Bewertung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mit FRET-sensibilisierter Emission

Zusammenfassung

Der Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei Fluorophor-Molekülen kann zur Untersuchung von Proteininteraktionen in der lebenden Zelle verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, wie FRET in lebenden Zellen gemessen werden kann, indem die sensibilisierte Emission des Akzeptors und das Abschrecken des Donormoleküls mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie detektiert werden.

Zusammenfassung

Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist die strahlungslose Übertragung von Energie von einem angeregten Donor auf ein Akzeptormolekül und hängt vom Abstand und der Ausrichtung der Moleküle sowie dem Ausmaß der Überlappung zwischen den Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsspektren ab. FRET ermöglicht es, die Interaktion von Proteinen in der lebenden Zelle im Laufe der Zeit und in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu untersuchen. In der Literatur wurden verschiedene intensitätsbasierte Algorithmen zur Messung von FRET mittels Mikroskopie beschrieben. Hier werden ein Protokoll und ein Algorithmus zur Quantifizierung der FRET-Effizienz bereitgestellt, die sowohl auf der Messung der sensibilisierten Emission des Akzeptors als auch der Abschreckung des Donormoleküls basieren. Die Quantifizierung der ratiometrischen FRET in der lebenden Zelle erfordert nicht nur die Bestimmung des Übersprechens (spektraler Spillover oder Bleed-Through) der fluoreszierenden Proteine, sondern auch die Detektionseffizienz des mikroskopischen Aufbaus. Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt, wie diese kritischen Parameter zu bewerten sind.

Einleitung

Die mikroskopische Analyse des Förster-Resonanz-Energietransfers (FRET) ermöglicht die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Proteinen in lebenden Zellen. Es liefert räumliche und zeitliche Informationen, einschließlich Informationen darüber, wo in der Zelle und in welchem subzellulären Kompartiment die Interaktion stattfindet und ob sich diese Interaktion im Laufe der Zeit ändert.

Theodor Förster legte 1948 die theoretischen Grundlagen der FRET¹. FRET ist eine strahlungslose Energieübertragung von einem angeregten Donor zu einem Akzeptormolekül und hängt vom Abstand der Moleküle und der relativen Orientierung ih....

Protokoll

1. Plasmid-Konstruktion

1. Verwenden Sie zur Erzeugung der eGFP-mCherry1-Fusionssonde einen N1-Säugetierzellexpressionsvektor (siehe Materialtabelle) mit mCherry1¹⁰, der unter Verwendung der Restriktionsstellen AgeI und BsrGI eingefügt wird.
2. Verwenden Sie die folgenden Oligonukleotide, um eGFP¹¹ ohne Stoppcodon als SalI-BamHI-Fragment zu amplifizieren: N-terminaler Primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' und C-terminaler Primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
3. Setzen Sie dieses SalI-BamHI-Fragment in di....

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Bilder, die im Donorkanal, Kanal 1 (488, 505-530 nm), im Übertragungskanal Kanal 2 (488, >585 nm) bzw. im Akzeptorkanal, Kanal 3 (561, >585 nm), erhalten wurden. Repräsentative Bilder von Zellen, die nur GFP exprimieren, nur Kirsche exprimieren, GFP und Kirsche co-exprimieren und das GFP-Kirsch-Fusionsprotein exprimieren. Die mittleren zellulären FRET-Wirkungsgrade, die in NRK-Zellen berechnet wurden, die GFP-Cherry-Fusionsprotein .......

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung der genetisch gekoppelten Eins-zu-Eins-Fluoreszenzprotein-Kalibrierungssonde zur Quantifizierung von FRET unter Verwendung des Nachweises der sensibilisierten Emission des Akzeptors und des Quenchings des Donormoleküls durch konfokale Mikroskopie. Diese Methode kann angewendet werden, um Proteininteraktionen im physiologischen Kontext der lebenden Zelle in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu bewerten. Die räumliche Auflösung kann weiter verbessert werden, ind.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5% Trypsin-EDTA ohne Phenolrot (10x)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Clontech mCherry N1 Vektor	Addgene	3553
DMEM ohne Phenolrot	Thermo Fisher Scientific	11054020
Fugene 6	Promega	E2691
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080
LabTek 8-Well-Kammern #1.0	Thermo Fisher Scientific	12565470
L-Glutamin (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081