Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Vitrifikation von in vitro gereiften Eizellen, die aus adulten und präpubertären Eierstöcken bei Schafen entnommen wurden

5.2K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/62272

⸱

10. Juli 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, University of Sassari

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll zielt darauf ab, eine Standardmethode für die Vitrifikation von erwachsenen und juvenilen Schafe eizellen bereitzustellen. Es umfasst alle Schritte von der Herstellung der In-vitro-Reifemedien bis zur Nacherwärmungskultur. Eizellen werden im MII-Stadium mit Cryotop vitrifiziert, um das minimale essentielle Volumen zu gewährleisten.

Zusammenfassung

In der Tierhaltung können In-vitro-Embryoproduktionssysteme dank der großen Anzahl von Eierstöcken und Eizellen, die leicht aus einem Schlachthof gewonnen werden können, entwickelt und aufrechterhalten werden. Erwachsene Eierstöcke tragen immer mehrere Antralfollikel, während bei präpubertären Spenderinnen die maximale Anzahl von Eizellen im Alter von 4 Wochen verfügbar ist, wenn eierstöcke Spitzenzahlen von Antralfollikeln tragen. So gelten 4 Wochen alte Lämmer als gute Spenderinnen, auch wenn die Entwicklungskompetenz präpubertärer Eizellen im Vergleich zu ihrem erwachsenen Pendant geringer ist.

Grundlagenforschung und kommerzielle Anwendungen würden durch die Möglichkeit der erfolgreichen Kryokonservierung von vitrifizierten Eizellen gefördert, die sowohl von erwachsenen als auch von präpubertären Spenderinnen gewonnen wurden. Die Vitrifikation von Eizellen, die von präpubertären Spenderinnen gesammelt wurden, würde auch eine Verkürzung des Erzeugungsintervalls und damit eine Erhöhung des genetischen Gewinns in Zuchtprogrammen ermöglichen. Der Verlust des Entwicklungspotenzials nach der Kryokonservierung macht Säugetier-Eizellen jedoch wahrscheinlich zu einem der am schwierigsten zu kryokonservierenden Zelltypen. Unter den verfügbaren Kryokonservierungstechniken wird die Vitrifikation häufig auf tierische und menschliche Eizellen angewendet. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Technik induzieren Expositionen gegenüber hohen Konzentrationen von Kryoprotektoren sowie kühlen Verletzungen und osmotischem Stress immer noch mehrere strukturelle und molekulare Veränderungen und reduzieren das Entwicklungspotenzial von Eizellen von Säugetieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vitrifikation von Schafseigzellen, die von juvenilen und erwachsenen Spenderinnen entnommen und vor der Kryokonservierung in vitro gereift sind. Das Protokoll umfasst alle Verfahren von der In-vitro-Reifung der Eizellen bis zur Vitrifikation, Erwärmung und Inkubationszeit nach der Erwärmung. Eizellen, die im MII-Stadium verglast wurden, können zwar nach der Erwärmung befruchtet werden, benötigen jedoch vor der Befruchtung zusätzliche Zeit, um Schäden durch Kryokonservierungsverfahren wiederherzustellen und ihr Entwicklungspotenzial zu erhöhen. Daher sind die Kulturbedingungen und der Zeitpunkt nach der Erwärmung entscheidende Schritte für die Wiederherstellung des Entwicklungspotenzials der Eizellen, insbesondere wenn Eizellen von juvenilen Spenderinnen entnommen werden.

Einleitung

Die Langzeitlagerung der weiblichen Gameten kann eine breite Palette von Anwendungen bieten, wie z. B. die Verbesserung der Haustierzucht durch genetische Selektionsprogramme, den Beitrag zur Erhaltung der Biologischen Vielfalt durch das Ex-situ-Programm zum Schutz von Wildtierarten und die Förderung der Forschung und Anwendungen in der In-vitro-Biotechnologie dank der Verfügbarkeit von gelagerten Eizellen, die in die In-vitro-Embryonenproduktion oder Kerntransplantationsprogramme integriert werden können1,2,3. Die Vitrifikation juveniler Eizellen würde auch den genetischen Gewinn erhöhen, indem das Erzeugungsintervall in Zuchtprogrammen verkürzt wird4. Die Vitrifikation durch ultraschnelles Abkühlen und Erwärmen von Eizellen gilt derzeit als Standardansatz für die Kryokonservierung von Tierinnen5. Bei Wiederkäuern werden Eizellen vor der Vitrifikation in der Regel in vitro gereift, nachdem sie aus Follikeln gewonnen wurden, die aus Schlachthof-Eierstöcken gewonnen wurden2. Erwachsene und insbesondere präpubertäre Eierstöcke4,6, können in der Tat eine praktisch unbegrenzte Anzahl von Eizellen liefern, die kryokonserviert werden sollen.

