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Neuroscience

चूहों के व्यवहार के हिप्पोकैम्पस में न्यूरोनल गतिविधियों की कल्पना के लिए क्रैनियोटॉमी प्रक्रिया

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62266
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 1,2,3,6, 1,2,3
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine, 3Institute of Basic Medical Sciences, Westlake Institute for Advanced Study, 4School of Basic Medical Sciences, Xi'an JiaoTong University, 5Office of Public Affairs, Westlake University, 6School of Pharmaceutical Sciences, Jilin University

Summary

यह लेख चूहों में हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र पर जलसेक कैनुला और इसके प्रत्यारोपण के साथ पूरक एक कस्टम-निर्मित इमेजिंग विंडो की तैयारी को दर्शाता है।

Abstract

जाग व्यवहार जानवरों में एकल सेल संकल्प पर इमेजिंग तंत्रिका गतिविधियों सिस्टम तंत्रिका विज्ञान में तंत्रिका सर्किट कार्यों की जांच के लिए एक बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण है। हालांकि, स्तनधारी ऊतकों में उच्च अवशोषण और प्रकाश का बिखराव ज्यादातर सतही मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए इंट्राविटल इमेजिंग को सीमित करता है, जो गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों को छोड़ता है, जैसे हिप्पोकैम्पस, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के लिए पहुंच से बाहर। इस वीडियो में, हम तैयारी और कस्टम निर्मित इमेजिंग खिड़की के प्रत्यारोपण दिखाने के लिए सिर में पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस CA1 क्षेत्र के वीवो इमेजिंग में पुरानी सक्षम करने के लिए तय व्यवहार चूहों । कस्टम-निर्मित खिड़की को एक जलसेक कैनुला के साथ पूरक किया जाता है जो इमेजिंग क्षेत्र में वायरल वैक्टर और दवाओं के लक्षित वितरण की अनुमति देता है। व्यापक क्षेत्र इमेजिंग के साथ इस तैयारी के संयोजन से, हमने कई हफ्तों में चूहों के व्यवहार में न्यूरॉन्स के बड़े सबसेट से फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक का उपयोग करके न्यूरोनल गतिविधि की एक दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग का प्रदर्शन किया। हमने सिंगल-स्पाइक रेजोल्यूशन के साथ वोल्टेज इमेजिंग के लिए इस तैयारी की प्रयोज्यता का भी प्रदर्शन किया। न्यूरोनल गतिविधि और वैज्ञानिक सीएमओएस कैमरों के उच्च प्रदर्शन आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड संकेतकों ने उच्च लौकिक संकल्प पर एकल न्यूरॉन्स के उपकोशिक रूपात्मक विवरणों के आवर्ती दृश्य की अनुमति दी। हम वर्णित विधि के फायदे और संभावित सीमाओं और अन्य इमेजिंग तकनीकों के साथ इसकी अनुकूलता पर भी चर्चा करते हैं।

Introduction

हिप्पोकैम्पस एक प्रमुख मस्तिष्क क्षेत्र है जो सीखने और स्मृति1 के साथ - साथ स्थानिक नेविगेशन2के लिए जिम्मेदार है । हिप्पोकैम्पल शोष न्यूरोलॉजिकल और मनोरोग विकारों से जुड़ा हुआ है जिसमें स्मृति हानि और संज्ञानात्मक गिरावट3,4,5शामिल है । चूहों में, हिप्पोकैम्पस सेलुलर और नेटवर्क के स्तर4,5 पर स्थानिक, प्रासंगिक और साहचर्य सीखने और स्मृति गठन का अध्ययन करने के लिए एक बहुत ही अच्छीतरह से स्थापितमॉडल है। सीखने और स्मृति के यंत्रवादी अध्ययनों के लिए चूहों के व्यवहार में न्यूरोनल संरचना और कार्य की देशांतर पूछताछ की आवश्यकता होती है। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड जांच के संयोजन में फ्लोरेसेंस इमेजिंग6 झिल्ली वोल्टेज गतिशीलता7,8,कैल्शियम यात्रियों9,और न्यूरॉन्स के बड़े सबसेट पर संरचनात्मक परिवर्तन10 को रिकॉर्ड करने के लिए अभूतपूर्व क्षमताएं प्रदान करता है। हालांकि, चूहों में हिप्पोकैम्पस तक ऑप्टिकल पहुंच कॉर्टेक्स द्वारा बाधित होती है, जो मोटाई में 1 मिमी से अधिक तक पहुंच सकती है। यहां, हमने चूहों के व्यवहार में पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के CA1 उपक्षेत्र के लिए दीर्घकालिक ऑप्टिकल पहुंच के लिए माउस सिर में एक कस्टम-निर्मित इमेजिंग डिवाइस और इसके पुराने प्रत्यारोपण को कोडांतरण करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया। इमेजिंग प्रत्यारोपण में एकीकृत जलसेक कैनुला वायरस या दवाओं के प्रशासन को देखने के क्षेत्र में न्यूरॉन्स पर सीधे अनुमति देता है। वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में वर्णित तैयारी लंबे समय तक चूहों के व्यवहार में न्यूरॉन्स के बड़े सबसेट की आवर्ती इमेजिंग को सक्षम बनाती है। हमने एकल-कोशिका संकल्प पर न्यूरोनल गतिविधि रिकॉर्डिंग के लिए रीकॉम्बिनेंट एडेनो-संबद्ध वायरस (आरएवी) के लक्षित इंजेक्शन के माध्यम से हिप्पोकैम्पल CA1 क्षेत्र में कैल्शियम और वोल्टेज आनुवंशिक रूप से इनकोडेड संकेतकों को व्यक्त करने के लिए इस तैयारी का उपयोग किया। हमने जानवरों के व्यवहार में उच्च स्थानिकप्रेमी संकल्प पर संबंधित न्यूरोनल सबसेट की देशांतर कैल्शियम इमेजिंग भी की। इसके अलावा, यह तैयारी मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी और माइक्रोएंड्रोस्कोपी के साथ संगत है, इस प्रकार चूहों के व्यवहार में सेलुलर और उपकोशिकीय स्तरों पर न्यूरोनल नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए इमेजिंग तकनीकों के टूलबॉक्स का विस्तार किया जाता है। हमने प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदमों और समस्या निवारण का वर्णन किया । हमने विधि के संभावित नुकसान और सीमाओं पर भी चर्चा की ।

Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को वेस्टलेक विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. प्रत्यारोपण कोडांतरण

नोट: इमेजिंग प्रत्यारोपण का कोडांतरण तकनीकी रूप से सरल है और केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वस्तुओं की आवश्यकता है(चित्रा 1, सामग्री की तालिकाभी देखें)। हेड प्लेट्स को स्टेनलेस-स्टील या टाइटेनियम प्लेट्स का इस्तेमाल करते हुए लोकल मशीन शॉप पर निर्मित किया जा सकता है । हम सर्जरी शुरू करने से पहले पूरी तरह से इकट्ठे प्रत्यारोपण का एक शेयर तैयार करने का सुझाव देते हैं । वीवो प्रयोगों में किए जाने के बाद, प्रत्यारोपण को कई बार पुनर्संयोजित और पुन: इस् तेम किया जा सकता है। कुछ मामलों में, इसे केवल कवर ग्लास को मिलाने या बदलने के द्वारा जलसेक कैनुला को फिर से संलग्न करने की आवश्यकता हो सकती है।

  1. कोडांतरण और स्थापना इमेजिंग प्रत्यारोपण(चित्रा 1)के लिए सभी छह प्रमुख हार्डवेयर घटकों को तैयार करें ।

