Die Etablierung und Nutzung von patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen der Metastasierung des Zentralnervensystems

Zusammenfassung

Metastasierung des Zentralnervensystems PDX-Modelle repräsentieren die phänotypischen und molekularen Merkmale der humanen Metastasierung und sind damit hervorragende Modelle für präklinische Studien. Hier wird beschrieben, wie PDX-Modelle erstellt werden und welche Inokulationswege am besten für präklinische Studien verwendet werden.

Zusammenfassung

Die Entwicklung neuartiger Therapien für die Metastasierung des Zentralnervensystems (ZNS) wurde durch das Fehlen präklinischer Modelle, die die Krankheit genau abbilden, behindert. Es hat sich gezeigt, dass patientenabgeleitete Xenograft-Modelle (PDX) der ZNS-Metastasierung die phänotypischen und molekularen Merkmale der menschlichen Erkrankung besser repräsentieren und die Heterogenität und klonale Dynamik menschlicher Patiententumore im Vergleich zu historischen Zelllinienmodellen besser widerspiegeln. Es gibt mehrere Stellen, die für die Implantation von patienteneigenem Gewebe verwendet werden können, wenn präklinische Studien eingerichtet werden, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen und jede geeignet, um verschiedene Aspekte der metastasierten Kaskade zu untersuchen. Hier beschreibt das Protokoll, wie PDX-Modelle etabliert werden können, und stellt drei verschiedene Ansätze für die Verwendung von ZNS-Metastasen-PDX-Modellen in präklinischen Studien vor, wobei ihre Anwendungen und Einschränkungen diskutiert werden. Dazu gehören die Flankenimplantation, die orthotope Injektion in das Gehirn und die intrakardiale Injektion. Die subkutane Flankenimplantation ist am einfachsten zu überwachen und daher für präklinische Studien am geeignetsten. Darüber hinaus wurden Metastasen im Gehirn und anderen Geweben durch die Flankenimplantation beobachtet, was darauf hindeutet, dass der Tumor mehrere Metastasierungsschritte durchlaufen hat, einschließlich Intravasation, Extravasation und Kolonisierung. Die orthotope Injektion in das Gehirn ist die beste Option, um die Mikroumgebung des Hirntumors zu rekapitulieren, und ist nützlich, um die Wirksamkeit von Biologika zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu bestimmen, umgeht jedoch die meisten Schritte der metastasierten Kaskade. Die intrakardiale Injektion erleichtert die Metastasierung ins Gehirn und ist auch für die Untersuchung des Organtropismus nützlich. Während diese Methode auf frühere Schritte der metastasierten Kaskade verzichtet, müssen diese Zellen dennoch die Zirkulation überleben, extravasieren und kolonisieren. Die Nützlichkeit eines PDX-Modells wird daher von der Art der Tumorinokulation beeinflusst, und die Wahl des zu verwendenden Modells sollte von der wissenschaftlichen Fragestellung und den allgemeinen Zielen des Experiments diktiert werden.

Einleitung

Die Inzidenz von Metastasen im Zentralnervensystem (ZNS) hat in den letzten Jahren zugenommen ^1,2,3. Traditionelle Therapien für ZNS-Metastasen, wie z. B. Tumorresektion, Ganzhirnstrahlentherapie und stereotaktische Radiochirurgie, sind weitgehend palliativ und selten kurativ und können zu schwächenden Nebenwirkungen wie einer kognitiven Verschlechterung führen¹. In jüngster Zeit werden viele neue zielgerichtete und immunologische Therapien für die Behandlung von ZNS-Metastasen entwickelt, die vielversprechend sind, um wirksamere Behandlungen zu sein und gleichzeitig weniger Nebenwirkungen zu haben⁴.

Die Übersetzung präklinischer Ergebnisse in aussagekräftige klinische Endpunkte erfordert oft effektive und prädiktive Modellierungsstrategien. In der Vergangenheit waren Zelllinien-Xenograft-Modelle der Standard für die präklinische Forschung in der ZNS-Metastasenforschung. Diese Zelllinienmodelle spiegeln jedoch nicht das tatsächliche Tumorverhalten des Wirtstumors wider und repräsentieren auch nicht die histologische oder molekulare Heterogenität der Erkrankung. Darüber hinaus sind Zelllinienmodelle in der Lage, sich an In-vitro-Wachstumsbedingungen anzupassen und verlieren daher die ursprünglichen Eigenschaften des Wirtstumors. Patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDXs), bei denen der Tumor eines Patienten in eine immundefiziente oder humanisierte Maus transplantiert wird, werden zunehmend in der translationalen Krebsforschung eingesetzt. Forscher haben gezeigt, dass PDX-Modelle in der Regel das Tumorwachstum, die histologischen Merkmale, die Aufrechterhaltung der Tumorheterogenität, des Metastasierungspotenzials und der molekulargenetischen Merkmale originalgetreu rekapitulieren können. Darüber hinaus sind PDX-Modelle prognostisch, wobei die PDX-Tumorlatenzzeit mit dem Gesamtüberleben der Patienten korreliert, und sie haben auch in Patientenstudien gezeigt, dass sie das therapeutische Ansprechen genau vorhersagen^{können 5,6}.

Es gab ein Auftreten von ZNS-Metastasen-PDXs, die meist Tumore darstellen, die aus einem einzigen Ursprung stammen, wie z. B. nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC)⁷, Brustkrebs^8,9 und Melanom^10,11. In jüngerer Zeit wurde eine große und vielfältige Sammlung von PDX-Modellen entwickelt und charakterisiert, die acht verschiedene histologische Subtypen repräsentieren¹². Es konnte gezeigt werden, dass PDX-Modelle für ZNS-Metastasen sowohl histologisch als auch molekular ihrem ursprünglichen Patiententumor sehr ähnlich sind und auch histologisch einzigartige Unterschiede und Ähnlichkeiten aufweisen^10,12. Während die meisten PDX-Modelle für ZNS-Metastasen die klonale Heterogenität menschlicher Tumore beibehalten, wiesen einige Hinweise auf klonale Sukzession¹² auf, was sie auch ideal für die Untersuchung von Therapieresistenzen durch die Überwachung klonaler Veränderungen nach der Behandlung macht.