Bei Rindern wurden nach Vitrifizierung und Erwärmung der Eizellen Blastozystenerträge von >10% in den letzten zehn Jahren häufig von mehreren Labors berichtet3. Bei kleinen Wiederkäuern gilt die Vitrifikation der Eizellen jedoch sowohl für juvenile als auch für erwachsene Eizellen noch als relativ neu, und eine Standardmethode für die Vitrifikation von Schaf-Eizellen muss noch festgelegt werden2,5. Trotz jüngster Fortschritte zeigt die vitrifizierte und erwärmte Eizelle tatsächlich mehrere funktionelle und strukturelle Veränderungen, die ihr Entwicklungspotenzial einschränken7,8,9. Daher haben nur wenige Artikel über eine Blastozystenentwicklung von 10% oder mehr in vitrifizierten/ erwärmten Schafse eizellenberichtet 2. Es wurden mehrere Ansätze untersucht, um die oben genannten Veränderungen zu reduzieren: Optimierung der Zusammensetzung der Vitrifikations- und Auftaulösungen10,11; Experimentieren mit der Verwendung verschiedener Kryo-Geräte8,12,13; und Anwendung spezifischer Behandlungen während der In-vitro-Reifung (IVM)4,14,15 und/oder während der Erholungszeit nach dem Erwärmen6.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vitrifikation von Schafseigen, die von juvenilen und erwachsenen Spenderinnen gesammelt und vor der Kryokonservierung in vitro gereift sind. Das Protokoll umfasst alle Verfahren von der In-vitro-Reifung der Eizellen bis zur Vitrifikation, Erwärmung und Kulturperiode nach der Erwärmung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Das Tierprotokoll und die unten beschriebenen implementierten Verfahren entsprechen den an der Universität Sassari geltenden ethischen Richtlinien, der Richtlinie 86/609/EG der Europäischen Union und der Empfehlung der Kommission der Europäischen Gemeinschaften 2007/526/EG.

1. Vorbereitung von Medien zur Eizellmanipulation

  1. Bereiten Sie das Medium für den Transport der gesammelten Eierstöcke vor, indem Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung von Dulbecco mit 0,1 g / L Penicillin und 0,1 g / L Streptomycin (PBS) ergänzen.
  2. Bereiten Sie das Medium für die Eizellentnahme und -reifung vor, indem Sie 9,5 g Tissue Culture Medium (TCM) 199 in Pulver mit 1 L Milli-Q-Wasser, ergänzt mit Penicillin (0,1%) und Streptomycin (0,1%).
    1. Nach der Verdünnung 100 ml Medium filtern und bei 4 °C als Stock Maturation Medium (SMM) lagern, um es für eine Woche zu verwenden.
    2. Bereiten Sie das Auffangmedium (CM) vor, indem Sie die restlichen 900 ml mit 25 mM HEPES, 0,36 g/L Bicarbonat und 0,1 % (w/v) Polyvinylalkohol (PVA) (pH 7,3, Osmolalität 290 mOsm/kg) ergänzen.
  3. Bereiten Sie das Reifemedium mit SMM vor, das mit 0,021 g/L Bicarbonat, 10% wärmebehandeltem Östrusschafserum, 1 IE/ml FSH, 1 IE/ml LH, 100 μL Cysteamin und 8 mg/ml Pyruvat ergänzt wird.
    HINWEIS: Das Reifemedium in einem Volumen von 10 ml muss vor Gebrauch mindestens 4 h lang unter Standardbedingungen (in einer maximal befeuchteten Atmosphäre bei 39 °C in 5% CO2 in Luft) inkubiert werden.
  4. Bereiten Sie das Basismedium (BM) für die Manipulation der Eizelle nach der In-vitro-Reifung vor, bestehend aus PBS ohne Ca++ und Mg++,ergänzt mit 20% fetalem Kalbserum (FCS).