Figure 1
चित्रा 1:इमेजिंग प्रत्यारोपण के कोडांतरण और स्थापना के लिए छह प्रमुख हार्डवेयर घटक। (A)डमी कैनुला। (ख)गाइड कैनुला । (C)इमेजिंग कैनुला। (घ)ग्लास कवर ग्लास। (ई)हेडप्लेट । (एफ)आंतरिक कैनुला। स्केल बार: 5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. वेल्डिंग मशीन चालू करें और इसे आवश्यक तापमान तक गर्म करें।
    नोट: तापमान वेल्डिंग टिन का इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है ।
  2. ऑक्सीकरण परत को हटाने के लिए ठीक सैंडपेपर का उपयोग करके इमेजिंग कैनुला की साइड सतह को पॉलिश करें और इस प्रकार मजबूत टांका की सुविधा प्रदान करें।
  3. इमेजिंग कैनुला और इंजेक्शन कैनुला (डाला डमी कैनुला के साथ गाइड कैनुला) की स्थिति को हाथ(चित्रा 2 ए,बी)की मदद करते हुए समायोजित करें।
  4. सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग करके, इमेजिंग और इंजेक्शन कैनुलास के बीच कनेक्शन स्थान पर उचित प्रकार के प्रवाह की एक छोटी राशि 5 सेकंड के लिए लागू करें, और फिर बूंद को हटा दें।
    नोट: इस तैयारी के लिए, हमने एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवाह का उपयोग किया जो निर्माता द्वारा स्टेनलेस स्टील के हिस्सों को मिलाने के लिए निर्दिष्ट किया जाता है क्योंकि इमेजिंग और जलसेक कैनुलास स्टेनलेस स्टील से बने होते हैं। कैनुलास के निर्माण के लिए उपयोग की जाने वाली अन्य सामग्रियों के मामले में, अंतिम उपयोगकर्ता को फ्लक्स का चयन करना चाहिए जो चयनित सामग्री को वेल्ड कर सकता है।
  5. टांका टिन पिघल और यह प्रवाह(चित्रा 2)के साथ इलाज कनेक्शन जगह पर लागू होते हैं ।
    नोट: अतिरिक्त टांका टिन से बचें, क्योंकि सर्जरी के दौरान अनावश्यक बड़े क्रैनिओटॉमी की आवश्यकता होगी।

Figure 2
चित्रा 2:इमेजिंग कैनुला के साथ, डाला डमी कैनुला के साथ गाइड कैनुला से मिलकर इंजेक्शन कैनुला कोडांतरण की योजनाबद्ध। (क)इंजेक्शन कैनुला और इमेजिंग कैनुला के बीच का कोण 45 डिग्री तक होना चाहिए। (ख)इंजेक्शन कैनुला की नोक इमेजिंग कैनुला के किनारे पर सही होनी चाहिए। (ग)वेल्डिंग टिन का एक उपयुक्त आकार जो इमेजिंग और इंजेक्शन कैनुलास को मिलाप करने के लिए उपयोग किया जाता है (लाल रेखा टिन की बूंद की रूपरेखा को इंगित करती है)। (घ)वेल्डिंग टिन का अनुचित आकार जो प्रत्यारोपण की तैयारी के दौरान बचा जाना चाहिए (लाल रेखा टिन की बूंद की रूपरेखा को इंगित करती है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. टांका टिन ठंडा करने के लिए प्रतीक्षा करें। आमतौर पर, इसमें कई सेकंड लगते हैं।
  2. पुष्टि करें कि इंजेक्शन कैनुला दोनों दिशाओं से डमी कैनुला डालने से अवरुद्ध नहीं है।
  3. टूथपिक या 26 जी सिरिंज सुई का उपयोग करके इमेजिंग कैनुला के नीचे की ओर यूवी-इलाज ऑप्टिकल चिपकने वाला लागू करें।
  4. इमेजिंग कैनुला के लिए संबंधित आकार के कवर ग्लास को ध्यान से रखने के लिए एक अच्छी चिमटी का उपयोग करें।
    नोट: कांच की स्थिति ठीक इमेजिंग कैनुला पर किया जाना चाहिए कांच बहुत ज्यादा ले जाने के बिना एक बार यह ऑप्टिकल चिपकने वाला छुआ है । अन्यथा, ग्लास गंदा हो जाता है, इस प्रकार इमेजिंग की गुणवत्ता को कम करता है।
  5. एक मानक हाथ में यूवी लैंप से 350-400 एनएम यूवी रोशनी द्वारा कम से कम एक घंटे के लिए चिपकने वाला इलाज।
    नोट: प्रयुक्त चिपकने वाला ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी होना चाहिए। अन्यथा, यह इमेजिंग विंडो की गुणवत्ता को कम कर देगा।
    सावधानी: यूवी-प्रोटेक्टिंग चश्मा, दस्ताने और लैब कोट पहनकर त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें।
  6. कैनुला को 70% इथेनॉल, एयर ड्राई में धोएं, और सर्जरी तक बाँझ कंटेनर में स्टोर करें।
    नोट: कवर ग्लास को यथासंभव साफ और बरकरार रखना बहुत जरूरी है। प्रयुक्त ऑप्टिकल चिपकने वाला 70% इथेनॉल में रासायनिक रूप से स्थिर है।

