Method Article

Mikrokristall-Elektronenbeugung kleiner Moleküle

DOI:

10.3791/62313

⸱

March 15th, 2021

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California Los Angeles, 3Department of Physiology, University of California Los Angeles

In This Article

Summary

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Hier beschreiben wir die in unserem Labor entwickelten Verfahren zur Herstellung von Pulvern aus niedermolekularen Kristallen für Mikrokristall-Elektronenbeugungsexperimente (MicroED).

Abstract

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Ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von niedermolekularen Proben für Mikrokristall-Elektronenbeugungsexperimente (MicroED) wird beschrieben. MicroED wurde entwickelt, um Strukturen von Proteinen und kleinen Molekülen mit Standard-Kryomikroskopiegeräten (Kryo-EM) zu lösen. Auf diese Weise wurden in jüngster Zeit kleine Moleküle, Peptide, lösliche Proteine und Membranproteine mit hoher Auflösung bestimmt. Hier werden Protokolle für die Herstellung von Gittern aus niedermolekularen Arzneimitteln am Beispiel des Medikaments Carbamazepin vorgestellt. Protokolle für das Screening und die Datenerfassung werden vorgestellt. Weitere Schritte im Gesamtprozess, wie z.B. Datenintegration, Strukturbestimmung und Verfeinerung, werden an anderer Stelle vorgestellt. Die Zeit, die für die Präparation der niedermolekularen Gitter benötigt wird, wird auf weniger als 30 Minuten geschätzt.

Introduction

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Die Mikrokristall-Elektronenbeugung (MicroED) ist eine elektronenkryomikroskopische Methode (Kryo-EM) zur Bestimmung von Strukturen mit atomarer Auflösung aus Kristallen im Submikrometerbereich 1,2. Kristalle werden auf Standardgitter des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) aufgebracht und eingefroren, indem sie entweder in flüssiges Ethan oder flüssigen Stickstoff getaucht werden. Die Gitter werden dann in ein TEM geladen, das bei kryogenen Temperaturen arbeitet. Die Kristalle befinden sich auf dem Gitter und werden auf die anfängliche Beugungsqualität geprüft. Kontinuierliche Rotation MicroED-Daten werde....

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Protocol

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1. Vorbereitung von niedermolekularen Proben

  1. Übertragen Sie eine kleine Menge (0,01 - 1 mg) Pulver, Flüssigkeit oder Feststoffe in eine kleine Durchstechflasche oder ein Röhrchen.
  2. Bei Proben, die bereits in Pulverform vorliegen, verschließen Sie das Röhrchen mit der Kappe, bis die Probe benötigt wird. Trocknen Sie die flüssigen Proben zu Pulvern, bevor Sie mit Methode 1 (Schritt 3) oder 2 (Schritt 4) versuchen.
    Anmerkungen: Für Proben, die in Flüssigkeit aufgelöst sind, kann die nachstehende Methode 3 (5.X) verwendet werden

2. Vorbereiten von TEM-Gittern

HINWEIS: Bei einigen TEMs mit Au....

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Results

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MicroED ist eine Kryo-EM-Methode, die die starken Wechselwirkungen zwischen Elektronen und Materie nutzt, was die Untersuchung verschwindend kleiner Kristalle ermöglicht12,13. Nach diesen Schritten wird erwartet, dass ein Beugungsfilm im kristallographischen Format aus Mikrokristallen gesammelt wird (Film 1). Hier wird die Technik anhand von Carbamazepin12 demonstriert. Die Ergebnisse zeigen einen MicroED-Datensatz mit kon.......

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Discussion

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Die Probenvorbereitung ist in der Regel ein iterativer Prozess, bei dem nach Screening- und Datenerfassungssitzungen Optimierungen vorgenommen werden. Bei niedermolekularen Proben ist es oft ratsam, zunächst eine Gitterpräparation zu versuchen, ohne die Gitter zu entladen, da viele Arzneimittel dazu neigen, hydrophobzu sein 10,11. Wenn die Gitter zu wenige nanokristalline Ablagerungen aufweisen, ist es eine gute Idee, es nach der ersten Glimmentladung der Gitter .......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Das Gonen-Labor wird mit Mitteln des Howard Hughes Medical Institute unterstützt. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health P41GM136508 unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1-1,5 mL Eppendorf RöhrchenFisher Scientific14-282-300Jedes Fläschchen oder Röhrchen ist geeignet.
Autogrid-ClipsThermo-Fisher1036173Clipped-Gitter sind für MicroED nicht erforderlich. Sie sind für Thermo-Fisher TEM erforderlich, die mit einem Autoloader-System ausgestattet sind.
Autogrid C-RingeThermo-Fisher1036171
CarbamazapinSigmaC4024-1Gdiese Experimente reicht jede beliebige Menge aus
CMOS-basierter DetektorThermo-FisherCetaD 16MWir haben einen CetaD 16M verwendet, aber jeder Detektor mit Rolling-Shutter-Modus oder ausreichend schneller Auslesung ist akzeptabel.
Delphi-SoftwareThermo-FisherN/ASoftware auf Thermo-Fisher TEM-Systemen, die eine manuelle Drehung des Probentisches ermöglicht
EPU-D-SoftwareThermo-FisherN/AKommerzielle Software für die Erfassung von MicroED-Daten
Objektträger mit GlasabdeckungHamptonHR3-231
GlühentladungPelcoeasiGlow
HochpräzisionPinzetteEMS78325-ACJede hochpräzise Pinzette ist geeignet
FlüssigstickstoffgefäßSpear LabFD-800Ein Standard-Schaumgefäß für die Handhabung von Proben unter flüssigem Stickstoff - 800mL
SerialEM SoftwareUC BoulderN/AKostenlose Software, vertrieben von D. Mastronarde. Abteilung für Molekular-, Zell- und Entwicklungsbiologie
TEM-GitterQuantifoil/EMSQ310CMAMulti-A 300 Mesh-Gitter wurden hier verwendet, aber alle dünnen Kohlenstoffgitter funktionieren. Für diese kleinen Moleküle empfehlen wir, mit kontinuierlichem Kohlenstoff zu beginnen.
Transmissionselektronenmikroskop (TEM)Thermo-FisherTalos Arctica
Whatman zirkuläres FilterpapierMillipore-SigmaWHA100109090 mm oder größer
Für

References

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  1. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).
  2. Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data ....

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