2. Eizellentnahme und Reifung

  1. Erholen Sie die Eizellen von juvenilen (30-40 Tage Alter, Körpergewicht 6-10 kg) und erwachsenen Eierstöcken.
  2. Transport der gesammelten Eierstöcke vom kommerziellen Schlachthof zum Labor innerhalb von 1-2 h in PBS bei 27 °C.
  3. Nach dem Waschen in PBS frischem Medium die Eierstöcke in CM mit einer Mikroklinge in Scheiben schneiden, um den Follikelgehalt freizusetzen.
  4. Wählen Sie im Rahmen einer Stereomikroskopuntersuchung mit 60-facher Vergrößerung Cumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) für die In-vitro-Reifung aus, indem Sie diejenigen mit 4-10 Schichten von Granulosazellen, Eizellen mit einem gleichmäßigen Zytoplasma, homogener Verteilung der Lipidtröpfchen im Zytoplasma und mit einem Außendurchmesser von etwa 90 μm (Mittelwert) auswählen.
  5. Waschen Sie die ausgewählten COCs dreimal in CM und übertragen Sie sie schließlich in das Reifemedium.
    HINWEIS: Für juvenile Eizellen, um das Überleben nach der Vitrifikation zu verbessern, ergänzen Sie das Reifemedium mit 100 μM Trehalose.
  6. Für die In-vitro-Reifung werden 30-35 COCs in 600 μL Reifemedium in Petrischalen mit vier Wellen übertragen, die mit 300 μL Mineralöl bedeckt sind, und sie für 22 (adulte Eizellen)/24 (juvenile Eizellen) h in 5% CO2 in Luft bei 39 °C inkubieren.
  7. Nach der In-vitro-Reifung COCs von Kumuluszellen durch sanftes Pipettieren entwenden. Nach der Untersuchung mit einem Stereomikroskop mit 60-facher Vergrößerung wählen Sie nur diejenigen aus, die die Extrusion am ersten Polkörper und damit in der Metaphase II (MII) -Stufe zeigen, um die Vitrifikation zu erhalten.

3. Samenentnahme, Einfrieren und Auftauen

  1. Bereiten Sie das Basismedium für die Kryokonservierung von Samen vor, bestehend aus Ram Extender (200 mM Tris; 70 mM Zitronensäure; 55 mM Fruktose; pH 7,2, Osmolalität 300 mOsm/kg) ergänzt mit Eigelb 20% (v/v).
  2. Sammeln Sie den Samen nur während der Schafzuchtsaison (Oktober-November).
  3. Erhalten Sie Ejakulate durch künstliche Vagina von erwachsenen Widdern (im Alter von 2-5 Jahren), die in einer Außenumgebung gehalten und mit einer Erhaltungsration mit Lebendgewicht gefüttert werden. Halten Sie Widder isoliert in separaten Stiften, aber mit Sichtkontakt untereinander.
  4. Wiederholen Sie die Samenentnahme einmal pro Woche während der gesamten Brutzeit, um mindestens 8 Ejakulate von jedem Männchen zu erhalten.
  5. Transportieren Sie die Samenproben innerhalb von 5 minuten nach der Entnahme bei Umgebungstemperatur ins Labor und verarbeiten Sie sie sofort. Bündeln Sie die Ejakulate von zwei bis drei Widdern und bewerten Sie die Spermienkonzentrationsspektrophotometrie.
  6. Nach dem Pooling die Ejakulate auf 400 x 106 Spermatozoen/ml mit Basismedium für die Samen-Kryokonservierung mit 4% Glycerin ergänzen. Anschließend den verdünnten Samen über einen Zeitraum von 2 h auf 4 °C abkühlen und vor dem Einfrieren 20 min ausgleichen.
  7. Die Samenproben in Pelletform (0,25 ml) auf Trockeneis einfrieren und dann in flüssigen Stickstoff tauchen.
  8. Zum Auftauen das Pellet in einen sterilisierten Glasfalken geben und für 20 s bei 39 °C in ein Wasserbad tauchen.