2. विंडो इम्प्लांटेशन

  1. सर्जरी से पहले तैयारी कदम
    1. सभी सर्जिकल उपकरणों को एक ऑटोक्लेव में स्टरलाइज करें।
    2. दो अलग-अलग पेट्री व्यंजनों में 1x पीबीएस और 70% इथेनॉल तैयार करें।
    3. वैकल्पिक रूप से: सर्जिकल प्रक्रिया शुरू करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश का उपयोग करके सर्जरी क्षेत्र को कीटाणुरहित करें।
      नोट: सबसे बाँझ संभव स्थितियों के तहत संचालन सफल और लंबे समय तक चलने (6 महीने के रूप में लंबे समय के रूप में) कांच से ढके कपाल खिड़कियों में परिणाम होगा । संदूषण के परिणामस्वरूप अधिकांश मामलों में कम खिड़की पारदर्शिता या गंभीर सूजन हो सकती है।
  2. सर्जिकल प्रक्रिया
    1. सर्जरी से ठीक पहले 70% इथेनॉल के साथ सर्जिकल क्षेत्र को स्टरलाइज करें।
    2. जानवर का वजन करें और आईएसीयूसी अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार एनाल्जेसिक की पूर्व-शल्य चिकित्सा खुराक को कम से कम प्रशासित करें।
    3. आइसोफ्लोरैन (प्रेरण के लिए 4%, बनाए रखने के लिए 1.5-2%, हवा की 0.3-0.5 एल/मिन प्रवाह दर) के साथ एक माउस को एनेस्थेटाइज करें। यह सुनिश्चित करने के लिए पूंछ-चुटकी और अंगुली-चुटकी तकनीक का उपयोग करें कि जानवर पूरी तरह से बेहोश है। प्रक्रिया की अवधि के लिए श्वसन, एसपीओ2और हृदय गति जैसे जानवर के महत्वपूर्ण संकेतों का निरीक्षण करें।
    4. आंखों तक गर्दन के पीछे से फर को हटाने के लिए ट्रिमर या डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग करें।
    5. एक सर्जरी हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस को बनाए रखने) पर एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में माउस रखें। कान की सलाखों के साथ सिर सुरक्षित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सिर मजबूती से सुरक्षित है, सभी दिशाओं में सिर को थोड़ा धक्का दें।
    6. सर्जरी के दौरान जानवर की आंखों को सूखने से रोकने के लिए आंखों का मरहम लगाएं।
    7. एक चीरा बनाने से पहले तीन बार 70% इथेनॉल के बाद बीटाडीन के साथ सर्जिकल साइट को स्टरलाइज करें।
    8. खोपड़ी के शीर्ष पर त्वचा को हटा दें, सिर के आधार के साथ एक क्षैतिज कटौती के साथ शुरू, रोस्ट्रल दिशा में दो कटौती के बाद, लगभग पलकों तक पहुंचने, फिर दो तिरछी कटौती जो मिडलाइन पर एकाग्र होती हैं।
    9. दो बाँझ सूती झाड़ू के साथ, कनेक्टिंग ऊतक, साथ ही गर्दन के पीछे की मांसपेशी को खोपड़ी के किनारों पर वापस लें।
      नोट: हेरफेर के दौरान रक्त वाहिकाओं (विशेष रूप से मांसपेशियों में छिपे हुए लोगों) को नुकसान पहुंचाने से बचने की कोशिश करें।
    10. अत्यधिक दर्द से बचने के लिए 2 मिनट के लिए पेरिओस्टियम की सतह पर लिडोकेन समाधान (~ 0.1 एमएल) की एक बूंद लागू करें। खोपड़ी को हटाने के बाद सूजन से मस्तिष्क को कम करने के लिए, 1% डेक्सामेथासोन के 0.1 एमएल को चमड़े के इंजेक्शन दिया जा सकता है।
    11. धीरे-धीरे खोपड़ी के पूरे उजागर क्षेत्र को एक सूखे और किसी न किसी सतह को बनाने के लिए एक सूखा और मोटा सतह बनाने के लिए परिमार्जन करें जो गोंद और दंत सीमेंट को बेहतर पालन करने की अनुमति देता है और इस प्रकार पुरानी प्रत्यारोपण में जिसके परिणामस्वरूप।
    12. ब्रीग्मा पर स्टीरियोटैक्सिक स्टेशन पर चढ़कर सुई की नोक रखें, सभी तीन निर्देशांक (एपी: पूर्वकाल-पीछे; एमएल: मध्य-पार्श्व; डीवी: पृष्ठीय-वेंट्रल) 0 के रूप में।
    13. लैम्ब्डा पर सुई की नोक रखें और देखें कि क्या एपी समन्वय 0 है ताकि यह पुष्टि की जा सके कि सिर की स्थिति ऊर्ध्वाधर है, साथ ही यदि सिर की पुष्टि करने के लिए एमएल समन्वय 0 है क्षैतिज रूप से तैनात है। यदि नहीं, तो स्टीरियोटैक्सिक स्टेशन पर संबंधित घुंडी को समायोजित करें, जब तक कि एपी और एमएल निर्देशांक दोनों 0.1 मिमी के भीतर न हों।
    14. क्रैनिओटॉमी के लिए संबंधित बिंदुओं को खोजने के लिए सुई की नोक को स्थानांतरित करें और एक ठीक मार्कर का उपयोग करके खोपड़ी पर अपनी स्थिति को चिह्नित करें। हिप्पोकैम्पस के लिए प्रत्यारोपण के मामले में, निम्नलिखित निर्देशांक (एपी: -0.68, एमएल: -2.0) (एपी: -3.68, के साथ 4 अंक हैं एमएल: -2.0) (एपी: -2.18, एमएल: -0.5) और (एपी: -2.18, एमएल: -3.5)11,साथ ही (एपी: -4.0, एमएल: -2.0) इंजेक्शन कैनुला के सबसे काउडल पॉइंट के लिए।
      नोट: इस चरण में उपयोग किए जाने वाले मार्कर को सर्जरी से कम से कम एक घंटे पहले यूवी रोशनी का उपयोग करके निष्फल किया जाना चाहिए। यहां दिखाए गए निर्देशांक 6-8 सप्ताह पुराने C57BL/6J चूहों के लिए हैं । चूहों की विभिन्न उम्र या उपभेदों के कारण निर्देशांक भिन्न हो सकते हैं।
    15. चार चिह्नित बिंदुओं के आधार पर एक सर्कल बनाएं, साथ ही सर्कल के कौडल साइड(चित्रा 3)पर इंजेक्शन कैनुला क्षेत्र की रूपरेखा भी बनाएं।
  1. खोपड़ी पर चिह्नित रूपरेखा के साथ धीरे-धीरे "आकर्षित" करने के लिए 10,000 आरपीएम की गति से वायवीय ड्रिल का उपयोग करें।
  2. खोपड़ी ड्रिल जब तक हड्डी की एक बहुत पतली परत छोड़ दिया है, जो आम तौर पर केंद्र में कोमल स्पर्श के तहत wiggle शुरू होता है ।
  3. क्रेनिओटॉमी के केंद्र में बाँझ 1x पीबीएस की एक बूंद लागू करें, खोपड़ी से हड्डी फ्लैप को बहुत पतली टिप संदंश या विपरीत पक्षों से आने वाली दो 26 जी सुइयों के साथ उठाएं।
    नोट: PBS खोपड़ी के टुकड़े को हटाने और ड्यूरा12के संभावित रक्तस्राव को रोकने में मदद करेगा ।
  4. PBS लागू करें, एक 26G कुंद सुई के माध्यम से कोमल आकांक्षा के बाद कई बार ड्यूरा की सतह को साफ करने के लिए ।
  5. धीरे से या तो आकांक्षा या नेत्र कैंची से, ड्यूरा को हटा दें। कॉर्टेक्स को कम करने के लिए कोमल सक्शन (~-60kPa) लागू करें, साथ ही हिप्पोकैम्पस के ऊपर कॉर्पस कैलोसम भी।
    नोट: कॉर्टेक्स अक्सर कॉर्पस कैलोसम की तुलना में अधिक पीला होता है, और कॉर्पस कैलोसम आमतौर पर हिप्पोकैम्पस की तुलना में व्हाइटर होता है। कॉर्पस कैलोसम आमतौर पर ऊपर से मनाए जाने पर ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज दिशाओं में जाने वाले न्यूरोनल फाइबर द्वारा अलग करना आसानहोता है (चित्र 3)।

