Wir berichten über einen einfachen, zeiteffizienten und auf Fluoreszenzspektroskopie basierenden Hochdurchsatz-Assay zur Quantifizierung von Aktinfilamenten in ex vivo biologischen Proben aus Hirngeweben von Nagetieren und menschlichen Probanden.
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Methodenartikel
Ein zeiteffizienter Fluoreszenzspektroskopie-basierter Assay zur Bewertung des Actin-Polymerisationsstatus in Nagetier- und menschlichem Hirngewebe
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Actin, der Hauptbestandteil des Zytoskeletts, spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der neuronalen Struktur und Funktion. Unter physiologischen Zuständen tritt Aktin im Gleichgewicht in seinen zwei Formen auf: monomeres kugelförmiges (G-Aktin) und polymerisiertes Filament (F-Aktin). An den synaptischen Terminals bildet das Aktin-Zytoskelett die Grundlage für kritische prä- und postsynaptische Funktionen. Darüber hinaus sind dynamische Veränderungen des Aktinpolymerisationsstatus (Interkonversion zwischen kugelförmigen und filamentösen Formen von Aktin) eng mit plastizitätsbedingten Veränderungen der synaptischen Struktur und Funktion verbunden. Wir berichten hier über eine modifizierte fluoreszenzbasierte Methodik zur Beurteilung des Polymerisationsstatus von Aktin unter Ex-vivo-Bedingungen. Der Assay verwendet fluoreszierend markiertes Phalloidin, ein Phallotoxin, das spezifisch an Aktinfilamente (F-Actin) bindet und ein direktes Maß für polymerisiertes filamentöses Aktin liefert. Als Proof of Principle liefern wir den Nachweis für die Eignung des Assays sowohl in Nagetier- als auch in postmortalen menschlichen Hirngewebehomogenaten. Mit Latrunculin A (einem Medikament, das Aktinfilamente depolymerisiert) bestätigen wir den Nutzen des Assays bei der Überwachung von Veränderungen der F-Aktinspiegel. Darüber hinaus erweitern wir den Assay auf biochemische Fraktionen isolierter synaptischer Terminals, wobei wir eine erhöhte Aktinpolymerisation bei Stimulation durch Depolarisation mit hohem extrazellulärem K+bestätigen.
Einleitung
Cytoskelettprotein Aktin ist an mehreren zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich struktureller Unterstützung, zellulärem Transport, Zellmotilität und -teilung. Aktin kommt im Gleichgewicht in zwei Formen vor: monomeres kugelförmiges Aktin (G-Aktin) und polymerisiertes filamentöses Aktin (F-Aktin). Schnelle Veränderungen im Polymerisationsstatus von Aktin (Interkonversion zwischen seinen G- und F-Formen) führen zu einem schnellen Auf- und Abbau von Filamenten und liegen seiner regulatorischen Rolle in der Zellphysiologie zugrunde. Aktin bildet den Hauptbestandteil der neuronalen Zytoskelettstruktur und beeinflusst ein breites Spektrum neuronaler Funktionen
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Protokoll
Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften des University of Otago Committee on Ethics in the Care and Use of Laboratory Animals (Ethics Protocol No. AUP95/18 und AUP80/17) und neuseeländischer Gesetzgeber. Menschliches Hirngewebe wurde aus der Neurologischen Gewebebank des Krankenhauses Clínic-IDIBAPS BioBank in Barcelona, Spanien, gewonnen. Alle Gewebeentnahmeprotokolle wurden von der Ethikkommission des Krankenhauses Clínic, Barcelona, genehmigt und die Einwilligung der Familien nach Aufklärung eingeholt.
1. Herstellung von Puffern und Reagenzien
- Bereiten Sie die folgenden Puffer für die Homog....
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Ergebnisse
Linearität des Assays zur Bewertung der F-Aktin-Spiegel
Zunächst wurde eine Standardkurve für den linearen Anstieg der Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 Phalloidin ermittelt und für jede Reihe von Experimenten wiederholt(Abbildung 1). Um den linearen Bereich des Assays zu untersuchen, wurden unterschiedliche Mengen an Hirnhomogenaten von Nagetieren (Abbildungen 2A und 2B) und postmortalen menschlichen Probanden (Abbildu.......
