Vitrifikation von in vitro gereiften Eizellen, die aus adulten und präpubertären Eierstöcken bei Schafen entnommen wurden

Zusammenfassung

Das Protokoll zielt darauf ab, eine Standardmethode für die Vitrifikation von erwachsenen und juvenilen Schafe eizellen bereitzustellen. Es umfasst alle Schritte von der Herstellung der In-vitro-Reifemedien bis zur Nacherwärmungskultur. Eizellen werden im MII-Stadium mit Cryotop vitrifiziert, um das minimale essentielle Volumen zu gewährleisten.

Zusammenfassung

In der Tierhaltung können In-vitro-Embryoproduktionssysteme dank der großen Anzahl von Eierstöcken und Eizellen, die leicht aus einem Schlachthof gewonnen werden können, entwickelt und aufrechterhalten werden. Erwachsene Eierstöcke tragen immer mehrere Antralfollikel, während bei präpubertären Spenderinnen die maximale Anzahl von Eizellen im Alter von 4 Wochen verfügbar ist, wenn eierstöcke Spitzenzahlen von Antralfollikeln tragen. So gelten 4 Wochen alte Lämmer als gute Spenderinnen, auch wenn die Entwicklungskompetenz präpubertärer Eizellen im Vergleich zu ihrem erwachsenen Pendant geringer ist.

Grundlagenforschung und kommerzielle Anwendungen würden durch die Möglichkeit der erfolgreichen Kryokonservierung von vitrifizierten Eizellen gefördert, die sowohl von erwachsenen als auch von präpubertären Spenderinnen gewonnen wurden. Die Vitrifikation von Eizellen, die von präpubertären Spenderinnen gesammelt wurden, würde auch eine Verkürzung des Erzeugungsintervalls und damit eine Erhöhung des genetischen Gewinns in Zuchtprogrammen ermöglichen. Der Verlust des Entwicklungspotenzials nach der Kryokonservierung macht Säugetier-Eizellen jedoch wahrscheinlich zu einem der am schwierigsten zu kryokonservierenden Zelltypen. Unter den verfügbaren Kryokonservierungstechniken wird die Vitrifikation häufig auf tierische und menschliche Eizellen angewendet. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Technik induzieren Expositionen gegenüber hohen Konzentrationen von Kryoprotektoren sowie kühlen Verletzungen und osmotischem Stress immer noch mehrere strukturelle und molekulare Veränderungen und reduzieren das Entwicklungspotenzial von Eizellen von Säugetieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vitrifikation von Schafseigzellen, die von juvenilen und erwachsenen Spenderinnen entnommen und vor der Kryokonservierung in vitro gereift sind. Das Protokoll umfasst alle Verfahren von der In-vitro-Reifung der Eizellen bis zur Vitrifikation, Erwärmung und Inkubationszeit nach der Erwärmung. Eizellen, die im MII-Stadium verglast wurden, können zwar nach der Erwärmung befruchtet werden, benötigen jedoch vor der Befruchtung zusätzliche Zeit, um Schäden durch Kryokonservierungsverfahren wiederherzustellen und ihr Entwicklungspotenzial zu erhöhen. Daher sind die Kulturbedingungen und der Zeitpunkt nach der Erwärmung entscheidende Schritte für die Wiederherstellung des Entwicklungspotenzials der Eizellen, insbesondere wenn Eizellen von juvenilen Spenderinnen entnommen werden.

Einleitung

Die Langzeitlagerung der weiblichen Gameten kann eine breite Palette von Anwendungen bieten, wie z. B. die Verbesserung der Haustierzucht durch genetische Selektionsprogramme, den Beitrag zur Erhaltung der Biologischen Vielfalt durch das Ex-situ-Programm zum Schutz von Wildtierarten und die Förderung der Forschung und Anwendungen in der In-vitro-Biotechnologie dank der Verfügbarkeit von gelagerten Eizellen, die in die In-vitro-Embryonenproduktion oder Kerntransplantationsprogramme integriert werden können^1,2,3. Die Vitrifikation juveniler Eizellen würde auch den genetischen G....

Protokoll

Das Tierprotokoll und die unten beschriebenen implementierten Verfahren entsprechen den an der Universität Sassari geltenden ethischen Richtlinien, der Richtlinie 86/609/EG der Europäischen Union und der Empfehlung der Kommission der Europäischen Gemeinschaften 2007/526/EG.

1. Vorbereitung von Medien zur Eizellmanipulation

1. Bereiten Sie das Medium für den Transport der gesammelten Eierstöcke vor, indem Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung von Dulbecco mit 0,1 g / L Penicillin und 0,1 g / L Streptomycin (PBS) ergänzen.
2. Bereiten Sie das Medium für die Eizellentnahme und -reifung vor, indem Sie 9,5 g Tissue Culture Medi....