Figure 3
चित्र 3:हिप्पोकैम्पस स्थान और मस्तिष्क एब्लेशन प्रक्रिया का स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक। (ए)क्रेनिओटॉमी क्षेत्र के किनारों के लिए चार निर्देशांक। (ख)पूर्ण क्रेनियोटॉमी क्षेत्र। (C-E) प्रतिनिधि छवियों सर्जरी के दौरान अधिग्रहीत (बाएं) और उनके योजनाबद्ध आरेख (दाएं) के विभिन्न रंगों और(ए)कॉर्टेक्स(बी)कॉर्पस Callosum, और(सी)हिप्पोकैम्पस प्रांतस्था के दौरान दिखाई के तंत्रिका फाइबर की दिशाओं का संकेत है । स्केल बार: 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. इस बिंदु पर रक्तस्राव क्रैनिओटॉमी में मस्तिष्क के ऊतकों की दृश्यता को प्रभावित करेगा। 1x पीबीएस लागू करें, कोमल सक्शन के बाद, जबकि रक्त से छुटकारा पाने के लिए प्रांतस्था को एस्पिरेशन करें।
    नोट: इस चरण के दौरान निरंतर रक्तस्राव अपरिहार्य है, और कुछ हद तक, लगातार रक्तस्राव सामान्य रक्तचाप का संकेत है। कॉर्टेक्स इमेजिंग विंडो प्रत्यारोपण के विपरीत, ऑप्टिकल विंडो के नीचे रक्त की उपस्थिति स्वीकार्य है क्योंकि यह सर्जरी के कई दिनों बाद साफ हो जाएगा। कॉर्टेक्स को एब्लेटिंग करने के बाद जितनी जल्दी हो सके बनाए गए गुहा में इमेजिंग कैनुला का सम्मिलन इष्टतम है।
  2. यदि क्रैनिओटॉमी इमेजिंग कैनुला की तुलना में <0.5 मिमी से बड़ा है, तो सुपरबॉन्ड के साथ प्रत्यारोपण को ठीक करने से पहले अतिरिक्त क्विक सिल सीलिंग का उपयोग करके कैनुला की स्थापना को कुछ हद तक बचाएं।
  3. यदि क्रैनिओटॉमी इमेजिंग कैनुला की तुलना में <0.5 मिमी से छोटा है, तो एक ठीक चिमटी या नेत्र कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके क्रेनियोटॉमी के किनारे को ट्रिम करके कुछ हद तक सर्जिकल प्रक्रिया को बचाएं क्योंकि क्रैनिओटॉमी के किनारे पर शेष हड्डी ड्रिलिंग के परिणामस्वरूप खोपड़ी से पतली है।
    नोट: 0.5 मिमी से ऊपर की श्रेणियों से अधिक हैं, जो Craniotomies बचाया नहीं जा सकता है। उन मामलों में इसी कार्रवाई पशु प्रोटोकॉल के अनुसार समाप्ति प्रक्रिया का पालन करना चाहिए ।
  1. धीरे-धीरे इम्प्लांट को क्रैनिओटॉमी में डालें।
  2. दृढ़ता से एल के आकार की सुई के साथ प्रत्यारोपण के शीर्ष पर प्रेस के रूप में हिप्पोकैम्पस के उजागर सतह के लिए संभव के रूप में बंद प्रत्यारोपण की ऑप्टिकल खिड़की की स्थिति । बार-बार प्रत्यारोपण के आसपास खोपड़ी पर पीबीएस लागू करें और इसके बाद सक्शन द्वारा प्रत्यारोपण प्रविष्टि के दौरान जितना संभव हो रक्त को हटाने के लिए। फिर खोपड़ी(चित्रा 4)के नीचे मर्मज्ञ से दंत सीमेंट को रोकने के लिए प्रत्यारोपण और खोपड़ी के बीच Kwik सिल की एक पतली परत लागू करें ।
    1. सुनिश्चित करें कि प्रत्यारोपण की ऑप्टिकल खिड़की की नियुक्ति नीचे रक्त या अन्य तरल संचय से बचने के लिए हिप्पोकैम्पस के खिलाफ सही है।
      नोट: महत्वपूर्ण बिंदु यह सुनिश्चित करना है कि इमेजिंग कैनुला का कवर ग्लास हिप्पोकैम्पस के खिलाफ सही रखा गया है, जिसे स्थापना और सीलिंग प्रक्रिया के दौरान कैनुला के शीर्ष पर कोमल दबाव की आवश्यकता हो सकती है। क्या इमेजिंग कैनुला के ऊपरी हिस्से खोपड़ी के समानांतर है जब तक ऑप्टिकल खिड़की हिप्पोकैम्पस के खिलाफ रखा जाता है, तब तक अंतिम ऑप्टिकल एक्सेस के लिए महत्वपूर्ण नहीं है।
    2. CA1 क्षेत्र के ऊपर प्रांतस्था की औसत मोटाई के अनुसार, खोपड़ी की सतह के ऊपर इमेजिंग कैनुला की ऊपरी सतह को ~ 0.5 मिमी तक रखें ताकि खोपड़ी(चित्रा 4)में कैनुला के लगाव को सुविधाजनक बनाया जा सके।
  3. एक बार क्विक सिल ठीक हो जाने के बाद, जो आमतौर पर ~ 1 मिनट से अधिक नहीं लेता है, तो खोपड़ी की सतह, क्विक-सिल की सतह और प्रत्यारोपण की ऊपरी सतह पर सुपर-बॉन्ड सीएंडबी समान रूप से लागू करें।
  4. एक बार सुपर बॉन्ड सीएंडबी ठीक हो जाने के बाद सुपर-बॉन्ड सीएंडबी के ऊपर डेन्चर बेस राल लगाएं, साथ ही सर्जरी की शुरुआत में किए गए चीरा के आसपास की त्वचा को भी लगाएं ।
    नोट: सीमेंट के वैकल्पिक प्रकार के कई विक्रेताओं से उपलब्ध हैं । संबंधित निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
  5. डेन्चर बेस राल ठीक होने के बाद, सिर की प्लेट को प्रत्यारोपण के चारों ओर राल पर रखें और इमेजिंग कैनुला के साथ गाढ़ा बनाएं। अपनी स्थिति को ठीक करने के लिए सिर की प्लेट के चारों ओर और ऊपर अधिक डेन्चर बेस राल लागू करें। इसे कई मिनट तक ठीक होने दें।
    1. उद्देश्य लेंस(चित्रा 4)के साथ इमेजिंग खिड़की तक बेहतर पहुंच सुनिश्चित करने के लिए कैनुला के चारों ओर सीमेंट की एक मोटी परत बनाने से बचें।

Figure 4
चित्रा 4:(ए) कोरोनल और (बी) sagittal दृश्य में खिड़की प्रत्यारोपण के योजनाबद्ध आरेख । (क)हैम्पलेट; (ख)डेन्चर बेस राल; (ग)सुपरबोंड; (घ)क्विक-सिल; (ङ)इमेजिंग कैनुला; (च)इंजेक्शन कैनुला; (जी)टांका टिन। (ग):सर्जरी के बाद स्थापित प्रत्यारोपण के साथ माउस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. डेन्चर बेस राल को अपनी चिपचिपाहट को कम करने के लिए पतला करें, इस प्रकार इसे चेतावनी भरने की अनुमति देता है जो एक एप्लिकेटर के साथ पहुंचना मुश्किल है।
  1. धीरे-धीरे खिड़की के ऊपर एक अछूता रबर टेप रखें ताकि खिड़की को पशु बिस्तर से संभावित प्रदूषण से बचाया जा सके।
  2. जब सर्जरी समाप्त हो जाती है, तो भड़काऊ प्रतिक्रिया को रोकने के लिए विरोधी भड़काऊ दवा को चमड़े के साथ इंजेक्ट करें।
  3. जानवर को एक गर्म पिंजरे में रखें जब तक कि यह संज्ञाहरण से ठीक न हो जाए।
  4. सामान्य व्यवहार को देख कर 72 घंटे के बाद सर्जरी के लिए माउस की स्वास्थ्य स्थिति की जांच करें। दर्द को छोड़ने और भड़काऊ प्रतिक्रिया को कम करने के लिए हर 24 घंटे में दो-तीन दिनों के बाद सर्जरी के लिए एंटी-भड़काऊ दवा और एनाल्जेसिक को सुस्कुटा इंजेक्शन दिया जाता है।
    नोट: वैकल्पिक निगरानी प्रक्रियाओं, दवाओं, और खुराक पश्चात देखभाल के लिए संभव हैं, सटीक प्रक्रिया के लिए IUCAC अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल का उल्लेख है ।
  5. खिड़की के नीचे वास्कुलेचर का निरीक्षण करने के लिए 5-7 दिन बाद सर्जरी की जांच करें। एक स्पष्ट खिड़की के मामले में, जानवर वायरस इंजेक्शन के लिए तैयार है।

3. वायरस इंजेक्शन

नोट: वायरस इंजेक्शन आमतौर पर सर्जरी के बाद 5-7 दिनों में किया जाता है। वायरस इंजेक्शन से पहले, यह पुष्टि की जानी चाहिए कि इमेजिंग खिड़की स्पष्ट है, और मस्तिष्क वास्कुलेचर(चित्रा 5)का निरीक्षण करना संभव है। कुछ मामलों में, खिड़की को साफ करने में 14-16 दिनों तक का समय लग सकता है, जो मस्तिष्क की सूजन का पता नहीं चलने पर भी स्वीकार्य है।

