Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen aus dem Turner-Syndrom (45XO) fetaler Zellen zur nachgelagerten Modellierung neurologischer Defizite im Zusammenhang mit dem Syndrom

Nivedha Veerasubramanian; Vaishnavi Karthikeyan; Sridevi Hegde; Anandh Dhanushkodi; Shagufta Parveen

doi:10.3791/62240

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Methodenartikel

Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen aus dem Turner-Syndrom (45XO) fetaler Zellen zur nachgelagerten Modellierung neurologischer Defizite im Zusammenhang mit dem Syndrom

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DOI:

10.3791/62240

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4. Dezember 2021

Nivedha Veerasubramanian^*¹ , Vaishnavi Karthikeyan^*¹ , Sridevi Hegde² , Anandh Dhanushkodi¹ , Shagufta Parveen¹

¹Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, ²Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von integrationsfreien iPS-Zellen aus fetalen Gewebefibroblasten durch Abgabe episomaler Plasmide durch Nukleofektion, gefolgt von der Beschreibung von Methoden zur iPSC-Charakterisierung und neuronalen Differenzierung.

Zusammenfassung

Chromosomale Aneuploidien verursachen schwere angeborene Fehlbildungen, einschließlich Fehlbildungen des zentralen Nervensystems und fetalem Tod. Das pränatale genetische Screening ist rein diagnostisch und klärt den Krankheitsmechanismus nicht auf. Obwohl Zellen von aneuploiden Föten wertvolles biologisches Material sind, das die chromosomale Aneuploidie trägt, sind diese Zellen kurzlebig, was ihre Verwendung für nachgelagerte Forschungsexperimente einschränkt. Die Generierung von modellen für induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) ist eine effektive Methode der Zellvorbereitung zur ständigen Erhaltung aneuploider Merkmale. Sie erneuern sich selbst und differenzieren sich zu spezialisierten Zellen, die an die Embryonalentwicklung erinnern. Daher dienen iPS-Zellen als hervorragende Werkzeuge, um frühe Entwicklungsereignisse zu untersuchen. Das Turner-Syndrom (TS) ist eine seltene Erkrankung, die mit einem ganz oder teilweise fehlenden X-Chromosom einhergeht. Das Syndrom ist gekennzeichnet durch Unfruchtbarkeit, Kleinwuchs, endokrine, metabolische, autoimmune und kardiovaskuläre Störungen und neurokognitive Defekte. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von Fibroblasten aus TS (45XO) fetalem Gewebe, die Erzeugung von integrationsfreien TSiPS-Zellen durch Abgabe von episomalen Reprogrammierungsplasmiden durch Nukleofektion mit anschließender Charakterisierung. Die reprogrammierenden TSiPS-Zellen wurden zunächst durch lebendzellige alkalische Phosphatase-Färbung gescreent, gefolgt von umfangreichen Untersuchungen nach Pluripotenz-Biomarkern. Ausgewählte Kolonien wurden mechanisch seziert, mehrmals durchquert und stabile, sich selbst erneuernde Zellen für weitere Experimente verwendet. Die Zellen exprimierten Pluripotenz-Transkriptionsfaktoren OCT4, NANOG, SOX2, Zelloberflächenmarker SSEA 4 und TRA1-81, die typisch für pluripotente Stammzellen sind. Der ursprüngliche 45XO-Karyotyp wurde nach der Neuprogrammierung beibehalten. Die TSiPS-Zellen waren in der Lage, embryoide Körper zu bilden und sich in Zellen von Endoderm, Mesoderm und Ektoderm zu differenzieren, die linienspezifische Biomarker exprimieren ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Die exogenen episomalen Plasmide gingen spontan verloren und wurden nach Passage 15 in Zellen nicht nachgewiesen. Diese TSiPS-Zellen sind eine wertvolle zelluläre Ressource für die Modellierung defekter molekularer und zellulärer Neuroentwicklung, die neurokognitive Defizite im Zusammenhang mit dem Turner-Syndrom verursachen.

Einleitung

Aneuploidien führen beim Menschen zu Geburtsfehlern/angeborenen Fehlbildungen und Schwangerschaftsverlust. ~ 50% -70% der Proben aus Schwangerschaftsverlusten zeigen zytogenetische Anomalien. Aneuploide Embryonen, die früh in der Schwangerschaft verloren gehen, können nicht einfach für experimentelle Analysen gewonnen werden, was die Notwendigkeit erhöht, andere Modelle zu entwickeln, die die menschliche Embryogenese genau repräsentieren. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), die aus Zellen gewonnen wurden, bei denen genetische Störungen diagnostiziert wurden, wurden verwendet, um die repräsentativen genetischen Unregelmäßigkeiten und ihre Folgen für die f....