Ergebnisse

Die Kryotoleranz von Eizellen von juvenilen Spenderinnen ist im Vergleich zu erwachsenen niedriger. Der erste beobachtete Effekt ist eine niedrigere Überlebensrate nach der Erwärmung im Vergleich zu adulten Eizellen (Abbildung 1A; χ² Test P<0,001). Juvenile Eizellen zeigten nach der Erwärmung eine geringere Membranintegrität (Abbildung 1B). Die Verwendung von Trehalose im Reifemedium sollte überprüfen, ob dieser Zucker Kryoverletzungen in juvenilen.......

Diskussion

Die Kryokonservierung von Eizellen bei Haustieren kann nicht nur die langfristige Erhaltung weiblicher genetischer Ressourcen ermöglichen, sondern auch die Entwicklung embryonaler Biotechnologien vorantreiben. So würde die Entwicklung einer Standardmethode zur Vitrifikation von Eizellen sowohl der Nutztierhaltung als auch dem Forschungssektor zugute kämen. In diesem Protokoll wird eine vollständige Methode zur Vitrifikation von eizellten Erwachsenen schafen vorgestellt, die einen soliden Ausgangspunkt für die Entwicklung.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2′,7′-Dichlorfluorescindiacetat	Sigma-Aldrich	D-6883
Albumin Rinderfraktion V, proteasefrei	Sigma-Aldrich	A3059
Bisbenzimid H 33342 Trihydrochlorid (Hoechst 33342)	Sigma-Aldrich	14533
Calciumchlorid (CaCl2 2H20)	Sigma-Aldrich	C8106
Zitronensäure	Sigma-Aldrich	C2404
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Leica Microsystems GmbH,Wetzlar	TCS SP5 DMI 6000CS
Cryotop Kitazato	Medical Biological Technologies
Cysteamine	Sigma-Aldrich	M9768
D- (-) Fructose	Sigma-Aldrich	F0127
D(+)Trehalose Dehydr	Sigma-Aldrich	T0167
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438
Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich	D8537
Eigelb	Sigma-Aldrich	P3556
Ethylenglykol (EG)	Sigma-Aldrich	324558
FSH	Sigma-Aldrich	F4021
Glutaminsäure	Sigma-Aldrich	G5638
Glutaraldehyd	Sigma-Aldrich	G5882
Glycerin	Sigma-Aldrich	G5516
Glycin	Sigma-Aldrich	G8790
Heparin	Sigma-Aldrich	H4149
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Hypoutarin	Sigma-Aldrich	H1384
Inverses Mikroskop	Diaphot, Nikon
L-Alanin	Sigma-Aldrich	A3534
L-Arginin	Sigma-Aldrich	A3784
L-Asparagin	Sigma-Aldrich	A4284
L-Asparaginsäure	Sigma-Aldrich	A4534
L-Cystein	Sigma-Aldrich	C7352
L-Cystin	Sigma-Aldrich	C8786
L-Glutamin	Sigma-Aldrich	G3126
LH	Sigma-Aldrich	L6420
L-Histidin	Sigma-Aldrich	H9511
L-Isoleucin	Sigma-Aldrich	I7383
L-Leucin	Sigma-Aldrich	L1512
L-Lysin	Sigma-Aldrich	L1137
L-Methionin	Sigma-Aldrich	M2893
L-Ornithin	Sigma-Aldrich	O6503
L-Phenylalanin	Sigma-Aldrich	P5030
L-Prolin	Sigma-Aldrich	P4655
L-Serin	Sigma-Aldrich	S5511
L-Tyrosin	Sigma-Aldrich	T1020
L-Valin	Sigma-Aldrich	V6504
Magnesiumchlorid-Heptahydrat (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Makler Zählkammer	Sefi-Medical Instruments ltd. Biosigma S.r.l.
Medium 199	Sigma-Aldrich	M5017
Mineralöl	Sigma-Aldrich	M8410
MitoTracker Rot CM-H2XRos	ThermoFisher	M7512
Neugeborenes Kälberserum hitzeinaktiviert (FCS)	Sigma-Aldrich	N4762
Penicillin G Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3032
Phenolrot	Sigma-Aldrich	P3532
Polyvinylalkohol (87-90% hydrolysiert, durchschnittliches Molgewicht 30.000-70.000)	Sigma-Aldrich	P8136
Kaliumchlorid (KCl)	Sigma-Aldrich	P5405
Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Propidiumiodid	Sigma-Aldrich	P4170
Schafserum	Sigma-Aldrich	S2263
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2202
Natriumbicarbonat (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Natriumchlorid (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Natrium-dl-Lactatlösungssirup	Sigma-Aldrich	L4263
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich	P2256
Spermienklassen-Analysator	Microptic S.L.	S.C.A. v 3.2.0
Statistische Software Minitab 18.1	2017 Minitab
Stereomikroskop	Olimpus	SZ61
Streptomycinsulfat	Sigma-Aldrich	S9137
Taurin	Sigma-Aldrich	T7146
TRIS	Sigma-Aldrich	15.456-3