyozyten) Differenzierung
    1. Platte Tag 8 EBs auf 0,5% Matrigel-beschichteten Platten in embryoidem Körpermedium. Lassen Sie die EBs anfügen und reduzieren.
    2. Ergänzen Sie Medien mit 20 ng / ml BMP4 und wachsen Sie für 20 Tage. Ersetzen Sie das Medium alle 2-3 Tage. Beenden Sie das Experiment am 20. Tag.
  4. Ektoderm (neuronale) Differenzierung
    1. Platte Tag 4 EBs auf 2 μg/cm2 Kollagen Typ IV-beschichteten Platten in embryoidem Körpermedium. Lassen Sie die EBs anfügen und reduzieren.
    2. Wechseln Sie am nächsten Tag zu DMEM F-12 mit 2 mg / ml Glukose, 1x Insulin Transferrin Selenit und 2,5 μg / ml Fibronektin. Beenden Sie den Test an Tag 15.
  5. Bildung von zerebralen Organoiden
    1. Züchten Sie TSiPS-Zellen in einer 35-mm-Gewebekulturschale auf MEFs bis zu 70-80% konfluent. Schneiden Sie die Kolonien ab und sammeln Sie sie in einer 15 ml Röhre. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 225 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand.
    2. Waschen Sie die Koloniestücke, indem Sie sie in 2 ml PBS wiederverwenden und zentrifugieren, um den Überstand zu entfernen.
    3. Fügen Sie 1 ml 0,05% Trypsin hinzu und klopfen Sie auf die Röhre, um die Zellen zu entfernen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 3-4 min, um die Koloniestücke in eine einzelne Zellsuspension zu dissoziieren.
    4. Neutralisieren Sie das Trypsin durch Verdünnung mit 4 ml Pluripotenzmedien, die 10 μg/ml Rho-assoziierte Proteinkinase (ROCK) -Inhibitor Y-27632 Dihydrochlorid (ROCKi) enthalten, um den dissoziationsinduzierten Zelltod zu verhindern.
    5. Zentrifuge, um ein Pellet zu erhalten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml embryoidem Körpermedium, das 10 μg / ml ROCKi enthält.
    6. Entfernen Sie 10 μL Zellsuspension für die Zellzählung. Fügen Sie 10 μL Trypanblau hinzu, um abgestorbene Zellen zu erkennen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
    7. Fügen Sie der Zellsuspension ein geeignetes Volumen des embryoiden Körpermediums mit ROCKi hinzu, um 9.000 lebende Zellen pro 150 μL zu erhalten.
    8. Platte 150 μL in jeder Vertiefung einer Low-Attachment 96-Well-Platte und inkubieren in einem befeuchteten CO2-Inkubator bei 37 °C. Überprüfen Sie die Platten nach 24 Stunden auf Aggregation. Am Tag 2 das Medium vorsichtig entfernen und durch frisches embryoides Medium ohne ROCKi ersetzen.
    9. Übertragen Sie am Tag 6 EBs auf Vertiefungen mit einer niedrigen Attachment 24 Well Plate, die 500 μL neuronales Induktionsmedium enthält, bestehend aus DMEM-F12 mit 1% N2-Ergänzung, 2 mM GlutaMAX-Ergänzung und 1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 μg / ml Heparin. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
    10. Nach 5 Tagen in neuronales Induktionsmedium die neuroepithelialen Aggregate in Matrigel einbetten, indem ein 2 cm x 2 cm großes Quadrat Parafilm über eine leere Spitzenschale mit 200 μL-Spitzen geschichtet wird. Drücken Sie parafilm mit behandschuhten Fingern über jedes Loch in der Spitzenschale, um kleine Dellen zu machen. Reinigen Sie parafilm mit 70% Ethanol zum Sterilisieren.
    11. Übertragen Sie das Parafilmquadrat in eine 60-mm-Schale. Verwenden Sie geschnittene 200 μL-Spitzen, um die neuroepithelialen Aggregate auf die Dellen im Parafilm zu übertragen. Entfernen Sie überschüssiges Medium durch Pipettieren.
    12. 30 μL aufgetautes Matrigel auf die neuroepithlialen Aggregate geben und das Aggregat mit einer Pipettenspitze in der Mitte des Matrigels positionieren. Stellen Sie die 60-mm-Schale für 20-30 min in einen 37 °C-Inkubator, damit das Matrigel polymerisieren kann.