Die hier beschriebenen Protokolle beschreiben Methoden der PDX-Etablierung und verschiedene Inokulationswege, die in präklinischen Studien zur ZNS-Metastasierung verwendet werden (Abbildung 1). Diese Implantationsmethoden unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, Wachstum und Metastasierung nachzuahmen. Hier zeigt das Protokoll die Anwendungen für jeden Implantationsweg auf und zeigt, wie sie für die Untersuchung von ZNS-Metastasen verwendet werden könnten.

Protokoll

Im Folgenden finden Sie eine Reihe von Schritt-für-Schritt-Protokollen, die sowohl für die Etablierung von PDX-Modellen durch subkutane Flankenimplantation als auch für die Einrichtung präklinischer Studien verwendet werden, die das Testen von Behandlungen ermöglichen, die bei der Beurteilung biologischer Veränderungen und verschiedener Schritte der metastasierten Kaskade helfen können. In allen Studien und Modellen wurden 3-8 Wochen alte weibliche NOG-Mäuse verwendet. Alle Gewebeproben wurden nach Aufklärung gemäß einem vom Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokoll entnommen. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit einem vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Protokoll durchgeführt.

1. Etablierung und Verbreitung von PDX-Modellen durch Flankenimplantation

1. Etablierung von PDX-Modellen
   1. Nach der chirurgischen Resektion des Tumors vom Patienten im Operationssaal das frische Tumorgewebe in einer geeigneten Lösung (z.B. DMEM) lagern und sofort auf Eis legen. Verwenden Sie eine überschüssige Aufbewahrungslösung (>10 ml), um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig eingetaucht ist.
   2. Das Gewebe in eine Gewebekulturschale geben und mit 5 ml DPBS ausspülen.
      HINWEIS: Dieser Schritt sollte in einer Biosicherheitswerkbank mit aseptischen Techniken durchgeführt werden. Vorsichtsmaßnahmen sollten durch das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) zum Schutz vor möglichen menschlichen Infektionserregern getroffen werden.
   3. Entfernen Sie nekrotische Regionen aus dem Tumor.
      Anmerkungen: Dies ist als weißer, matschiger Bereich in der Mitte des Gewebes zu erkennen.
   4. Das restliche Gewebe in ca. 2 x 2 x 2 mm große Stücke schneiden.
   5. Übertragen Sie das Gewebe in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das die wachstumsfaktorreduzierte Basalmembranmatrix enthält, und lagern Sie es auf Eis. Stellen Sie sicher, dass eine ausreichende Basalmembranmatrix (>200 μl) verwendet wird, um jedes Gewebestück vollständig einzutauchen.
   6. Kryokonservieren Sie das verbleibende Gewebe, das nicht implantiert wird, gemäß dem in Schritt 1.3 beschriebenen Protokoll.
   7. Betäuben Sie das Tier in einer Induktionskammer mit 2-5% Isofluran und Sauerstoff. Nach der Betäubung wird das Tier in einen Nasenkegel überführt, um die Anästhesie bei 1,5-2,5 % Isofluran mit kontinuierlicher Sauerstoffzufuhr aufrechtzuerhalten. Bestätigen Sie die Anästhesietiefe durch fehlenden Pedalreflex. Tragen Sie die Veterinär-Augensalbe auf, um Augentrockenheit während der Operation zu verhindern. Bieten Sie dem Tier während des gesamten Eingriffs thermische Unterstützung, bis sich das Tier erholt hat.
   8. Identifizieren Sie die Implantationsstelle an der Maus.
      HINWEIS: Dies sollte sich auf der rechten oder linken Flanke der Maus befinden, in der Regel seitlich auf der Seite der Bauchregion, kaudal des Brustkorbs.
   9. Um den Operationsbereich vorzubereiten, rasieren Sie das Fell und desinfizieren Sie es mit drei abwechselnden Peelings aus Povidonjod und 70% Ethanol.
   10. Heben Sie mit einer Pinzette die Haut der Maus an und machen Sie einen 0,5-1 cm großen Schnitt in die Haut.
   11. Führen Sie eine chirurgische Schere an der Einschnittstelle langsam unter die Haut ein, um eine Tasche (0,5-1 cm tief) im Unterhautraum zu schaffen.
   12. Legen Sie vorsichtig ein Tumorstück in die Tasche und schieben Sie es auf den Boden der Tasche, um zu verhindern, dass der Tumor herausrutscht.
   13. Verschließen Sie den Schnitt mit chirurgischen 4-0-Nylonnähten.
       HINWEIS: Es können auch andere Wundverschlussmethoden wie nicht resorbierbare oder resorbierbare Nähte und Wundclips verwendet werden.
   14. Bringen Sie die Maus zurück in den Käfig und beobachten Sie, wie sich das Tier von der Narkose erholt, bis es gehfähig ist.
       HINWEIS: Analgetika sind nicht erforderlich, können aber verabreicht werden, wenn bei den Mäusen Schmerzen beobachtet werden.
   15. Überwachen Sie das Tumorwachstum wöchentlich. Pro Maus wird ein Tumor erwartet.
       HINWEIS: Das Volumen des Tumors bei der Transplantation scheint zunächst abzunehmen, aber dies ist kein Grund zur Sorge. Ein Tumor gilt als entnommen, wenn er tastbar wird und in eine logarithmische Wachstumsphase eintritt. Diese erste Passage stellt die Generation F0 dar.
   16. Sobald die Tumore zu wachsen beginnen, messen Sie die Tumore dreimal pro Woche. Messen Sie die Länge und Breite der Tumore mit einem Messschieber. Um das Volumen des Tumors zu berechnen, verwenden Sie die Formel: Länge x Breite x Breite / 2.
   17. Euthanasieren Sie die Mäuse, denen PDX-Tumore implantiert wurden, wenn die Tumore einen Durchmesser von mehr als 15 mm haben, indem Sie die längste Seite des Tumors verwenden. Führen Sie die Euthanasie durch CO 2 -Inhalation in einer CO₂ -Induktionskammer durch, gefolgt von einer zervikalen Luxation als sekundäre Methode.
