Method Article

CcCIPK14 Genfunktionsanalyse zur Aufklärung des effizienten wurzeltransgenen Systems

DOI:

10.3791/62304

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September 23rd, 2021

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1College of Forestry, Beijing Forestry University, 2Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing Forestry University

In This Article

Summary

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Hier wird ein effizientes und stabiles Transformationssystem für die funktionelle Analyse des CcCIPK14-Gens als Beispiel vorgestellt, das eine technische Grundlage für die Untersuchung des Metabolismus von Nicht-Modellpflanzen bietet.

Abstract

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Ein effizientes und stabiles Transformationssystem ist von grundlegender Bedeutung für die Erforschung der Genfunktion und die molekulare Züchtung von Pflanzen. Hier beschreiben wir die Verwendung eines Agrobacterium rhizogenes-vermittelten Transformationssystems auf Taubenerbsen. Der Stängel ist mit A. rhizogenes infiziert, die einen binären Vektor tragen, der nach 7 Tagen Kallus und 14 Tage später Adventivwurzeln induzierte. Die erzeugte transgene Haarwurzel wurde durch morphologische Analyse und ein GFP-Reportergen identifiziert. Um den Anwendungsbereich dieses Systems weiter zu veranschaulichen, wurde CcCIPK14 (Calcineurin B-like protein-interacting protein kinases) mit dieser Transformationsmethode in Taubenerbse transformiert. Die transgenen Pflanzen wurden mit Jasmonsäure (JA) bzw. Abscisinsäure (ABA) behandelt, um zu testen, ob CcCIPK14 auf diese Hormone anspricht. Die Ergebnisse zeigten, dass (1) exogene Hormone das Expressionsniveauvon CcCIPK14 signifikant hochregulieren können, insbesondere in Pflanzen mit CcCIPK14-Überexpression (OE); (2) der Gehalt an Genistein in den CcCIPK14-OE-Linien war signifikant höher als bei der Kontrolle; (3) Das Expressionsniveau von zwei nachgeschalteten Schlüsselgenen der Flavonoidsynthase, CcHIDH1 und CcHIDH2, wurde in den CcCIPK14-OE-Linien hochreguliert; und (4) das transgene System der Haarwurzel kann verwendet werden, um metabolisch funktionelle Gene in Nicht-Modellpflanzen zu untersuchen.

Introduction

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Die Transformation ist ein grundlegendes Instrument, um die Expression exogener Gene zu bewerten 1,2. Viele biologische Aspekte von Ressourcenpflanzen sind allen Pflanzen gemeinsam; daher können funktionelle Studien bestimmter Gene an Modellpflanzen (wie z.B. Arabidopsis) durchgeführt werden3. Dennoch sind viele Gene in Pflanzen in ihren Funktions- und Expressionsmustern einzigartig und erfordern Studien an ihren eigenen oder eng verwandten Arten, insbesondere für Ressourcenpflanzen 3,4....

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Protocol

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HINWEIS: Die Taubenerbse ist eine diploide Hülsenfrucht, die zur Familie der Fabaceae gehört. Die in diesem Experiment verwendeten Taubenerbsensamen stammen von der Northeast Forestry University in China und haben den Code 87119. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind in Abbildung 1A dargestellt. Die Inkubation des Sämlings wurde in einer Umgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit bei 25 °C unter Leuchtstofflampen bei 50 μmol Photonen pro m-2 s-1 in einer 16-stündigen Photoperiode durchgeführt. A. rhizogenes Stämme K599 (NCPPB2659) wurden im Labor konserviert. Sie....

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Results

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A. rhizogenes -vermittelte haarige Wurzeltransformation auf Taubenerbse
In dieser Studie wurden die Schritt-für-Schritt-Protokolle für die genetische Transformation von Haarwurzeln beschrieben, die durch A. rhizogenes vermittelt wird, was im Bereich der Pflanzenmoleküle von Bedeutung ist. Es dauerte etwa 5 Wochen, bis aus den Wurzeln von Taubenerbsen, die mit A. rhizogenes infiziert waren, behaarte Wurzeln gewonnen wurden.