4. In-vitro-Fertilisation und Embryokultur

  1. Bereiten Sie die Vorräte für die Konstitution der synthetischen Eileiterflüssigkeit (SOF) vor.
    1. Bereiten Sie Stock A vor: 99,4 ml MilliQ-Wasser; 6,29 g NaCl; 0,534 g KCl; 0,161 g KH2PO4; 0,182 gMgSO4 ·7H2 O; und 0,6 ml Natriumlactat. Bis zu 3 Monate bei 4 °C aufbewahren.
    2. Bereiten Sie Stock B vor: 10 ml MilliQ-Wasser; 0,210 g NaHCO3; und 2-3 g Phenolrot. 1 Monat bei 4 °C aufbewahren.
    3. Bereiten Sie Brühe C vor: 10 ml MilliQ-Wasser; und 0,051 g Natriumpyruvat. 1 Monat bei 4 °C aufbewahren.
    4. Bereiten Sie Brühe D vor: 10 ml MilliQ-Wasser; und 0,262 g CaCl2 2H2O. 1 Monat bei 4 °C aufbewahren.
    5. Bereiten Sie 10 ml SOF vor, bestehend aus 7,630 ml MilliQ-Wasser, 1 ml Schaft A, 1 ml Schaft B, 0,07 ml Schaft C und 0,7 ml Stamm D.
    6. Vorbereitung der In-vitro-Fertilisation (IVF): SOF ergänzt mit 2% wärmebehandeltem östrous Schafserum, 10 μg/ml Heparin und 1 μg/ml Hypoutarin (Osmolalität 280-290 mOsm/kg).
      HINWEIS: Das IVF-Medium in einem Volumen von 10 ml muss unter Standardbedingungen (in einer maximal befeuchteten Atmosphäre bei 39 °C in 5%CO2,5% O2 und 90% N2) mindestens 4 h vor Gebrauch inkubiert werden.
  2. Übertragen Sie gefrorene/aufgetaute Samen aliquots in ein sterilisiertes konisches Glasrohr unter 1,5 ml erwärmtem IVF-Medium und inkubieren Sie sie für 15 min bei 39 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 in der Luft.
  3. Nach der Inkubation schwimmen die beweglichen Spermatozoen in Richtung des apikalen Teils der Flüssigkeitssäule. Sammeln Sie die oberste Schicht und beobachten Sie die Beurteilung der Spermienmotilität.
    HINWEIS: Die Parameter der Spermienmotilität sollten mit einem computergestützten Spermienanalysesystem (CASA) mit den folgenden Einstellungen bewertet werden: 25 Frames, die zur Vermeidung von Überlappungen der Spermienspur erworben wurden, Mindestkontrast 10, Mindestgeschwindigkeit des durchschnittlichen Pfades 30 μm / s und progressive Motilität > 80% Geradheit. Dieses System verfügt über ein spezifisches Setup für die Bewertung von Widderspermien. Für jede Probe werden 5 μL Teilprobe spermiensuspension in eine vorgewärmte Analysekammer mit einer Tiefe von 10 μm geladen. Die Spermienmotilität wird bei 37 °C bei 40x mit einem Phasenkontrastmikroskop beurteilt und mindestens 500 Spermien pro Teilstichprobe sollten in mindestens vier verschiedenen mikroskopischen Feldern analysiert werden. Der Prozentsatz der gesamten beweglichen und progressiven beweglichen Spermien wurde bewertet. Für die IVF sollte der Prozentsatz der progressiven beweglichen Spermatozoen ≥ 30% betragen.
  4. Verdünnen Sie aus Swim-up gewonnene bewegliche Spermatozoen bei 1 x10 6 Spermatozoen / ml Endkonzentration und koinubieren Sie sie mit MII-Eizellen in 300 μL IVF-Medium, das mit Mineralöl in Vier-Well-Petrischalen bedeckt ist.
  5. Nach 22 h übertragen Sie die mutmaßlichen Zygoten in Vier-Well-Petrischalen, die SOF enthalten, ergänzt mit 0,4% Rinderserumalbumin und essentiellen und nicht essentiellen Aminosäuren in eileiterhaltiger Konzentration, wie von16 unter Mineralöl berichtet, und kultivieren sie unter Standardbedingungen bis zum Blastozystenstadium.
  6. Erfassen Sie bei 22-, 26- und 32-h nach der Insemination die Anzahl der gespaltenen Eizellen, die zwei verschiedene Blastomere aufweisen, durch die Untersuchung unter einem Stereomikroskop mit 60-facher Vergrößerung.
  7. Beobachten Sie die Embryonen täglich ab dem fünften bis zum neunten Kulturtag und neu gebildete Blastozysten sollten durch die Untersuchung unter einem Stereomikroskop mit 60-facher Vergrößerung aufgezeichnet werden.