   18. Entfernen Sie den Tumor von der Flanke des Tieres, indem Sie einen Schnitt machen. Präparieren Sie den herausgeschnittenen Tumor vorsichtig mit einer stumpfen Schere und einer Pinzette. Schneiden Sie dazu zuerst die Haut auf der Oberseite des Tumors ab und schneiden Sie dann den Tumor von der darunter liegenden Muskelschicht ab.
   19. Übertragen Sie das Tumorgewebe auf >10 ml einer geeigneten Aufbewahrungslösung (z. B. DMEM). Legen Sie es sofort auf Eis. Dieser Tumor kann kryokonserviert oder an eine andere Gruppe von Mäusen weitergegeben werden. Betrachten Sie diese Passage als F1.
       HINWEIS: Eine erneute Passage würde die Tumorpassage F2 und so weiter wiedergeben.
2. Verbreitung von PDX-Modellen
   1. Beginnen Sie mit dem resezierten Tumor, der in der Lagerlösung aus Schritt 1.1.19 aufbewahrt wird.
   2. Übertragen Sie das Gewebe in eine Gewebekulturschale und spülen Sie es mit 5 ml DPBS aus.
   3. Entfernen Sie die nekrotischen Regionen aus dem Tumor.
   4. Schneiden Sie das Gewebe in ca. 2 x 2 x 2 mm große Stücke.
   5. Übertragen Sie das Gewebe in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das eine wachstumsfaktorreduzierte Basalmembranmatrix (>200 μl) enthält, und lagern Sie es auf Eis.
   6. Kryokonservieren Sie das verbleibende Gewebe, das nicht für die Vermehrung verwendet wird, gemäß dem in Schritt 1.3 beschriebenen Protokoll.
   7. Betäuben Sie das Tier in einer Induktionskammer mit 2-5% Isofluran und Sauerstoff. Nach der Betäubung wird das Tier in einen Nasenkegel überführt, um die Anästhesie bei 1,5-2,5 % Isofluran mit kontinuierlicher Sauerstoffzufuhr aufrechtzuerhalten. Bestätigen Sie die Anästhesietiefe durch fehlenden Pedalreflex. Tragen Sie die Veterinär-Augensalbe auf, um Augentrockenheit während der Operation zu verhindern. Bieten Sie dem Tier während des gesamten Eingriffs thermische Unterstützung, bis sich das Tier erholt hat.
   8. Identifizieren Sie die Implantationsstelle an der Maus.
      HINWEIS: Dies sollte sich auf der rechten oder linken Flanke der Maus befinden, in der Regel in der Bauchregion, kaudal zum Brustkorb.
   9. Um den Operationsbereich vorzubereiten, rasieren Sie das Fell und desinfizieren Sie es mit drei abwechselnden Peelings aus Povidonjod und 70% Ethanol.
   10. Machen Sie einen 0,5-1 cm großen Schnitt an einer Flanke der Maus.
   11. Führen Sie eine chirurgische Schere am Schnitt langsam unter die Haut ein, um eine Tasche (0,5-1 cm tief) im Unterhautraum zu schaffen.
   12. Legen Sie vorsichtig ein Tumorstück in die Tasche und schieben Sie es auf den Boden der Tasche, um ein Herausrutschen des Tumors zu verhindern.
   13. Verschließen Sie den Schnitt mit chirurgischen 4-0-Nylonnähten oder anderen Wundverschlussmethoden.
   14. Bringen Sie die Maus zurück in den Käfig und beobachten Sie, wie sie sich von der Narkose erholt, bis sie gehfähig ist.
       HINWEIS: Analgetika sind nicht erforderlich, können aber verabreicht werden, wenn bei den Mäusen Schmerzen beobachtet werden.
   15. Während der Latenz (Nicht-Wachstumsphase) ist das Tumorwachstum wöchentlich zu überwachen. Pro Maus wird ein Tumor erwartet.
       HINWEIS: Das Volumen des Tumors bei der Transplantation scheint zunächst abzunehmen, aber dies ist kein Grund zur Sorge. Ein Tumor gilt als entnommen, wenn er tastbar wird und kontinuierlich zu wachsen beginnt.
   16. Sobald die Tumore zu wachsen beginnen, messen Sie die Tumore dreimal pro Woche. Messen Sie die Länge und Breite der Tumore mit einem Messschieber. Berechnen Sie das Volumen des Tumors mit der Formel: Länge x Breite x Breite / 2.
   17. Euthanasieren Sie die Mäuse, denen PDX-Tumore implantiert wurden, wenn die Tumore einen Durchmesser von mehr als 15 mm haben, indem Sie die längste Seite des Tumors verwenden. Führen Sie Euthanasie durch CO2-Inhalation in einer CO2-Induktionskammer durch, gefolgt von einer zervikalen Luxation als sekundäre Methode.
   18. Entfernen Sie den Tumor von der Flanke des Tieres, indem Sie einen Schnitt machen und den Tumor vorsichtig mit einer stumpfen Schere und Pinzette herauspräparieren.
   19. Übertragen Sie das Tumorgewebe in >10 ml einer geeigneten Aufbewahrungslösung (z. B. DMEM) und legen Sie es sofort auf Eis.
3. Kryokonservierung von PDX-Tumoren
   1. Euthanasieren Sie die Mäuse, denen PDX-Tumore implantiert wurden, wenn die Tumore einen Durchmesser von mehr als 15 mm haben, indem Sie die längste Seite des Tumors verwenden. Führen Sie die Euthanasie durch CO 2 -Inhalation in einer CO₂ -Induktionskammer durch, gefolgt von einer zervikalen Luxation als sekundäre Methode.
   2. Entfernen Sie den Tumor von der Flanke des Tieres, indem Sie einen Schnitt machen und den Tumor vorsichtig mit einer stumpfen Schere und Pinzette herauspräparieren.
   3. Übertragen Sie das Tumorgewebe in >10 ml einer geeigneten Aufbewahrungslösung (z. B. DMEM) und legen Sie es sofort auf Eis.
   4. Übertragen Sie das Gewebe in eine Gewebekulturschale und spülen Sie es mit 5 ml DPBS aus.
   5. Entfernen Sie nekrotische Regionen aus dem Tumor.
   6. Schneiden Sie das Gewebe in ca. 2 x 2 x 2 mm große Stücke.
   7. Übertragen Sie das Gewebe in Kryoröhrchen, die 20 % DMEM, 70 % FBS und 10 % DMSO enthalten.
   8. Übertragen Sie die Kryoröhrchen in einen Kryokonservierungsbehälter und stellen Sie sie in einen Gefrierschrank bei -80 °C.
   9. Wenn die Kryoröhrchen auf -80 °C abgekühlt sind, überführen Sie sie in ein Flüssigstickstofflager.