    13. Fügen Sie 5 ml zerebrales Organoid-Differenzierungsmedium hinzu, bestehend aus 1:1 DMEM-F12: Neurobasales Medium, 0,5% N2-Präparat, 2,5 μg/ml Insulin, 2 mM GlutaMAX-Präparat, 0,5 mM NEAA, 1% B27-Präparat und 2,5 ml Penicillin-Streptomycin.
    14. Drehen Sie mit einer sterilen Pinzette die Parafilmfolie um und rühren Sie die Schale, bis die in Matrigel eingebetteten Aggregate von der Folie in das Medium fallen. Züchten Sie die eingebetteten Aggregate in einem befeuchteten CO2 -Inkubator bei 37 ° C für 4 Tage und geben Sie an wechselnden Tagen Medienwechsel.
    15. Nach 4 Tagen statischer Kultur legen Sie die 60-mm-Schalen auf einen orbitalen Shaker, der im Inkubator installiert ist und mit 50 U / min schüttelt. Kultivieren Sie die Organoide für 3 Monate und geben Sie alle 3 Tage vollständige Medienveränderungen mit zerebralem Organoid-Differenzierungsmedium.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Generierung von integrationsfreien iPS-Zellen aus einem spontan abgetriebenen Fötus mit 45XO-Karyotyp
Wir isolierten Fibroblasten aus FCV mit einem Turner-Syndrom (TS)-spezifischen 45XO-Karyotyp und nukleofizierten sie mit episomalen Reprogrammierungsplasmiden, um TSiPS-Zellen zu erzeugen, die für die nachgeschaltete Modellierung des Syndroms, insbesondere der damit verbundenen neurologischen Defizite, verwendet werden können (Abbildung 1a& b). Für di...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die Erzeugung stabiler zellulärer Modelle zytogenetisch abnormalen fetalen Gewebes ist notwendig, um einen defekten Phänotyp aufrechtzuerhalten. Der iPSC-Weg ist die effektivste Methode der Zellvorbereitung zur ständigen Erhaltung defekter Eigenschaften20.

Pluripotente Stammzellen (PSC) zeigen Eigenschaften der Selbsterneuerung und Differenzierung in spezialisierte Zellen, die an frühe Spaltungsembryonen erinnern21. Daher können PSCs als hervorra...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Finanzielle Unterstützung für die oben genannte Forschung wurde von der Manipal Academy of Higher Education bereitgestellt. Die Charakterisierung der Linie wurde teilweise im Labor von M.M. Panicker am NCBS durchgeführt. Wir danken Anand Diagnostic Laboratory für die Unterstützung bei der Karyotypisierung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,15 % TrypsinThermo Fisher Scientific27250018G Banding
2-MercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023Pluripotenz und Embryoid Körpermedium
4', 6 Diamidino-2-phenylindolSigma AldrichD8417Immunzytochemie
Activin ASigma AldrichSRP3003Differenzierungsassays
Alkalische Phosphatase LebendfärbungThermo Fisher ScientificA14353AP Färbung
AMAXA Nucleofector II
AmnioMAX II KomplettmediumThermo Fisher Scientific, Gibco11269016Medium spezifisch für fetale Chorionzotten-Zellkulturen
AmpicillinHiMediaTC021Plasmidaufreinigung
Anti Maus IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11059Immunzytochemie
Anti Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11034Immunzytochemie
Anti Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 546InvitrogenA11035Immunzytochemie
Antibiotikum-AntimykotikumThermo Fisher Scientific, Gibco15240096Kontaminationskontrolle
Anti-E-CadherinBD Biosciences610181Immunzytochemie
Anti-NanogBD Biosciences560109Immunzytochemie
Anti-OCT3/4BD Biowissenschaften611202Immunzytochemie
Anti-SOX17BD Biosciences561590Immunzytochemie
Anti-SOX2BD Biosciences561469Immunzytochemie
Anti-SSEA4BD Biowissenschaften560073Immunzytochemie
Anti-TRA 1-81MilliporeMAB4381Immunzytochemie
basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor[FGF2]Sigma AldrichF0291Pluripotenzmittel
Knochenmorphogenetischer Faktor 4Sigma AldrichSRP3016Differenzierungsassays
Rinder SerumalbuminSigma AldrichA3059Blockierung
Kollagen Mensch Typ IVBD Biosciences354245Differenzierungsassays
KollagenasemischungSigma AldrichC8051Verdau von fetalen Chorionzotten
DexamethasonSigma AldrichD4902Differenzierungsassays
DMEM F12Thermo Fisher Scientific11320033Differenzierungsassays
FastDigest EcoR1Thermo ScientificFD0274Restriktionsaufschluss
FibronektinSigma AldrichF2518Differenzierungsassays