5. Vitrifikation und Erwärmung der Eizellen

HINWEIS: Führen Sie die Vitrifikation nach der Methode des minimalen essentiellen Volumens (MEV) mit Gerätekrütomoten17 durch.

  1. Eine Gruppe von fünf Eizellen bei 38,5 °C für 2 min in BM ausgleichen. Die Verwendung von BM garantiert eine niedrige Calciumkonzentration ([Ca2++]2,2 mg/dl)10.
  2. Dehydrieren Sie die Eizellen mit einer 3-minütigen Exposition gegenüber Gleichgewichtslösung, die 7,5% (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO) und 7,5% (v/v) Ethylenglykol (EG) in BM enthält.
  3. Die Eizellen werden in die Vitrifikationslösung mit 16,5% (v/v) DMSO, 16,5% (v/v) EG und 0,5 M Trehalose in BM überführen, bevor sie in ein Kryotopgerät geladen und innerhalb von 30 s direkt in flüssigen Stickstoff gestürzt werden.
  4. Um sich auf eine biologische Temperatur zu erwärmen, den Inhalt jeder Vitrifikationsvorrichtung aus flüssigem Stickstoff in 200 μL Tropfen von 1,25 M Trehalose in BM für 1 min bei 38,5 °C geben und vorsichtig umrühren, um das Mischen zu erleichtern.
  5. Um die Entfernung intrazellulärer Kryoprotektoren zu fördern, werden die Eizellen schrittweise in 200 μL Tropfen abnehmender Trehaloselösungen (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M Trehalose in BM) für 30 s bei 38,5 °C übertragen, bevor sie für 10 min bei 38,5 °C in BM ausgeglichen werden.

6. Beurteilung der Eizellqualität nach der Erwärmung

  1. Nach der Erwärmung die Eizellen für 6 h in PBS ohneCa++ undMg++ plus 20% FCS (BM) in 5% CO2 in Luft bei 38,5 °C inkubieren.
    HINWEIS: Die Fähigkeit der Eizelle, biologische und strukturelle Merkmale nach der Vitrifikation wiederherzustellen, steht in Bezug auf die Arten und Klassen der verwendeten Eizellen.
  2. Da die Fähigkeit der Eizelle, Kryokonservierungsschäden wiederherzustellen, zeitabhängig ist, beurteilen Sie die Eizellqualität zu verschiedenen Zeitpunkten der In-vitro-Kultur (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) nach der Erwärmung, um das optimale Zeitfenster für die Befruchtung der Eizellen zu definieren.
    HINWEIS: Bei erwachsenen Schafseigen ist die optimale Zeit 4 h nach der Erwärmung; für präpubertäre Eizellen ist der optimale Zeitpunkt 2 h nach der Erwärmung.

7. Beurteilung des Überlebens der Eizellen

  1. Unmittelbar nach der Erwärmung und für jeden Zeitpunkt der Nacherwärmungskultur werden die Eizellen morphologisch mit einem invertierten Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung bewertet.
    HINWEIS: Eizellen mit strukturellen Veränderungen wie schwachem Zytoplasma, Schädigung der Zona pellucida und/oder Membran sollten als degeneriert eingestuft werden.
  2. Validieren Sie die Bewertung der Membranintegrität mit einer doppelten differentiellen Fluoreszenzfärbung.
  3. Inkubieren Sie die Eizellen in 2 ml BM, die Propidiiumiodid (PI; 10 μg/ml) und Hoechst 33342 (10 μg/ml) enthalten, für 5 min in 5% CO2 in Luft bei 38,5 °C.
  4. Nach dreimaliger Wäsche in frischem BM beobachten Sie die Eizellen unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Anregungsfilter von 350 nm und einer Emission von 460 nm für Hoechst 33342 und einem Anregungsfilter von 535 nm und einer Emission von 617 nm für PI.
    HINWEIS: Eizellen mit intakter Membran sind an der blauen Fluoreszenz farbiger DNA mit Hoechst 33342 zu erkennen. Eizellen mit beschädigten Membranen zeigen eine rote Fluoreszenz aufgrund von DNA-Färbung mit PI.