2. Inokulationswege für präklinische Studien

1. Subkutane Flankenimplantation.
   HINWEIS: Die subkutane Flankenimplantation kann zur Erleichterung verwendet werden und kann hilfreich sein, um alle Schritte der metastasierten Kaskade zu untersuchen.
   1. Verwenden Sie wachsende PDX-Tumore oder kryokonservierte PDX-Tumore für die initiale Flankenimplantation.
   2. Um PDX-Tumore wachsen zu lassen, sollten die Mäuse mit einer von der IACUC zugelassenen Methode eingeschläfert werden, wenn die Tumore länger als 15 mm sind. den Tumor resezieren und das Tumorgewebe in eine geeignete Aufbewahrungslösung (z.B. DMEM) überführen und sofort auf Eis legen.
   3. Bei kryokonservierten PDX-Tumoren tauen Sie das kryokonservierte PDX-Gewebe schnell auf, indem Sie es in ein 37 °C warmes Wasserbad tauchen.
   4. Befolgen Sie die Schritte 1.2.2-1.2.19.
2. Orthotope Implantation durch intrakranielle Injektion in das Gehirn.
   HINWEIS: Dieses Modell kann verwendet werden, um die Wirksamkeit von Medikamenten zur Überwindung der BHS zu testen und die Tumorbesiedlung zu untersuchen. Dieser Abschnitt bezieht sich in erster Linie auf die Verwendung des Tumordissoziationskits (siehe Tabelle der Materialien). Unterschiedliche Gewebetypen erfordern unterschiedliche Dissoziationsprotokolle. Es wird empfohlen, dass der Benutzer das Protokoll testet und optimiert, um die Dissoziationseffizienz zu maximieren.
   1. Euthanasieren Sie die Mäuse, denen PDX-Tumore implantiert wurden, mit einer von der IACUC zugelassenen Methode, wenn die Tumore länger als 15 mm sind.
   2. Unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank die PDX-Tumoren operativ resezieren und in DMEM auf Eis lagern.
   3. Bereiten Sie die Dissoziationslösung im entsprechenden Röhrchen vor, indem Sie die Enzymmischung gemäß dem Protokoll des Herstellers in DMEM geben.
   4. Waschen Sie den Tumor in 5 ml DPBS in einer Gewebekulturschale.
   5. Entfernen Sie die nekrotischen Regionen aus dem Tumor.
   6. Schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke von 2-4 mm Länge.
   7. Übertragen Sie die Tumorstücke in das Röhrchen mit der Enzymmischung.
   8. Befestigen Sie den Schlauch am Gewebedissoziator und führen Sie das für den Gewebetyp geeignete Programm aus. Konsultieren Sie das Protokoll des Herstellers, um zu erfahren, welches Programm ausgeführt werden soll und wie lange die Trennung erforderlich ist.
   9. Nach Abschluss des Programms werden die Zellen durch ein 70 μm großes Zellsieb abgeseiht.
   10. Waschen Sie das Zellsieb mit 20 ml DMEM.
   11. Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 300 x g für 7 min.
   12. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in DPBS.
   13. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie sie auf die erforderliche Konzentration.
   14. Richten Sie den stereotaktischen Rahmen gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und bereiten Sie ein Heizkissen für die Mäuse vor. Desinfizieren Sie alle Bereiche mit 70% Ethanol.
   15. Betäuben Sie das Tier in einer Induktionskammer mit 2-5% Isofluran und Sauerstoff. Nach der Betäubung wird das Tier in einen Nasenkegel überführt, um die Anästhesie bei 1,5-2,5 % Isofluran mit kontinuierlicher Sauerstoffzufuhr aufrechtzuerhalten. Bestätigen Sie die Anästhesietiefe durch fehlenden Pedalreflex. Tragen Sie die Veterinär-Augensalbe auf, um Augentrockenheit während der Operation zu verhindern. Bieten Sie dem Tier während des gesamten Eingriffs thermische Unterstützung, bis sich das Tier erholt hat.
   16. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie das Fell auf dem Kopf der Maus rasieren, um die Kopfhaut freizulegen.
   17. Geben Sie der Maus das entsprechende Analgetikum, z. B. eine Dosis von 1 mg/kg Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung (SR), die durch subkutane Injektion verabreicht wird.
   18. Übertragen Sie die Maus auf den stereotaktischen Frame. Stellen Sie sicher, dass die Maus auf den Beißblock beißt. Verwenden Sie die Ohrbügel, um den Kopf der Maus fest zu befestigen.
       Anmerkungen: Die Maus ist richtig gesichert, wenn sich der Kopf nicht bewegt, wenn er leicht mit einer Pinzette gedrückt wird.
   19. Desinfizieren Sie den rasierten Bereich mit drei abwechselnden Peelings aus Povidon-Jod und 70% Ethanol.
   20. Machen Sie einen 5-7 mm langen Längsschnitt auf der Kopfhaut, um den Schädel freizulegen und die Kopfhaut zurückzuziehen.
   21. Kratzen Sie die Knochenhaut mit einem stumpfen chirurgischen Instrument wie einer Pinzette ab.
   22. Finde das Bregma auf dem Schädel.
   23. Positionieren Sie die Nadel des stereotaktischen Rahmens auf dem Bregma und setzen Sie die Koordinaten auf 0 zurück oder notieren Sie sich die Koordinate auf dem Arm.