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Diskussion
Der hier beschriebene Assay, der im Wesentlichen aus einer früheren Studie30 mit Modifikationen adaptiert wurde, verwendet ein Phallotoxin, Phalloidin, das mit einem fluoreszierenden Etikett gekennzeichnet ist. Fluoreszierende Phalloidin-Analoga gelten als Goldstandard für die Färbung von Aktinfilamenten in festen Geweben47,48,49. Tatsächlich sind sie die ältesten Werkzeuge zur spezifischen Identifizierun.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), dem New Zealand Health Research Council (#16-597) und dem Department of Anatomy der University of Otago, Neuseeland, unterstützt. Wir sind der Neurologischen Gewebebank der HCB-IDIBAPS BioBank (Spanien) für menschliches Hirngewebe zu Dank verpflichtet. Wir danken Jiaxian Zhang für ihre Hilfe bei der Aufnahme und Bearbeitung des Videos.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3,5 ml, offenes, dickwandiges Polycarbonat-Röhrchen | Beckman Coulter | 349622 | Für die Gradientenzentrifugation (Synaptosomenvorbereitung) |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | F-Aktin-spezifischer |
| Ligand Antikörper gegen b-actin | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 | Zur Bestimmung des Gesamtaktinspiegels durch Immunblotting |
| Antikörper gegen GAPDH | Abcam | Ab181602 | Zur Bestimmung der GAPDH-Spiegel durch Immunblotting |
| Bio-Rad Protein Assay Farbstoffreagenzkonzentrat | Bio-Rad | 5000006 | Bradford-basierte Proteinschätzung |
| Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2· 2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Krebs Pufferkomponente |
| cOmplete, Mini, EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | Zur Hemmung der endogenen Proteaseaktivität während der |
| Probenvorbereitung Corning 96-Well Clear Flat Bottom | Polystyrol Corning | 3596 | Für lichtstreuende Messungen |
| D-(+)-Glukose | Sigma-Aldrich | G8270 | Krebspufferkomponente |
| Dimethylsulfoxid | Sigma-Aldrich | D5879 | Lösungsmittel für Phalloidin und Latrunculin A |
| Fluoreszierender Flachbettscanner (Odyssey Infrared Scanner) | Li-Cor Biosciences | Zum Nachweis immunreaktiver Signale auf Immunoblots | |
| Glutaraldehydlösung (25 % in Wasser) Grade II | Sigma-Aldrich | G6257 | Fixiermittel |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Pufferbestandteil für die Probenvorbereitung und Krebspufferkomponente |
| Latrunculin A | Sigma-Aldrich | L5163 | Depolymerisierer von Aktinfilamenten |
| Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2· 6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | Krebs Pufferkomponente |
| Microtiterplatten | |||
| Mitex Membranfilter 5 mm | Millipore | LSWP01300 | Präparation von Synaptoneurosomen |
| Nunc F96 MicroWell Black Plate | Thermo Fisher Scientific | 237105 | Für fluorometrische Messungen |
| Nylon-Netzfilter 100 mm | Millipore | NY1H02500 | Präparation von Synaptoneurosomen |
| Phosphatase-Inhibitor Cocktail IV | Abcam | ab201115 | Zur Hemmung der endogenen Phosphataseaktivität während der Probenvorbereitung |
| Kaliumchlorid (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Krebspufferkomponente und zur Depolarisation synaptischer Terminalisationen |
| Kaliumphosphat monobasisch ((KH2PO4 ) | Sigma-Aldrich | P9791 | Krebs-Pufferkomponente |
| Natriumborhydrid (NaBH4 | )Sigma-Aldrich | 71320 | Komponente des Permeabilisierungspuffers |
| Natriumchlorid (NaCl) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL944 | Krebspufferkomponente |
| Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL900 | Krebs Pufferkomponente |
| SpectraMax i3x | Molekulare Geräte | Für fluorometrische Messungen | |
| Saccharose | Fisher Chemical | S/8600/60 | Pufferbestandteil für die Probenvorbereitung |
| Swimnex Filter Holder | Millipore | Sx0001300 | Präparation von Synaptoneurosomen |
| Gewebemühle 5 mL Potter-Elvehjem | Duran Wheaton Kimble | 358034 | Für die Gewebehomogenisierung |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Komponente des Permeabilisierungspuffers |
| Trizma-Basis | Sigma-Aldrich | T6066 | Pufferbestandteil für die Probenvorbereitung |
Referenzen
- Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
- Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton.
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Nachdrucke und Genehmigungen