8. Bewertung der mitochondrialen Aktivität und der intrazellulären ROS-Spiegel durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

  1. Bereiten Sie die MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red) Sonde vor.
    1. Verdünnen Sie den Inhalt von 1 Durchstechflasche (50 μg) mit 1 ml DMSO, um eine 1 mM Lösung zu erhalten. Bewahren Sie die verdünnte Durchstechflasche in flüssigem Stickstoff auf.
    2. Verdünnen Sie die Lösung 1 mM mit DMSO, um die 100 μM Stammlösung zu erhalten, und lagern Sie sie bei -80 °C im Dunkeln.
  2. Vorbereiten 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat(H2DCF-DA) Sonde.
    1. Verdünnen Sie dasH2DCF-DA in 0,1% Polyvinylpyrrolidon (PVA)/PBS, um die erste 100 mM-Lösung zu erhalten. Bewahren Sie die Lösung bei -80 °C im Dunkeln auf.
    2. Verdünnen Sie die erste Lösung in 0,1% PVA/PBS, um die 100 μM Stammlösung zu erhalten. Bei -20 °C im Dunkeln lagern.
  3. Bereiten Sie das Montagemedium (MM) vor: Für 10 ml MM 5 ml Glycerin, 5 ml PBS und 250 mg Natriumazid hinzufügen. Bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.
  4. Inkubieren Sie die Eizellen für 30 min bei 38,5 °C in BM mit 500 nM MT-Rot (Stammlösung: 100 μM in DMSO).
  5. Nach der Inkubation mit MT-Red-Sonde die Eizellen dreimal in BM waschen und 20 min in demselben Medium mit 5 μMH2DCF-DA (Stammlösung: 100 μM in BM) inkubieren.
  6. Nach der Exposition bei den Sonden die Eizellen in BM waschen und mindestens 15 Minuten lang in 2,5% Glutaraldehyd / PBS fixieren.
  7. Nach der Fixierung die Eizellen dreimal in BM waschen und auf Glasobjektträgern in einem 4 μL Tropfen MM mit 1 mg/ml Hoechst 33342 mit Wachskissen montieren, um eine Kompression der Proben zu vermeiden.
  8. Objektträger bis zur Auswertung bei 4 °C im Dunkeln lagern.
  9. Führen Sie die Analyse von immunmarkierten Abschnitten mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop durch. Das Mikroskop ist mit Ar/He/Ne-Lasern ausgestattet, die ein 40/60-faches Ölobjektiv verwenden. Analysieren Sie die Abschnitte durch sequentielle Anregung.
  10. Für die mitochondriale Auswertung beobachten Sie die Proben mit einem Multiphotonenlaser, um MT-Red nachzuweisen (Exposition: 579 nm; Emission: 599 nm).
  11. Verwenden Sie einen Argon-Ionen-Laserstrahl bei 488 nm und den B-2 A-Filter (495 nm Exposition und 519 nm Emission), um auf das Dichlorfluorescein (DCF)18hinzuweisen.
  12. In jeder einzelnen Eizelle messen MT-Rot- und DCF-Fluoreszenzdicken auf der Äquatorebene19.
  13. Beibehaltung der Parameter in Bezug auf die Fluoreszenzintensität bei konstanten Werten während aller Bildaufnahmen (Laserenergie 26%, Sequenzielle Einstellungen 1: PMT1-Verstärkung 649-PMT2-Verstärkung 482; Sequenzielle Einstellung 2: PMT1 Verstärkung 625-PMT2 Verstärkung 589; Offset 0; Lochgröße: 68).
  14. Führen Sie eine quantitative Analyse der Fluoreszenzintensität mit dem Leica LAS AF Lite Bildanalyse-Softwarepaket durch, wobei die Verfahren um20standardisiert sind.
  15. Nehmen Sie die Bilder einmal auf, bewegen Sie sich auf der Z-Achse, bis Sie die Äquatorebene erreichen.
  16. Für jedes Foto in Graustufen umwandeln und Kanal 1 (bezogen auf Hoechst-Blau) deaktivieren. Zeichnen Sie dann manuell eine Region of Interest (ROI) auf einer umschriebenen Fläche, d. h. um die meiotische Spindel.
    HINWEIS: Die Software kann automatisch den Pixeldurchschnittswert auf dem Kanal 2 (FITC) lesen und den Wert des Hintergrunds davon subtrahieren.
  17. Zeichnen Sie die Mittelwerte der Pixel auf und senden Sie sie zur statistischen Analyse.