   24. Bewegen Sie den Arm 1 mm nach hinten (kaudal) und 1 mm seitlich rechts von der Mittellinie.
   25. Markieren Sie diese Stelle mit einem Permanentmarker. Wenn der Arm einen Schlitz für die Spritze enthält, befestigen Sie einen Marker am Spritzenschlitz, um die Stelle zu markieren.
   26. Bohren Sie an dieser Stelle ein kleines Bohrloch in den Schädel. Üben Sie nicht zu viel Druck aus, um zu verhindern, dass sich das Gehirn bohrt.
   27. Laden Sie eine 5 μl, 26 g Hamilton-Spritze mit 5-10 x 10^{4 Zellen in} einem Volumen von 1-2 μl und befestigen Sie sie am stereotaktischen Arm.
   28. Führen Sie die Hamilton-Spritzennadel langsam 2 mm in das Gehirn ein.
   29. Beginnen Sie mit der Injektion der Zellen mit der gewünschten Rate, normalerweise 0,2-0,5 μl/min.
   30. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nadel langsam aus dem Gehirn zurück.
   31. Füllen Sie das Bohrloch mit Knochenwachs.
   32. Verschließen Sie den Einschnitt mit chirurgischen Nähten oder chirurgischem Kleber.
   33. Bringen Sie die Maus zurück in den Käfig und beobachten Sie, wie sie sich von der Narkose erholt.
   34. Überwachen Sie den Zustand der Tiere regelmäßig und schläfern Sie sie ein, wenn die humanen Endpunktkriterien im genehmigten Protokoll erreicht sind.
       HINWEIS: Ein erfolgreiches Tumorwachstum im Gehirn führt zu einer Verschlechterung des Zustands des Tieres, die sich oft in Kopfneigung, rauem Haarkleid, gekrümmtem Körper, zusammengekniffenen Augen, reduzierter Aktivität und niedrigem Body Condition Score äußert (BCS < 2).
   35. Führen Sie eine Nekropsie an den eingeschläferten Tieren durch, gefolgt von einer histologischen Analyse, um das Vorhandensein von Tumoren im Gehirn zu bestätigen. Notieren Sie, wie lange es von der Einnistung bis zur Euthanasie dauert.
3. Implantation von PDX-Modellen durch intrakardiale Injektion
   HINWEIS: Dieses Modell kann verwendet werden, um den Organtropismus zu untersuchen, sobald Tumorzellen zirkulieren. In diesem Abschnitt wird auch das Tumordissoziationskit verwendet und muss nach Gewebetyp optimiert werden.
   1. Befolgen Sie die Schritte 2.2.1-2.2.13.
   2. Betäuben Sie das Tier in einer Induktionskammer mit 2-5% Isofluran und Sauerstoff. Nach der Betäubung wird das Tier in einen Nasenkegel überführt, um die Anästhesie bei 1,5-2,5 % Isofluran mit kontinuierlicher Sauerstoffzufuhr aufrechtzuerhalten. Bestätigen Sie die Anästhesietiefe durch fehlenden Pedalreflex. Tragen Sie die Veterinär-Augensalbe auf, um Augentrockenheit während der Operation zu verhindern. Bieten Sie dem Tier während des gesamten Eingriffs thermische Unterstützung, bis sich das Tier erholt hat.
   3. Positionieren Sie dann die Maus in Rückenlage.
   4. Um den Operationsbereich auf der Brust vorzubereiten, rasieren Sie das Fell und desinfizieren Sie es mit drei abwechselnden Peelings aus Povidon-Jod und 70% Ethanol.
   5. Ziehen Sie 0,5-10 x 10⁵ Zellen auf einer 28-G-Nadel bis zu einem Volumen von 100 μl in eine Spritze.
      HINWEIS: Die Anzahl der benötigten Zellen hängt von der Aggressivität des Modells ab und die optimale Anzahl von Zellen sollte für jedes Modell empirisch bestimmt werden.
   6. Lokalisieren Sie die Injektionsstelle (leicht links vom Brustbein der Maus und auf halbem Weg zwischen der Sternumkerbe und dem Processus xyphoideus).
   7. Führen Sie die Nadel an der Injektionsstelle senkrecht in die Maus ein.
   8. Beobachten Sie den erfolgreichen Eintritt in die linke Herzkammer durch einen Rückfluss von Blut, das in die Spritze eintritt. Geben Sie die Zellen langsam in die linke Herzkammer, ohne die Nadel zu bewegen.
   9. Ziehen Sie die Nadel langsam senkrecht aus der Maus heraus.
   10. Tragen Sie ein Stück sterile Gaze auf die Injektionsstelle auf und üben Sie etwa 1 Minute lang Druck aus, bis die Blutung aufhört, während Sie weiterhin die Bewegung des Brustkorbs für die Atmung zulassen.
   11. Nehmen Sie die Maus aus der Narkose und lassen Sie sie sich auf einem erhitzten Pad erholen.
       HINWEIS: Ein erfolgreiches Tumorwachstum führt zu einer Verschlechterung des Zustands des Tieres, die sich oft in zerzaustem Haarkleid, gekrümmtem Körper, zusammengekniffenen Augen, verminderter Aktivität und niedrigem Body Condition Score äußert (BCS < 2).
   12. Überwachen Sie den Zustand der Tiere regelmäßig und schläfern Sie sie ein, wenn die humanen Endpunktkriterien im genehmigten Protokoll erreicht sind.
   13. Führen Sie eine Nekropsie durch, um Metastasen bei den euthanasierten Tieren zu identifizieren, gefolgt von einer histologischen Analyse, um das Vorhandensein von Tumoren im Zielorgan zu bestätigen. Notieren Sie, wie lange es von der intrakardialen Injektion bis zur Euthanasie dauert.