Figure 5
चित्रा 5:फास्टग्रीन डाई के साथ पूरक वायरस इंजेक्शन के बाद ऑप्टिकल विंडो (ए) से पहले और (बी) की प्रतिनिधि छवि। तीर एक ही वाक्यूलेचर संरचना को इंगित करता है। स्केल बार: 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. एक पीसीआर ट्यूब में 1:9 के अनुपात में, वांछित टिटर के लिए पतला, वायरस समाधान के लिए तेजी से हरे रंग की डाई स्टॉक समाधान जोड़ें।
    नोट: इंजेक्शन के दौरान वायरस समाधान के दृश्य की सुविधा के लिए फास्ट ग्रीन डाई जोड़ा जाता है।
  2. सिरिंज के साथ पॉलीथीन ट्यूबिंग कनेक्ट करें, फिर सिरिंज पंप का उपयोग करके खनिज तेल के साथ ट्यूबिंग को बैकफिल करें।
  3. आंतरिक कैनुला को टयूबिंग के दूसरे छोर से कनेक्ट करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि आंतरिक कैनुला भरा हुआ नहीं है, खनिज तेल को कई बार डालने और वापस लें।
  4. आइसोफ्लुनाणे (प्रेरण के लिए 4%, बनाए रखने के लिए 1.5-2%, हवा की 0.3-0.5 एल/मिन प्रवाह दर) के साथ जानवर को एनेस्थेटाइज करें, एक हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस को बनाए रखने) पर स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में सिर को ठीक करें, आंखों का मरहम लगाएं।
  5. वायरस समाधान के 600 एनएम निकालें, डमी कैनुला को हटा दें और इंजेक्शन सिरिंज से जुड़े आंतरिक कैनुला को गाइड कैनुला में डालें, कुल 10 मिनट के लिए 50 एनएल/मिनट की गति से वायरस को बढ़ावा दें।
    नोट: जांच करें कि क्या डाई सफल वायरस इंजेक्शन(चित्रा 5)की पुष्टि करने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके खिड़की के माध्यम से दिखाई दे रही है।
  6. इंजेक्शन के बाद, आंतरिक कैनुला को 10 मिनट तक जुड़ा रखें ताकि वायरस खिड़की के नीचे फैल सके।
  7. धीरे-धीरे गाइड कैनुला से आंतरिक कैनुला को हटा दें और इसे डमी कैनुला के साथ संक्षिप्त करें।
  8. जानवर को एक गर्म पिंजरे में तब तक रखें जब तक कि यह संज्ञाहरण से ठीक न हो जाए।
    नोट: आमतौर पर, चूहों वायरल इंजेक्शन के बाद 10-20 दिनों में इमेजिंग के लिए तैयार हैं । अभिव्यक्ति का स्तर और समय जीन अभिव्यक्ति को चलाने के लिए उपयोग किए जाने वाले वायरस सेरोटाइप और प्रमोटर पर निर्भर करता है।

4. चौड़े क्षेत्र माइक्रोस्कोप के नीचे जाग चूहों की इमेजिंग।

नोट: तैयार सिर प्लेट इमेजिंग प्रत्यारोपण की असाधारण स्थिरता प्रदान करता है और इस तरह जाग में देशांतर इमेजिंग के लिए अनुमति देता है और ंयूनतम गति कलाकृतियों के साथ चूहों व्यवहार ।

  1. माउस को कुछ मिनटों के लिए 4% आइसोफ्लुनान के साथ प्रेरित करें, सिर के कांटा पर अपनी सिर की प्लेट को ठीक करें, और फिर सिर के कांटा को ट्रेडमिल में ठीक करें।
    नोट: सिर कांटा और ट्रेडमिल इस अध्ययन में इस्तेमाल हेडप्लेट के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, कृपया इसी सीएडी फ़ाइलों के लिए समर्थन सामग्री देखते हैं । सिर निर्धारण से पहले माउस का प्रेरण वैकल्पिक है क्योंकि इस प्रक्रिया के लिए जानवर को आदत देना संभव है।
  2. माइक्रोस्कोप चरण के नीचे ट्रेडमिल ले जाएँ और उद्देश्य लेंस के तहत ऑप्टिकल खिड़की की स्थिति।
  3. कार्यात्मक इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा क्षेत्र देखने (FOV) खोजने के लिए एक कम आवर्धन उद्देश्य लेंस का उपयोग करें, तो एकल सेल संकल्प पर न्यूरोनल गतिविधियों को रिकॉर्ड करने के लिए एक उच्च एनए उद्देश्य लेंस पर स्विच करें।
    नोट: यदि इंजेक्शन कैनुला अभी भी उद्देश्य लेंस के लिए एक बाधा के लिए अपनी काम की दूरी को प्राप्त करने के लिए है, एक तार क्लिपर का उपयोग करने के लिए सिर की थाली से इंजेक्शन cannula काट ।

Representative Results

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम इंडिकेटर का उपयोग करके न्यूरोनल गतिविधि की वीवो इमेजिंग में। औसतन, वीवो इमेजिंग प्रत्यारोपण के बाद 3-4 सप्ताह शुरू होता है यदि ट्रांसजीन अभिव्यक्ति का पर्याप्त स्तर हासिल किया जाता है। इस समय तक, सेरेब्रल एडिमा और नकसीर आमतौर पर पूरी तरह से हल हो जाते हैं, और ऑप्टिकल विंडो के माध्यम से मस्तिष्क संवध आसानी से देखा जा सकता है। यहां हमने फ्लोरेसेंस वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोप के तहत चूहों के व्यवहार में पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस CA1 क्षेत्र में न्यूरोनल गतिविधि की दोहराई गई रिकॉर्डिंग करने के लिए वर्णित तैयारी का उपयोग किया। न्यूरोनल गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए, हमने एक उज्ज्वल आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक का उपयोग किया, जिसका नाम एनसीएएमपी7 13था, जो GCaMP6s14के समान कैल्शियम संवेदनशीलता और लौकिक संकल्प को प्रदर्शित करता है। हिप्पोकैम्पस में NCaMP7 संकेतक व्यक्त करने के लिए, हम एक जलसेक cannula का उपयोग कर rAAV/डीजे-CAG-NCaMP7 वायरस इंजेक्शन और 14 दिनों के बाद इंजेक्शन पर देशांतर इमेजिंग शुरू की । न्यूरोनल गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए, हमने 10x एनए 0.3 एयर ऑब्जेक्टिव लेंस और हमामात्सु ऑर्कैफ्यूजन एसएमओएस कैमरे का उपयोग किया जो ~ 1.5x1.5 मिमी एफओवी पर इमेजिंग की अनुमति देता है। ग्रीन फ्लोरेसेंस एक मानक जीएफपी फिल्टर सेट का उपयोग करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 470 एनएम एलईडी से उत्साहित था। ग्रीन चैनल में प्राप्त इमेजिंग की औसत गहराई लगभग 50-120 माइक्रोन है, जो मुख्य रूप से स्ट्रैटम ओरियंस और स्ट्रैटम पिरामिड में न्यूरोनल गतिविधि की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। निकट अवरक्त चैनलों में इमेजिंग गहराई 200 माइक्रोन तक हो सकती है जो हिप्पोकैम्पस8की गहरी परतों तक पहुंच सकती है। FOV प्रति औसत रिकॉर्डिंग समय 6-12 मिनट था, हालांकि बहुत लंबे इमेजिंग सत्र संभव हैं क्योंकि एनसीएएमपी 7 को बेहद उच्च फोटोस्थेता की विशेषता है और कोई पता लगाने योग्य फोटोटॉक्सिकिटी(चित्रा 6)नहीं देखी गई थी।