9. Statistische Auswertungen

  1. Analyse der folgenden Unterschiede: Überlebensraten in juvenilen vs. adulten Eizellen, Überlebensraten und Entwicklungskompetenz in Kontroll- und Trehalose-behandelten juvenilen Eizellen, Überlebens- und parthenogenetische Aktivierungsraten und Entwicklungskompetenz von adulten Eizellen, die mit verschiedenen Kalziumkonzentrationsmedien vitrifiziert sind, Befruchtungsraten und Embryoproduktion in juvenilen Eizellen, die mit niedriger oder hoher Kalziumkonzentration vitrifiziert sind, aktive Mitochondrienphänotypen in juvenilen vitrifizierten Eizellen während unterschiedliche Zeitpunkte der posterwärmenden Kultur und parthenogenetische Aktivierungsraten zwischen adulten und juvenilen vitrifizierten Eizellen mit dem Chi-Quadrat-Test.
  2. Analysieren Sie die Spaltungsrate und den Embryoausstoß in vitrifizierten adulten Eizellen während verschiedener Zeitpunkte der Posterwärmungskultur, die Fluoreszenzintensität der mitochondrialen Aktivität und die intrazellulären ROS-Spiegel in juvenilen vitrifizierten Eizellen während verschiedener Zeitpunkte der Posterwärmungskultur durch ANOVA nach Analyse der Homogenität der Varianz durch Levenes Test. Verwenden Sie einen Post-hoc-Test Tukey's Test, um Unterschiede zwischen und zwischen Gruppen hervorzuheben.
  3. Führen Sie statistische Analysen mit dem statistischen Softwareprogramm durch und betrachten Sie eine Wahrscheinlichkeit von P < 0,05 als Mindestbedeutungsniveau. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.E.M ausgedrückt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die Kryotoleranz von Eizellen von juvenilen Spenderinnen ist im Vergleich zu erwachsenen niedriger. Der erste beobachtete Effekt ist eine niedrigere Überlebensrate nach der Erwärmung im Vergleich zu adulten Eizellen (Abbildung 1A; χ2 Test P<0,001). Juvenile Eizellen zeigten nach der Erwärmung eine geringere Membranintegrität (Abbildung 1B). Die Verwendung von Trehalose im Reifemedium sollte überprüfen, ob dieser Zucker Kryoverletzungen in juvenilen...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die Kryokonservierung von Eizellen bei Haustieren kann nicht nur die langfristige Erhaltung weiblicher genetischer Ressourcen ermöglichen, sondern auch die Entwicklung embryonaler Biotechnologien vorantreiben. So würde die Entwicklung einer Standardmethode zur Vitrifikation von Eizellen sowohl der Nutztierhaltung als auch dem Forschungssektor zugute kämen. In diesem Protokoll wird eine vollständige Methode zur Vitrifikation von eizellten Erwachsenen schafen vorgestellt, die einen soliden Ausgangspunkt für die Entwicklung...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren erhielten keine spezifische Förderung für diese Arbeit. Professor Maria Grazia Cappai und Dr. Valeria Pasciu sind dankbar für das Video-Voiceover und für den Aufbau des Labors während der Videoaufnahmen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2′,7′-DichlorfluorescindiacetatSigma-AldrichD-6883
Albumin Rinderfraktion V, proteasefreiSigma-AldrichA3059
Bisbenzimid H 33342 Trihydrochlorid (Hoechst 33342)Sigma-Aldrich14533
Calciumchlorid (CaCl2 2H20)Sigma-AldrichC8106
ZitronensäureSigma-AldrichC2404
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopLeica Microsystems GmbH,WetzlarTCS SP5 DMI 6000CS
Cryotop KitazatoMedical Biological Technologies
CysteamineSigma-AldrichM9768
D- (-) FructoseSigma-AldrichF0127
D(+)Trehalose DehydrSigma-AldrichT0167
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco Phosphat gepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichD8537
EigelbSigma-AldrichP3556
Ethylenglykol (EG)Sigma-Aldrich324558
FSHSigma-AldrichF4021
GlutaminsäureSigma-AldrichG5638
GlutaraldehydSigma-AldrichG5882
GlycerinSigma-AldrichG5516
GlycinSigma-AldrichG8790
HeparinSigma-AldrichH4149
HEPESSigma-AldrichH4034
HypoutarinSigma-AldrichH1384
Inverses MikroskopDiaphot, Nikon
L-AlaninSigma-AldrichA3534
L-ArgininSigma-AldrichA3784
L-AsparaginSigma-AldrichA4284