Ergebnisse

Flankenvermehrte PDX-Tumoren sind am einfachsten zu implantieren, zu überwachen und zu resezieren und werden im Allgemeinen für die initiale Etablierung und Vermehrung von PDX-Tumoren empfohlen (Abbildung 1). Bei der Etablierung oder Vermehrung von PDX-Tumoren ist es ratsam, Tumore bei mehreren Tieren zu implantieren, da die Tumoraufnahmerate variieren kann und nicht jedes Tumorstück bei Mäusen immer vorhanden ist. Es wurden Methoden zur Etablierung und Vermehrung von ZNS-Metastasen-PDXs direkt im Gehirn entwickelt¹³. Diese Methoden sind jedoch mit geringeren Aufnahmeraten immer noch anspruchsvoller und die Tumore sind deutlich schwieriger zu vermehren und zu überwachen als die Flankenimplantation.

Wenn Patiententumore nicht ohne weiteres verfügbar sind, können PDX-Tumore der ZNS-Metastasierung auch aus einer Vielzahl von Quellen bezogen werden, einschließlich Repositorien akademischer Labore oder kommerzieller Unternehmen. Nach dem Erwerb der Tumore besteht die erste Priorität darin, so viel Material wie möglich zu vermehren und zu kryokonservieren, um sicherzustellen, dass eine große Anzahl von Tumoren mit niedriger Passage erhalten bleibt. Dadurch wird sichergestellt, dass genügend Material für eine unbegrenzte Anzahl von Folgestudien mit den PDX-Modellen zur Verfügung steht. Ähnlich wie immortalisierte Zelllinien sollten PDX-Tumore kryokonserviert und bei geringer Passagenzahl verwendet werden, da genetische Drift im Laufe der Zeit zu Veränderungen des Phänotyps und des Genotyps der PDXs führt^12,14,15. Unabhängig von der Quelle von PDX-Tumoren ist es wichtig, PDX- und Mauskolonien häufig auf Krankheitserreger für Mensch und Maus zu untersuchen, wie z. B. HIV und Hepatitis für den Menschen und Corynebacterium bovis für Mäuse. Dadurch wird die Ausbreitung unerwünschter Krankheitserreger vom PDX sowohl auf die Person, die mit ihnen umgeht, als auch auf andere Mäuse in der Studie und im Vivarium begrenzt.

Die hier beschriebenen Implantationsmethoden können zur Untersuchung der Tumorbiologie, zur Bewertung mehrerer Aspekte der metastasierten Kaskade und für präklinische Studien verwendet werden. Der Hauptvorteil der Flankenimplantation ist die einfache Überwachung des Tumors im Laufe der Zeit, da die Tumore sichtbar sind und ihr Wachstum leicht mit einem Messschieber gemessen werden kann. Diese Methode kann ein guter Ausgangspunkt sein, um die Machbarkeit eines Wirkstoffziels zu ermitteln. Die intrakranielle Implantation wird bevorzugt, wenn das Vorhandensein der Mikroumgebung des Gehirns wichtig ist und das Wachstum oder das molekulare Profil des Tumors verändern könnte. Darüber hinaus platziert die intrakranielle Implantation den Tumor hinter der Blut-Hirn-Schranke (BHS), was sie für präklinische Studien zur Untersuchung der Wirksamkeit von Medikamenten, die für die Überwindung der BHS erforderlich sind, unerlässlich macht. Es ist jedoch schwierig, das Wachstum von PDX-Tumoren zu überwachen und erfordert eine radiologische Bildgebung oder biolumineszente Bildgebung, wenn die Zellen markiert sind. Um zu wissen, wann die medikamentöse Behandlung präklinisch beginnen muss, wären entweder Bildgebungsdaten zur Überwachung des Wachstums oder Kenntnisse über das durchschnittliche Überleben von Mäusen erforderlich, die einen bestimmten PDX-Tumor tragen. Darüber hinaus umgeht die intrakranielle Implantation alle wesentlichen Schritte der metastasierten Kaskade und eignet sich daher nur für die Untersuchung der Wirksamkeit von Medikamenten und der Mikroumgebung des Tumors im Gehirn. Trotz der Unterschiede in der Mikroumgebung des Tumors ist die Morphologie von PDX-Tumoren unabhängig von der Implantationsstelle ähnlich, wie bei diesem PDX-Tumor (CM04) zu sehen ist, der aus einer Hirnmetastase stammt, die von einem kleinzelligen Primärtumor des Lungenkarzinoms stammt (Abbildung 2). Die kleinzellige Lungenkarzinommorphologie von Tumorzellen mit kleinen Zellkernen und spärlichem Zytoplasma kann im Flankentumor, im intrakraniellen Tumor und in abdominalen Metastasen infolge intrakardialer Injektion beobachtet werden. Darüber hinaus wurden bereits spontane Metastasen von Tumoren, die in die Flanke implantiert wurden, beobachtet¹², was darauf hindeutet, dass die metastasierten Prozesse wie Intravasation, Extravasation und Kolonisation rekapituliert und in Flankentumoren untersucht werden können, was sonst mit orthotopen Tumoren im Gehirn nicht möglich wäre. Generell wird beobachtet, dass die Flankenimplantation eine geeignete Methode ist, um die Biologie der ZNS-Metastasierung zu untersuchen und präklinische Studien durchzuführen.