Figure 6
चित्र 6:हरे रंग के फ्लोरोसेंस का उपयोग करके हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में न्यूरोनल गतिविधि की रिकॉर्डिंग आनुवंशिक रूप से इनकोडेड कैल्शियम संकेतक। (क)ग्रीन चैनल में एक विस्तृत क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत एक चयनित एफओवी इमेज्ड। (ख)एक में दिखाए गए एकल न्यूरॉन्स के अनुरूप 15 आरओआई और पूरी रिकॉर्डिंग के मानक विचलन प्रक्षेपण का उपयोग करके चुना गया । (ग)प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस बी में 15 चयनित न्यूरॉन्स के एकल परीक्षण निशान(D)एक प्रतिनिधि ज़ूम-सी स्केल बार, १०० माइक्रोन में दिखाए गए संबंधित रंग बक्से में दिखाए गए 2 कैल्शियम निशान को देखते हुए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फ्लोरेसेंस निशान प्राप्त करने के लिए, न्यूरोनल सोमस के अनुरूप ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों को मैन्युअल रूप से खंडित किया गया था और इमेजजे सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किया गया था। छवि विश्लेषण गति सुधार से पहले, जाग जानवरों में आम पोस्ट-रिकॉर्डिंग प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं थी क्योंकि अधिग्रहीत डेटासेट ने इमेजिंग प्रत्यारोपण की उच्च स्थिरता के कारण गति कलाकृतियों का प्रदर्शन नहीं किया था। एक जाग व्यवहार माउस में हिप्पोकैम्पस से न्यूरोनल गतिविधियों की एक प्रतिनिधि एकल परीक्षण ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग चित्र 6में प्रस्तुत किया जाता है । 15 न्यूरोनल सोमस के अनुरूप आरओआई को चित्रा 6बीमें दिखाए गए एक ही FOV से मैन्युअल रूप से चुना गया था, और प्रत्येक आरओआई के भीतर एकल परीक्षण फ्लोरेसेंस निशान चित्र 6Cमें दिखाए गए हैं। चित्रा 6D दो अलग-अलग आरओआई से फ्लोरेसेंस निशान के दो प्रतिनिधि भागों से पता चलता है। हमने 3 दिन के अंतराल के साथ एक ही FOV के लिए लगातार 4 इमेजिंग सत्र किए। कम से कम दो सप्ताह तक कुछ एफओवी में एक ही न्यूरॉन्स की पहचान करना और छवि बनाना संभव था (इस अध्ययन के लिए लंबे इमेजिंग सत्र नहीं किए गए थे, हालांकि, चूहों में पहले 6 महीने तक इमेजिंग अध्ययन के लिए एक ही तैयारी का उपयोग किया गया है7; चित्रा 7)। इस अध्ययन में, हमने AAV/DJ-CAG वेक्टर का इस्तेमाल किया, जो वायरस डिलीवरी(अनुपूरक चित्रा 1)के 21 दिन बाद भी ब्याज के जीन की एक मजबूत अभिव्यक्ति चला रहा था । कैल्शियम संकेतक व्यक्त करने वाले नए न्यूरॉन्स की उपस्थिति में वृद्धि के कारण एक ही न्यूरॉन्स की निरंतर अभिव्यक्ति जटिल दीर्घकालिक पहचान। इसलिए, लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए एएवी सेरोटाइप और प्रमोटर का चयन विशेष रूप से प्रयोगात्मक डिजाइन के दौरान महत्वपूर्ण विचारों में से एक होना चाहिए यदि न्यूरॉन्स के एक ही सबसेट की देशांतर इमेजिंग की आवश्यकता है। इमेजिंग गुणवत्ता को समीपस्थ dendrites को हल करने के साथ ही रक्त वाहिकाओं की कल्पना करने की अनुमति दी ।

Figure 7
चित्रा 7:हिप्पोकैम्पस क्षेत्र से चार अलग-अलग FOVs का छवि अनुक्रम 12 दिनों में ट्रैक किया गया। जानवर 0 दिन पर खिड़की के साथ प्रत्यारोपित किया गया था और 7 दिन पर rAAV/डीजे-CAG-NCaMP7 वायरस के साथ इंजेक्शन था । एरोहेड एफओवी के भीतर ट्रैक किए गए न्यूरॉन को इंगित करते हैं। स्केल बार: 80 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड वोल्टेज सेंसर का उपयोग करके न्यूरोनल गतिविधि की वीवो इमेजिंग में।
इस अध्ययन में, हमने एक उपन्यास आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड वोल्टेज सेंसर का भी उपयोग किया, जिसका नाम सोमआर्कॉन7है, जो जानवरों के व्यवहार में एकल-कोशिका एकल-स्पाइक संकल्प के साथ वोल्टेज इमेजिंग की अनुमति देता है7,8। सोमआर्कॉन को व्यक्त करने के लिए, हमने एक जलसेक कैनुला का उपयोग करके rAAV/DJ-CAG-सोमआर्कॉन वायरस का इंजेक्शन लगाया और इंजेक्शन के कई दिनों बाद सिर-निश्चित व्यवहार माउस में वोल्टेज इमेजिंग का प्रदर्शन किया। न्यूरोनल गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए, हमने 40x एनए 0.8 ऑब्जेक्टिव लेंस और हमामात्सु ऑर्क्फ्यूजन एसएमओएस कैमरे का उपयोग किया जिसने हमें 830 हर्टेज अधिग्रहण दर पर 150x40 माइक्रोन एफओवी की छवि बनाने की अनुमति दी। जीएफपी प्रोटीन, जो सोमआर्कॉन का एक हिस्सा स्पेक्ट्रम की दृश्य सीमा में अभिव्यक्ति के दृश्य को सुविधाजनक बनाने के लिए निर्माण करता है, को वोल्टेज इमेजिंग के लिए ब्याज की कोशिकाओं का पता लगाने के लिए ग्रीन चैनल (470/20 एनएम पर एलईडी एक्सटिटेशन, उत्सर्जन 525/50 एनएम) में आसानी से इमेज किया जा सकता है । ऑप्टिकल वोल्टेज रिकॉर्डिंग के पास अवरक्त चैनल में किया गया (लेजर एक्सटिटेशन 637 एनएम 3.4डब्ल्यू/मिमी 2,उत्सर्जन 665 एनएम लंबे पास) 830 हर्ट एक्ज एक्विजिशन रेट पर 4 x 4 बिनिंग के साथ। हम कार्रवाई क्षमता प्रति 7 के औसत एसएनआर के साथ एक जाग माउस में एक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन की सहज गतिविधि दर्ज की गई(चित्रा 8)।

Figure 8
चित्रा 8:एक के पास अवरक्त फ्लोरेसेंस आनुवंशिक रूप से इनकोडेड वोल्टेज संकेतक सोमआर्कॉन का उपयोग कर हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में न्यूरोनल गतिविधि की रिकॉर्डिंग। (A)नियर-इन्फ्रारेड चैनल में वाइड-फील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत इमेज्ड एक चयनित एफओवी । (B)बी स्केल बार में दिखाए गए संबंधित बॉक्स में वोल्टेज ट्रेस को देखतेहुएएक प्रतिनिधि जूम-इन में न्यूरॉन का सिंगल-ट्रायल फ्लोरेसेंस ट्रेस: 25 माइक्रोन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रोटोकॉल
कार्यात्मक इमेजिंग अध्ययन के बाद किया जाता है, पोस्टमार्टम विश्लेषण प्रत्यारोपण के सही प्लेसमेंट की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है, वायरस अभिव्यक्ति के क्षेत्र, और छवि न्यूरॉन्स में रुचि के प्रोटीन के स्थानीयकरण । वायरस अभिव्यक्ति और प्रत्यारोपण के प्लेसमेंट के हिस्टोलॉजिकल सत्यापन के लिए, पीएफए फिक्स्ड ब्रेन के कोरोनल वर्गों की जांच फ्लोरेसेंस वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोप(चित्रा 9 ए, सी)के तहत की गई थी । कैल्शियम संकेतक व्यक्त करने वाले व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों के साथ-साथ वोल्टेज संकेतक(चित्रा 9B,D)प्राप्त करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था। दापी धुंधला मस्तिष्क टुकड़ा के समग्र आकृति विज्ञान कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, मस्तिष्क के स्लाइस का आकलन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके खिड़की प्रत्यारोपण और वायरल अभिव्यक्ति के कारण एस्ट्रोग्लियोसिस या ग्लियोसिस को सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है। हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला कि प्रक्रिया ने ध्यान देने योग्य ग्लियोसिस7को प्रेरित नहीं किया ।