L-AsparaginsäureSigma-AldrichA4534
L-CysteinSigma-AldrichC7352
L-CystinSigma-AldrichC8786
L-GlutaminSigma-AldrichG3126
LHSigma-AldrichL6420
L-HistidinSigma-AldrichH9511
L-IsoleucinSigma-AldrichI7383
L-LeucinSigma-AldrichL1512
L-LysinSigma-AldrichL1137
L-MethioninSigma-AldrichM2893
L-OrnithinSigma-AldrichO6503
L-PhenylalaninSigma-AldrichP5030
L-ProlinSigma-AldrichP4655
L-SerinSigma-AldrichS5511
L-TyrosinSigma-AldrichT1020
L-ValinSigma-AldrichV6504
Magnesiumchlorid-Heptahydrat (MgSO4.7H2O)Sigma-AldrichM2393
Makler ZählkammerSefi-Medical Instruments ltd. Biosigma S.r.l.
Medium 199Sigma-AldrichM5017
MineralölSigma-AldrichM8410
MitoTracker Rot CM-H2XRosThermoFisherM7512
Neugeborenes Kälberserum hitzeinaktiviert (FCS)Sigma-AldrichN4762
Penicillin G NatriumsalzSigma-AldrichP3032
PhenolrotSigma-AldrichP3532
Polyvinylalkohol (87-90% hydrolysiert, durchschnittliches Molgewicht 30.000-70.000)Sigma-AldrichP8136
Kaliumchlorid (KCl)Sigma-AldrichP5405
Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
PropidiumiodidSigma-AldrichP4170
SchafserumSigma-AldrichS2263
NatriumazidSigma-AldrichS2202
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Natriumchlorid (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Natrium-dl-LactatlösungssirupSigma-AldrichL4263
NatriumpyruvatSigma-AldrichP2256
Spermienklassen-AnalysatorMicroptic S.L.S.C.A. v 3.2.0
Statistische Software Minitab 18.12017 Minitab
StereomikroskopOlimpusSZ61
StreptomycinsulfatSigma-AldrichS9137
TaurinSigma-AldrichT7146
TRISSigma-Aldrich15.456-3

Referenzen

  1. Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
  2. Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
  3. Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
  4. Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
  5. Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
  6. Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
  7. Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
  8. Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
  9. Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
  10. Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
  11. Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
  12. Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
  13. Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
  14. Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
  15. Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
  16. Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
  17. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  18. Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
  19. Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
  20. Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
  21. los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
  22. Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
  23. Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
  24. Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
  25. Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
  26. Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
  27. Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
  28. Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
  29. Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
  30. Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
  31. Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
  32. Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
  33. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  34. De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
  35. Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Oozyten VitrifikationIn vitro ReifungSchaf Oozytenpr pubert re Oozytenadulte OozytenKryokonservierungstechnikKultur nach dem AuftauenCumulus Oozyten KomplexCryotop Methodemitochondriale Aktivit t
Vitrifikation von in vitro gereiften Eizellen, die aus adulten und präpubertären Eierstöcken bei Schafen entnommen wurden
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.