Die intrakardiale Injektion wird am häufigsten verwendet, um den Organtropismus und das Metastasierungspotenzial von Tumoren zu untersuchen. Injizierte Tumorzellen müssten mehrere Schritte der metastatischen Kaskade durchlaufen, einschließlich des Überlebens der Zirkulation, der Extravasation und der Kolonisierung der metastasierten Stelle. Ähnlich wie bei der orthotopen Injektion in das Gehirn kann es schwierig sein, das Fortschreiten der Tumormetastasierung ohne radiologische Bildgebung oder Zellmarkierung zu verfolgen. Wie bei der orthotopen Implantation führt eine erfolgreiche Inokulation jedoch zu einer Verschlechterung des Zustands der Tiere im Laufe der Zeit, wenn sich der Tumor ausbreitet. Abbildung 3A zeigt die Metastasierung des Gehirns nach intrakardialer Injektion im ZNS-Metastasen-PDX-Modell M2, das von einem Melanom stammt. Die intrakardiale Injektion des PDX-Tumors (CM04) führte zu Metastasen in die Bauchhöhle und die Leber (Abbildung 3B). Andere untersuchte Organe wie Lunge, Niere und Eierstöcke wiesen keine sichtbaren Metastasen auf.

Abbildung 1: Flussdiagramm, das den allgemeinen Arbeitsablauf bei der Einrichtung, Verbreitung und Verwendung von PDX für präklinische Studien zeigt. Für jede Inokulationsmethode sind die Schritte der beteiligten metastasierten Kaskade unter jeder Methode aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Histologie von PDX-Tumoren nach verschiedenen Inokulationsmethoden. Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) eines ZNS-Metastasen-PDX-Tumors, der von einem kleinzelligen Lungenkrebs (CM04) stammt, der immungeschwächten Mäusen mit den drei Methoden implantiert wurde, weist ähnliche tumorpathohistologische und morphologische Merkmale wie kleinzellige Lungenkarzinome auf, mit kleinen Kernen und spärlichem Zytoplasma. Das intrakardiale Injektionspanel zeigt eine abdominale Metastasierung. Nester aus kleinen Zellen und ein hohes Verhältnis von Kern zu Zytoplasma sind in allen drei Bildern zu erkennen. Die Bilder wurden mit einem Diascanner aufgenommen und auf das 10-fache vergrößert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Metastasen nach intrakardialer Injektion. H&E-Färbung von Geweben mit sichtbarer Metastasierung während der Beurteilung durch Sektion nach intrakardialer Injektion von (A) M2 und (B) CM04. Die Bilder wurden (A) auf einem Objektträgerscanner aufgenommen und auf einem normalen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung auf 1-fach (links) oder 20-fach (rechts) oder (B) vergrößert. Diese Abbildung wurde gegenüber unserer vorherigen Veröffentlichung¹² geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

Im vorliegenden Manuskript wurden Methoden zur PDX-Etablierung und -Vermehrung detailliert beschrieben. Drei verschiedene Inokulationsmethoden, die für den Aufbau präklinischer Studien bei der Beurteilung von ZNS-Metastasen verwendet werden können, wurden ebenfalls demonstriert. Die gewählte Methode sollte von den Zielen des Experiments abhängen. In einigen Fällen wäre es von Vorteil, mehr als einen Impfweg zu verwenden. Zum Beispiel bietet die subkutane Flankenimplantation einen einfachen Ansatz, um die Wirksamkeit eines Medikaments auf das Tumorwachstum zu untersuchen und das Medikament an seinem Ziel zu beurteilen, und es bietet auch eine visuelle Darstellung der Tumorgröße, die leicht überwacht und gemessen werden kann. Sobald jedoch die Durchführbarkeit des Ziels und die Anti-Tumor-Wachstumseigenschaften etabliert sind, könnte man eine orthotopische Studie durchführen, um die Wirksamkeit des Biologikums zur Überquerung der BHS zu bewerten und seine Wirkung in der Mikroumgebung des Hirntumors zu untersuchen. Auch das Überleben wird in orthotopen und intrakardialen Injektionsstudien besser beurteilt.

Die intrakranielle Injektion von Hirnmetastasen-PDX-Modellen ist aufgrund des Vorhandenseins der Mikroumgebung des Gehirns und der BHS oft das präklinische Modell der Wahl. Studien haben jedoch gezeigt, dass Hirnmetastasen die Fähigkeit haben, die BHS zu modifizieren, was die Permeabilität von Molekülen für den Tumor beeinflusst¹⁶. Diese Veränderungen der BHS würden sich bei intrakraniell implantierten Tumoren nicht widerspiegeln, und aus diesem Grund spiegeln präklinische Arzneimittelstudien das Ansprechen von Patiententumoren möglicherweise nicht vollständig wider. Trotz dieser Einschränkung bleibt die intrakranielle Injektion die beste Methode, um die Permeabilität und Wirksamkeit von Medikamenten zur Überwindung der BHS in präklinischen Modellen zu testen. Eine weitere Herausforderung bei intrakraniellen Modellen besteht darin, dass sie schwierig zu überwachen sind und den Einsatz bildgebender Verfahren erfordern. Die virale Transduktion von PDXs mit fluoreszierenden oder biolumineszenten Markern wird traditionell verwendet, kann aber eine Herausforderung darstellen. Es werden jedoch mehrere bildgebende Verfahren für den Einsatz bei Mäusen entwickelt, die keine Marker benötigen, was die Überwachung dieser orthotopen Hirntumore für präklinische Studien erleichtern könnte. Dazu gehören bildgebende Verfahren wie die Magnetresonanztomographie (MRT) und die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) sowie die Mikro-Computertomographie (Mikro-CT). Schließlich spiegelt die intrakranielle Injektion möglicherweise nicht genau die Mikroumgebung von ZNS-Metastasen außerhalb des Gehirns wider, wie z. B. bei leptomeningealen Metastasen. In diesem Fall könnte eine Injektion in die Cisterna magna durchgeführt werden, um leptomeningeale Metastasen genauer darzustellen¹⁷.