Figure 9
चित्र 9:ऑप्टिकल विंडो पोजीशन और वायरस एक्सप्रेशन का हिस्टोलॉजिकल वेरिफिकेशन। (ए)कोरोनल सेक्शन ब्रेन स्लाइस की एक प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट इमेज जिसमें एनसीएएमपी-एक्सप्रेसिंग माउस से ऑप्टिकल विंडो का प्लेसमेंट दिखाया गया है । स्केल बार: 1 मिमी(बी)NCaMP7 संकेतकों को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की एक प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवि। स्केल बार: 25 माइक्रोन(ग)कोरोनल सेक्शन ब्रेन स्लाइस की एक प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस इमेज जो सोमआर्कॉन-एक्सप्रेसिंग माउस से ऑप्टिकल विंडो की प्लेसमेंट दिखाती है। स्केल बार: 1 मिमी(D)सोमआर्कॉन संकेतकों को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स की एक प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवि। स्केल बार: 25 माइक्रोन करें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्र 1:अभिव्यक्ति समय के साथ सापेक्ष फ्लोरेसेंस तीव्रता का मात्रात्मक विश्लेषण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां हम चूहों के व्यवहार में हिप्पोकैम्पस CA1 क्षेत्र की दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। विधि एक कस्टम निर्मित इमेजिंग खिड़की के पुराने प्रत्यारोपण पर आधारित है, जो वायरस या दवाओं के लक्षित प्रशासन को सीधे ब्याज के न्यूरॉन्स तक भी सक्षम बनाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में चार प्रमुख भाग होते हैं: i) इमेजिंग प्रत्यारोपण का कोडांतरण; ii) इमेजिंग प्रत्यारोपण की स्थापना; iii) इमेजिंग प्रत्यारोपण के माध्यम से वायरस इंजेक्शन; iv) चूहों के व्यवहार में कार्यात्मक इमेजिंग। नीचे हम प्रोटोकॉल, समस्या निवारण, संशोधनों और विधि की सीमाओं में महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन और चर्चा करते हैं। हम विधि के महत्व और इसके संभावित वैकल्पिक अनुप्रयोगों पर भी चर्चा करते हैं ।

वर्णित प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जो सफल सर्जरी के लिए महत्वपूर्ण हैं: (i) उच्च गुणवत्ता वाले इमेजिंग प्रत्यारोपण की तैयारी; (ii) बाँझ शल्य चिकित्सा की स्थिति; (iii) कॉर्टेक्स की आकांक्षा; (iv) इमेजिंग इंप्लांट का सटीक रखना; 5 वायरल इंजेक्शन। जैसा कि चरण 1.6 इंगित करता है, अतिरिक्त टांका टिन को एक बड़ा क्रैनिओटॉमी की आवश्यकता होगी और इस प्रकार सूजन का खतरा बढ़ जाता है। इमेजिंग कैनुला में कवर ग्लास को ठीक करते समय चिपकने वाले ऑप्टिकल गोंद की उचित मात्रा का उपयोग करना भी बहुत महत्वपूर्ण है, जैसा कि चरण 1.11 में इंगित किया गया है, क्योंकि अपर्याप्त राशि के परिणामस्वरूप इमेजिंग कैनुला में सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ का रिसाव हो सकता है और इसे अपारदर्शी बना सकते हैं। दूसरी ओर, अतिरिक्त ऑप्टिकल चिपकने वाला कांच की खिड़की की पारदर्शिता में कमी कर सकता है। इमेजिंग प्रत्यारोपण के संभावित संदूषण ऑप्टिकल खिड़की और/या गंभीर सूजन के तहत संयोजी ऊतक के एक सक्रिय प्रसार का कारण बन सकता है, जो प्रयोग की जल्दी समाप्ति के लिए नेतृत्व करेंगे । इसलिए, इमेजिंग प्रत्यारोपण कोडांतरण और सर्जरी से पहले तैयारी लगभग शल्य प्रक्रिया के रूप में ही महत्वपूर्ण है ।

सर्जरी के दौरान, क्रैनिओटॉमी के तहत कॉर्टेक्स का हिस्सा कोमल आकांक्षा द्वारा एब्लेटेड होता है, जिसके परिणामस्वरूप अपरिहार्य रक्तस्राव होता है। शल्य चिकित्सा साइट पर रक्त काफी मस्तिष्क के ऊतकों की दृश्यता है कि हटा दिया जाना चाहिए कम कर देता है । यह ऊतक एब्लेशन की आवश्यक गहराई का सटीक आकलन जटिल बना देता है। ऊतक के अगले हिस्से को हटाने के लिए सक्शन लागू करने से पहले हर बार पीबीएस के साथ सर्जिकल साइट का सावधानीपूर्वक फ्लशिंग गहराई का बेहतर नियंत्रण प्रदान करता है। मस्तिष्क के ऊतकों को हमेशा अधिक सक्शन के साथ आगे बढ़ने से पहले एब्लेटेड ऊतक की गहराई की पुष्टि करते हुए कदम-दर-कदम छोटे भागों में हटा दिया जाना चाहिए। सक्शन का महीन नियंत्रण भी पतले कुंद सुई के साथ प्राप्त किया जा सकता है। हम 26 जी सुई का उपयोग करने का सुझाव देते हैं, हालांकि, 26 जी व्यास से छोटा है, जो क्लोजिंग से अधिक प्रवण है। इसके अलावा, यह आमतौर पर प्रत्येक जानवर के लिए आवश्यक आकांक्षा की सटीक गहराई निर्धारित करने के लिए बहुत सारे अभ्यास लेता है, क्योंकि कॉर्टेक्स, कॉर्पस कैलोसम और हिप्पोकैम्पस का रंग माउस से माउस(चित्रा 3)में भिन्न हो सकता है।

इमेजिंग प्रत्यारोपण की प्रविष्टि और सुरक्षा हिप्पोकैम्पस की पृष्ठीय सतह के लिए इमेजिंग खिड़की की निकटतम संभव स्थिति सुनिश्चित करने के लिए बहुत ठीक किया जाना चाहिए। तैयार क्रैनियोटॉमी का आकार प्रत्यारोपण से निकटता से मेल खाने चाहिए और महत्वपूर्ण प्रतिरोध के बिना इसकी प्रविष्टि की अनुमति देना चाहिए। साथ ही, उचित सीलिंग सुनिश्चित करने और मस्तिष्क के ऊतकों के संपर्क से बचने के लिए खोपड़ी और प्रत्यारोपण के बीच कोई दृश्यमान अंतर नहीं होना चाहिए। खोपड़ी को सील करने के दौरान प्रत्यारोपण के शीर्ष पर कोमल और स्थिर दबाव लागू किया जाना चाहिए। इंप्लांट लगाने के दौरान इमेजिंग विंडो के नीचे खून होना लगभग अपरिहार्य है। यदि शल्य प्रक्रिया ठीक से की जाती है, तो खिड़की को 3-7 दिनों में साफ़ करना चाहिए, और मस्तिष्क वाक्यूलेचर स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि वायरस को खिड़की के नीचे ठीक से इंजेक्ट किया जाए । असफल अभिव्यक्ति के मामले में, वायरस को कई बार फिर से इंजेक्ट किया जा सकता है।

प्रमुख जटिलता हम कुछ मामलों में सामना करना पड़ा इमेजिंग खिड़की की दृश्यता कम है । खराब इमेजिंग गुणवत्ता के कई संभावित कारण हैं: i) चल रही सूजन; ii) कांच पर संयोजी ऊतक की वृद्धि; iii) खिड़की और हिप्पोकैम्पस के बीच बड़ा अंतर। सूजन आमतौर पर सर्जरी के दौरान संदूषण या ठीक से निष्फल इमेजिंग प्रत्यारोपण नहीं द्वारा होती है। हम प्रत्येक सर्जरी से पहले और बाद में सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेविंग करने का सुझाव देते हैं, प्रक्रिया से ठीक पहले सर्जरी क्षेत्र को कीटाणुरहित करते हैं, और सर्जरी के दौरान स्वच्छ व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं। इमेजिंग प्रत्यारोपण कोडांतरण, निष्फल, और बाँझ परिस्थितियों में संग्रहीत करने के बाद साफ किया जाना चाहिए। इमेजिंग प्रत्यारोपण के गिलास पर संयोजी ऊतक की वृद्धि कांच की सतह पर यांत्रिक संदूषण या प्रांतस्था एब्लेशन के दौरान मस्तिष्क के ऊतकों के अत्यधिक आघात के कारण हो सकती है। प्रत्यारोपण कोडांतरण के बाद, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कांच की सतह साफ और चिकनी है । इसके अलावा, क्षतिग्रस्त मस्तिष्क ऊतक के सभी टुकड़ों को क्रेनियोटॉमी में इमेजिंग प्रत्यारोपण डालने से पहले ध्यान से हटा दिया जाना चाहिए। कुछ मामलों में, ग्लास खिड़की और हिप्पोकैम्पस के बीच अंतर के परिणामस्वरूप सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ का संचय होता है, जिससे इमेजिंग की गुणवत्ता कम हो जाती है। इसलिए, प्रत्यारोपण स्थापना के दौरान, हिप्पोकैम्पस और ग्लास विंडो के बीच अच्छा संपर्क सुनिश्चित करने में इसे सभी तरह से सम्मिलित करना महत्वपूर्ण है। कभी-कभी, अपारदर्शी इमेजिंग विंडो के सही कारण की पहचान करना मुश्किल होता है। हम ऑप्टिकल विंडो के तहत स्थितियों को प्रकट करने और तदनुसार बाद की सर्जरी को समायोजित करने के लिए पोस्टमार्टम विश्लेषण करने का सुझाव देते हैं।