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Discussion

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Die schnelle Charakterisierung der Genfunktion ist das gemeinsame Ziel bei der Erforschung der meisten Arten und besonders wichtig für die Entwicklung von Ressourcenpflanzen. Die A. rhizogenes-vermittelte Transformation ist in der Haarwurzelkultur weit verbreitet. Die Haarwurzelkultur (HRC) spielt als einzigartige Quelle für die Metabolitenproduktion eine zentrale Rolle beim Metabolic Engineering18,28. Die Anwendung dies.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Acknowledgements

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Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch die National Natural Science Foundation of China (31800509, 31922058), den Outstanding Young Talent Fund in der Beijing Forestry University" (2019JQ03009), die Fundamental Research Funds for the Central Universities (2021ZY16), die Beijing Municipal Natural Science Foundation (6212023) und das National Key R&D Program of China (2018YFD1000602,2019YFD1000605-1) und das Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design. Ich möchte mich bei Zhengyang Hou für seine Anleitung beim Schreiben des Artikels und bei Professor Meng Dong für seine Anleitung zur Idee....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1 mL qPCR 8-Streifen-Röhrchen (mit optischen Kappen)KIRGEN, Shanghai, ChinaKJ2541
ABASolarbio Life Science, Peking, ChinaA8060
AgarpulverSolarbio Life Science, Peking, ChinaA8190
ZentrifugeOsterode am Harz, Deutschlandd37520
CFX Connect TW OptikmodulBio-rad, USA1855200
Inkubator mit konstanter TemperaturShanghai Boxun Industry & Commerce Co., Ltd, Shanghai, ChinaBPX-82
Einweg-PetrischaleCorning, US
TrockenbadGingko Bioscience Company / Coyote Bioscience, ChinaH2H3-100C
Eastep Total RNA Extraction Kit50Promega, Peking, ChinaLS1030
Elektronische WaageTianjin, ChinaTD50020
Filter papeHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd, China
FiveEasy PlusMettler Toledo, Shanghai, China30254105
Blumentopf 9*9China
JASolarbio Life Science, Peking, ChinaJ8070
KanSolarbio Life Science, Peking, ChinaK8020
MagicSYBR MischungCWBIO, Peking, China
Mini-MikrozentrifugeScilogex, Peking, ChinaS1010E
NaClSolarbio Life Science, Peking, ChinaS8210
NanPhotometer N50 TouchIMPLEN GMBH, DeutschlandT51082
Purelab untra
RifampicinSolarbio Life Science, Peking, ChinaR8010
Sämlingskasten 30*200China
Thermal  Cycler  PCRBio-rad, UST100
ThermostatoszillatorBeijing donglian Har lninstrument Manufacture Co., Ltd, ChinaDLHE-Q200
Tomy AutoklavTomy, JapanSX-500
TryptonSolarbio Life Science, Peking, ChinaLP0042
UEIris II RT-PCR System für die Erststrang-cDNA-Synthese (mit dsDNase)US Everbright INC, Jiangsu, ChinaR2028
Hefeextrakt PulverSolarbio Life Science, Peking, ChinaLP0021
CW3008M

References

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  1. Poland, J. A., Rife, T. W. Genotyping-by-sequencing for plant breeding and genetics. The Plant Genome. 5 (3), (2012).
  2. Barabaschi, D., et al. Next generation breeding. Plant Science. 242, 3-13 (2016).
  3. Petri, C., Webb, K., Hily, J. -M., Dardick, C., Scorza, R.

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CcCIPK14 GeneHairy Root TransformationAgrobacterium RhizogenesPigeon PeaTransgenic Hairy RootGene Function AnalysisJasmonic Acid TreatmentAbscisic Acid ResponseFlavonoid Synthase GenesGenistein Content
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