Die Charakterisierung sowohl der phänotypischen als auch der molekularen Merkmale des PDX-Modells ist wichtig für die Auswahl der besten Modelle für präklinische Studien. Die Tumorlatenz kann zwischen 7 und 140 Tagen liegen und die Aufnahmeraten können ebenfalls sehr variabel sein¹². Die optimale Anzahl der zu implantierenden Tiere und der Zeitpunkt bis zum Beginn der Behandlung müssten auf den Merkmalen des jeweiligen PDX-Modells basieren und empirisch bestimmt werden. Darüber hinaus ist das molekulare Profil von PDX-Tumoren auch wichtig für die Auswahl der repräsentativsten PDX-Modelle für präklinische Studien. Je näher das Modell dem Spendergewebe molekular kommt, desto prädiktiver ist es für das klinische Ansprechen. Außerdem muss sichergestellt werden, dass die aus den Humandaten ausgewählten Zielstrukturen in den PDXs, die für Studien ausgewählt werden, vorhanden sind und über einige Generationen hinweg aufrechterhalten werden, da gezeigt wurde, dass die klonale Sukzession mit einem anderen genomischen Profil des etablierten dominanten Klons verbunden ist. Vor diesem Hintergrund wurden die phänotypischen und molekularen Profile der ZNS-Metastasen-PDX-Tumoren über mehrere Generationen hinweg umfassend charakterisiert¹².

Trotz der vielen Vorteile der Verwendung von PDX-Modellen für ZNS-Metastasen gibt es einige Einschränkungen im Zusammenhang mit ihrer Verwendung. Erstens sind eine alternative Tumormikroumgebung und insbesondere das Fehlen eines Immunsystems gut dokumentierte Einschränkungen von PDX-Modellen¹⁸. Das Xenotransplantat eines menschlichen Tumors in Mäuse führt bei jeder weiteren Passage dazu, dass das menschliche Stroma durch das Mausstroma ersetzt wird, und das menschliche Stroma wird in der Regel nach mehreren Passagen vollständig ersetzt¹⁹. Die Unterschiede in der Tumormikroumgebung führen jedoch nicht zu großen Unterschieden im molekularen Profil von flankenimplantierten PDX-Tumoren im Vergleich zum ursprünglichen Patiententumor¹², was darauf hindeutet, dass Flankenmodelle immer noch gute experimentelle Modelle zur Untersuchung von ZNS-Metastasen darstellen. Zweitens führt der Einsatz von immungeschwächten Tieren zu einer fehlenden Infiltration von Immunzellen in den Tumor und zu einer allgemeinen Immunantwort des Wirts, was die grundlegende Art und Weise, wie der Wirt versucht, das Krebswachstum zu bekämpfen, einschränkt¹². Während humanisierte Mäuse, die mit menschlichen Immunzellen transplantiert wurden, zur Verfügung stehen, um die Interaktionen spezifischer Immunzellen mit dem Tumor zu untersuchen, gibt es immer noch viele Fragen und Kontroversen über die Ansätze, Methoden und die Interpretation dieser Ergebnisse²⁰.

Während sich die Mehrheit der PDXs als genetisch stabil erwiesen hat, haben wir und andere gezeigt, dass es in seltenen Fällen, auch ohne Behandlungen oder anderen externen Selektionsdruck, zu Veränderungen in den Klonen der Tumore kommen kann, wie z. B. eine geringfügige Klonübernahme^12,14,15. Dies könnte zu dramatischen Veränderungen des molekularen Profils führen, die letztendlich dazu führen würden, dass der Tumor nicht mehr die dominanten Klone im Patiententumor^{widerspiegelt 12}. Während PDXs, die eine klonale Sukzession aufweisen, in präklinischen Studien verwendet werden können, könnten viele Gene, die für das Targeting vorgesehen sind (z. B. Her2), bei der klonalen Sukzession verloren gehen. Daher wird ein häufiges Screening von PDX-Modellen empfohlen, um festzustellen, ob sie das molekulare Profil des gewünschten Klons beibehalten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass PDX-Modelle ein hervorragendes Modellsystem darstellen, um nicht nur ZNS-Metastasen, sondern auch andere Tumorarten zu untersuchen. Die Entwicklung dieser Modelle hat gezeigt, dass sie weitgehend das phänotypische, molekulare Profil und die Heterogenität menschlicher ZNS-Metastasen widerspiegeln 8,9,10,12. Sie dienen als effektive Modelle sowohl für die Untersuchung der ZNS-Metastasierungsbiologie als auch als physiologisch relevante präklinische Modelle, indem sie überstrapazierte Zelllinienmodelle ersetzen, die in der Vergangenheit für In-vivo-Studien der ZNS-Metastasierung verwendet wurden. Zweifelsohne gibt es Unterschiede zwischen dem PDX- und dem Tumor des Spenderpatienten^12,18. Zu wissen, worin diese Unterschiede bestehen, ist wichtig für die richtige Planung und Durchführung präklinischer Studien. Schließlich sind PDX-Modelle durch die Wahl zwischen mehreren Inokulationswegen vielseitig einsetzbar und ermöglichen die Untersuchung mehrerer Aspekte der Krankheit. PDX-Modelle werden zweifellos eine wichtige Rolle dabei spielen, unser Verständnis der ZNS-Metastasierung und die Entwicklung neuer Therapien zu verbessern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
25G Nadel	VWR	BD305122
70 µ m Cell Sieb	VWR	21008-952
70% Ethanol Tücher	VWR	470106-486
Knochenwachs	MedVet	W31G-RL
CIEA NOG Maus	Taconic	NOG-F
DMEM	ThermoFisher	11965092
Ethiqa XR (Buprenorphin SR)	MWI	072117
FBS	ThermoFisher
gentleMACS C Tube	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Dissoziator	Miltenyi	130-095-937
Hamilton Spritze	Sigma	20919
Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR)	Corning	354230
Augensalbe	MedVet	PH-PURALUBE-VET
PBS/DPBS	ThermoFisher	14040133
Povidon-Jod-Tupfer	VWR	15648-906
Stereotaktischer Rahmen	Stoelting	51730
Chirurgischer Bohrer	Stoelting	58610
Chirurgischer Kleber	MedVet	VG3
Chirurgisches Nahtmaterial	MedVet	MMV-661-V
Spritze	VWR	53548-001
Tumor-Dissoziations-Set	Miltenyi	130-095-929