Giemsa StainHiMediaS011G Banding
EisessigHiMediaAS001Fixiermittel für die Karyotypisierung
GlucoseSigma AldrichG7528Differenzierungsassays
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Pluripotenz und Embryoid Körpermedium
HeparinnatriumSigma AldrichH3149Differenzierungsassays
Insulinlösung humanSigma AldrichI9278Differenzierungsassays
Insulintransferrin SelenitSigma AldrichI1884Differenzierungsassays
KAPA HiFi PCR KitKapa BiosystemsKR0368OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX ColcemidThermo Fisher Scientific15210040Mitotic Arrest für die Karyotypisierung
KnockOut DMEMThermo Fisher Scientific10829018Pluripotenz und Embryoid Körpermedium
KnockOut Serum ErsatzThermo Fisher Scientific10828028Pluripotenz und Embryoid Körpermedium
Luria BertaniAgar HiMediaM1151FPlasmidreinigung
MatrigelBD Biosciences356234Differenzierungsassays
MEM Nichtessentielle AminosäurenThermo Fisher Scientific11140035Pluripotenz und Embryoid Körpermedium
MethanolHiMediaMB113Fixiermittel für die Karyotypisierung
Myosin-Ventrikuläre Schwerkette α/βMilliporeMAB1552Immunzytochemie
NHDF Nukleofektor-KitLonzaVAPD-1001Nukleofektion
Paraformaldehyd (PFA)Sigma AldrichP6148Fixierung von Zellen
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-FAddgen27077Episomale Reprogrammierung Plasmid
pCXLE-hSKAddgene27078Episomale Reprogrammierung Plasmid
pCXLE-hULAddgene27080Episomale Reprogrammierung Plasmid
Penicillin Streptomycin Thermo Fisher Scientific,  15070063Pluripotenz und Embryoid Körpermedium
Phalloidin- Tetramethylrhodamin B IsothiocyanatSigma AldrichP1951Immunzytochemie
Phosphat gepufferte KochsalzlösungSigma AldrichP44171 X PBS 1 Tablette PBS gelöst in 200 ml entionisiertem Wasser und sterilisiert durch Autoklavieren
Lagerung: Raumtemperatur.
PBST- 0,05% Tween 20 in 1X PBS.
Lagerung: Raumtemperatur.
Plasmid-Aufreinigungs-Kit - Midi-VorbereitungQIAGEN12143Plasmid-Aufreinigung
Kaliumchlorid-LösungHiMediaMB043Hypotonische Lösung für die Karyotypisierung
QIAamp DNA-Blut-KitQiagen51104Genomische DNA-Isolierung
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875093Hepatozyten-Differenzierungsmedium
NatriumcitratHiMediaRM255Hypotone Lösung zur Karyotypisierung
Triton X-100HiMediaMB031Permeabilisierung
Trypsin-EDTA (0,05%)Thermo Fisher Scientific, Gibco25300054Subkultur von   fötale Chorionzotten-Fibroblasten
Tween 20HiMediaMB067Präparation von PBST
β III TubulinSigma AldrichT8578Immunzytochemie
Y-27632 DihydrochloridSigma AldrichY0503Differenzierungsassays
Lonza-Nucleofection von

Referenzen

  1. Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
  2. Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
  3. Biancotti, J. -C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
  4. Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
  5. Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
  6. Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022(2015).
  7. Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
  8. Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
  9. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  10. Soldner, F., et al. Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
  11. Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
  12. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  13. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  14. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
  15. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  16. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  17. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
  20. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  21. Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Chromosomale AneuploidieiPSC-Generierungepisomale ReprogrammierungFibroblastenisolierungPluripotenzmarkerEmbryoid-Body-BildungKeimblattdifferenzierungneurokognitive Defizite
Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen aus dem Turner-Syndrom (45XO) fetaler Zellen zur nachgelagerten Modellierung neurologischer Defizite im Zusammenhang mit dem Syndrom
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.