विधि में कई मौलिक और तकनीकी सीमाएं हैं जिन्हें वीवो इमेजिंग से पहले और दौरान ध्यान में रखा जाना चाहिए। प्रमुख सीमाओं में से एक कॉर्टेक्स एब्लेशन है। सर्जरी के दौरान दृश्य और संवेदी प्रांतस्था का हिस्सा हटा दिया जाता है। हालांकि कॉर्टेक्स एब्लेशन के प्रभाव का ठीक से मूल्यांकन करना मुश्किल है, क्योंकि हटाए गए मस्तिष्क ऊतक सीधे हिप्पोकैम्पस पर प्रोजेक्ट नहीं करते हैं, कई अध्ययनों ने हिप्पोकैम्पस पर निर्भर सीखने या अन्य प्रासंगिक हिप्पोकैम्पस कार्यों15,16की कोई उल्लेखनीय हानि का प्रदर्शन नहीं किया। ऑप्टिकल सीमाओं पर भी विचार किया जाना चाहिए, खासकर जब उच्च एनए उद्देश्य लेंस का उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में, हमने 1.9 मिमी आंतरिक व्यास के साथ 1.75 मिमी लंबी कैनुला का उपयोग किया। इस कैनुला की ज्यामिति ~ 0.5 से अधिक एनए के साथ हवा के उद्देश्य की पूर्ण एनए को संरक्षित नहीं करेगी या ~ 0.6 से अधिक एनए के साथ पानी के उद्देश्य के रूप में यह कुछ प्रकाश को क्लिप करेगा। एक और सीमा, सभी मस्तिष्क इमेजिंग प्रत्यारोपण के लिए आम है, कि मस्तिष्क का हिस्सा उजागर हो रही है, इस प्रकार गर्मी हानि को बढ़ावा देने17,18। हालांकि, एक गर्म बफर के परफ्यूजन द्वारा इमेजिंग के दौरान शारीरिक मस्तिष्क के तापमान को आसानी से बहाल किया जा सकता है।

वर्णित विधि को अन्य अनुप्रयोगों के लिए आसानी से संशोधित या समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, स्ट्राटम7की इमेजिंग के लिए तैयारी को अनुकूलित किया जा सकता है। चूंकि स्ट्राटम हिप्पोकैम्पस की तुलना में थोड़ा गहरा देता है, इसलिए इमेजिंग प्रत्यारोपण को कोडांतरण के लिए अब इमेजिंग कैनुला का उपयोग किया जाना चाहिए। हम 2.0 मिमी इमेजिंग कैनुला का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। क्रैनिओटॉमी के निर्देशांक को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए (एपी: +0.8 मिमी, एमएल: − 1.8 मिमी)। इसके अलावा, जलसेक कैनुला के माध्यम से वायरस इंजेक्शन प्रतिबंधित प्रसार19,20के साथ एएवी सीरोटाइप का उपयोग करते समय न्यूरॉन्स की पतली परत में ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति को प्राप्त करने की अनुमति देता है। यह गहरी परतों से कम आउट-ऑफ-फोकस फ्लोरेसेंस के कारण एक-फोटॉन इमेजिंग के लिए विशेष रूप से फायदेमंद है और नतीजतन, एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग में सुधार हुआ है। इसके अलावा, इंजेक्शन कैनुला का उपयोग दवाओं या अन्य रसायनों के प्रशासन के लिए कार्यात्मक इमेजिंग के दौरान सीधे एफओवी(चित्रा 5B)में न्यूरॉन्स पर किया जा सकता है। कुल मिलाकर जलसेक कैनुला इमेजिंग प्रत्यारोपण के लिए उपयोगी कार्यक्षमताओं को जोड़ता है, लक्षित वायरल अभिव्यक्ति के कारण इमेजिंग गुणवत्ता में सुधार और एफओवी में न्यूरॉन्स की औषधीय उत्तेजना को सक्षम करता है। इस्तेमाल किया सिर प्लेट इमेजिंग प्रत्यारोपण की असाधारण स्थिरता प्रदान करता है यहां तक कि सक्रिय रूप से एक ट्रेडमिल पर चलती जानवरों में गति कलाकृतियों को कम करने । सिर की प्लेट छोटी और हल्की होती है, जिससे जानवरों को न्यूनतम असुविधा होती है, और स्थापना के बाद कई महीनों तक स्थिर रहती है। इमेजिंग इंप्लांट मल्टीफोटो इमेजिंग15 , 16,21के साथ भी संगत है और इसे माइक्रो एंडोस्कोप22, 23के साथ जोड़ा जा सकता है। इसी तरह के इमेजिंग इंप्लांट का उपयोग गहरे हिप्पोकैम्पस संरचनाओं की मल्टीफोटॉन इमेजिंग के लिए भी किया जाता था, जिसमें स्ट्रैटम रेडिएटम, स्ट्रैटम लैक्नोस और डेंटेट जाइरस16,24,25,26, 27शामिल थे। हालांकि, जलसेक कैनुला के माध्यम से एएवी के साथ गहरी हिप्पोकैम्पस संरचनाओं को लक्षित करने के लिए एएवी सेरोटाइप और वॉल्यूम19के आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

हमारा मानना है कि वर्णित प्रोटोकॉल उन अध्ययनों को सुविधाजनक बनाएगा जिनका उद्देश्य सरल और किफायती वन-फोटॉन इमेजिंग सेटअप का उपयोग करके चूहों के व्यवहार के हिप्पोकैम्पस में उच्च स्थानिक संकल्प के साथ न्यूरोनल गतिविधि की जांच करना है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम वेस्टलेक विश्वविद्यालय में आणविक बायोइंजीनियरिंग समूह के सभी सदस्यों को सभी मदद और उपयोगी चर्चा के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । हम सर्जिकल प्रक्रिया को फिल्माने में मदद के लिए वेस्टलेक यूनिवर्सिटी से जिंज ली और जिया-मिन जिया को भी धन्यवाद देते हैं ।

इस काम को वेस्टलेक विश्वविद्यालय, २०२० BBRF युवा अन्वेषक अनुदान के फाउंडेशन से स्टार्ट-अप फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था, और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन सभी 32050410298 K.D.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cover glass Deckgläser 72296-03
Denture Base Resin ShangHai New Centery Dentel Material N/A Type I, self-solidifying
Dummy Cannula RWD Life Science Co.,LTD 62102 OD 0.30mm
Guide Cannula RWD Life Science Co.,LTD 62003 26G
Head Fork N/A N/A Custom made
Head Plate N/A N/A Custom made
Imaging Cannula N/A N/A Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel
Internal Cannula RWD Life Science Co.,LTD 62203  0.30*0.14 (OD*ID, mm)
Kwik Sil World Precision Instruments KWIK-SIL
SuperBond C&B SUN MEDICAL N/A SuperBond C&B kit
Treadmill Kit N/A N/A Custom made
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चूहों के व्यवहार के हिप्पोकैम्पस में न्यूरोनल गतिविधियों की कल्पना के लिए क्रैनियोटॉमी प्रक्रिया
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Wang, Y., Zhu, D., Liu, B., Piatkevich, K. D. Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice. J. Vis. Exp. (173), e62266, doi:10.3791/62266 (2021).

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