Method Article

Mikrokristall-Elektronenbeugung kleiner Moleküle

DOI:

10.3791/62313

⸱

March 15th, 2021

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California Los Angeles, 3Department of Physiology, University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir die in unserem Labor entwickelten Verfahren zur Herstellung von Pulvern aus niedermolekularen Kristallen für Mikrokristall-Elektronenbeugungsexperimente (MicroED).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von niedermolekularen Proben für Mikrokristall-Elektronenbeugungsexperimente (MicroED) wird beschrieben. MicroED wurde entwickelt, um Strukturen von Proteinen und kleinen Molekülen mit Standard-Kryomikroskopiegeräten (Kryo-EM) zu lösen. Auf diese Weise wurden in jüngster Zeit kleine Moleküle, Peptide, lösliche Proteine und Membranproteine mit hoher Auflösung bestimmt. Hier werden Protokolle für die Herstellung von Gittern aus niedermolekularen Arzneimitteln am Beispiel des Medikaments Carbamazepin vorgestellt. Protokolle für das Screening und die Datenerfassung werden vorgestellt. Weitere Schritte im Gesamtprozess, wie z.B. Datenintegration, Strukturbestimmung und Verfeinerung, werden an anderer Stelle vorgestellt. Die Zeit, die für die Präparation der niedermolekularen Gitter benötigt wird, wird auf weniger als 30 Minuten geschätzt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Mikrokristall-Elektronenbeugung (MicroED) ist eine elektronenkryomikroskopische Methode (Kryo-EM) zur Bestimmung von Strukturen mit atomarer Auflösung aus Kristallen im Submikrometerbereich 1,2. Kristalle werden auf Standardgitter des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) aufgebracht und eingefroren, indem sie entweder in flüssiges Ethan oder flüssigen Stickstoff getaucht werden. Die Gitter werden dann in ein TEM geladen, das bei kryogenen Temperaturen arbeitet. Die Kristalle befinden sich auf dem Gitter und werden auf die anfängliche Beugungsqualität geprüft. Kontinuierliche Rotation MicroED-Daten werden von einer Teilmenge der geschirmten Kristalle gesammelt, wo die Daten mit einer schnellen Kamera als Filmgespeichert werden 3. Diese Filme werden in ein kristallographisches Standardformat konvertiert und nahezu identisch wie ein Röntgenkristallographie-Experimentverarbeitet 4.

MicroED wurde ursprünglich entwickelt, um Protein-Mikrokristallezu untersuchen 1,2. Ein Engpass in der Proteinkristallographie ist die Züchtung großer, wohlgeordneter Kristalle für herkömmliche Synchrotron-Röntgenbeugungsexperimente. Da Elektronen mit Materie wechselwirken, die um Größenordnungen stärker ist als Röntgenstrahlung, sind die Grenzen der Kristallgröße, die erforderlich ist, um eine nachweisbare Beugung zu erzeugen,erheblich geringer 5. Darüber hinaus ist das Verhältnis von elastischen zu inelastischen Streuereignissen für Elektronen günstiger, was darauf hindeutet, dass mit einer geringeren Gesamtexposition nützlichere Daten gesammelt werden können5. Ständige Weiterentwicklungen haben es ermöglicht, MicroED-Daten von den anspruchsvollsten Mikrokristallen zu sammeln 6,7,8,9.

Kürzlich hat sich gezeigt, dass MicroED ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bestimmung der Strukturen von niedermolekularen Pharmazeutika aus scheinbar amorphen Materialien ist10,11,12,13. Diese Pulver können direkt aus einer Flasche mit gekauftem Reagenz, einer Reinigungssäule oder sogar aus dem Zerkleinern einer Pille zu einem feinen Pulverstammen 10. Diese Pulver erscheinen auf den ersten Blick amorph, können aber entweder vollständig aus Nanokristallen bestehen oder nur Spuren nanokristalliner Ablagerungen in einer größeren nichtkristallinen, amorphen Fraktion enthalten. Das Auftragen des Materials auf das Gitter ist einfach, und die nachfolgenden Schritte der Kristallidentifikation, des Screenings und der Datenerfassung könnten in naher Zukunft sogar automatisiert werden14. Während andere andere Methoden zur Probenvorbereitung und Datenerfassung verwenden, werden hier die Protokolle, die im Gonen-Labor entwickelt und verwendet werden, um Proben kleiner Moleküle für die Mikro-ED und für die Datenerfassung vorzubereiten, detailliert beschrieben.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung von niedermolekularen Proben

  1. Übertragen Sie eine kleine Menge (0,01 - 1 mg) Pulver, Flüssigkeit oder Feststoffe in eine kleine Durchstechflasche oder ein Röhrchen.
  2. Bei Proben, die bereits in Pulverform vorliegen, verschließen Sie das Röhrchen mit der Kappe, bis die Probe benötigt wird. Trocknen Sie die flüssigen Proben zu Pulvern, bevor Sie mit Methode 1 (Schritt 3) oder 2 (Schritt 4) versuchen.
    Anmerkungen: Für Proben, die in Flüssigkeit aufgelöst sind, kann die nachstehende Methode 3 (5.X) verwendet werden

2. Vorbereiten von TEM-Gittern

HINWEIS: Bei einigen TEMs mit Autoloader-Systemen müssen die Gitter vor dem Laden in die TEM-Säule abgeschnitten und in eine Kassette gelegt werden. Beim Clipping wird das 3-mm-TEM-Gitter physisch in einem Metallring befestigt, den der Autoloader manipulieren kann. Dieser Schritt und die folgenden Schritte können entweder mit normalen TEM-Gittern oder mit beschnittenen TEM-Gittern durchgeführt werden. Bei diesen Experimenten ist es oft einfacher, die Raster zu manipulieren, wenn sie im Voraus beschnitten wurden.

  1. Wickeln Sie Plastikfolie um ein Ende einer Glasabdeckung.
  2. Legen Sie die TEM-Gitter mit der Carbonseite nach oben auf die Folie auf der Oberseite des Deckschlittens. Identifiziere die beiden Seiten des Gitters unter einer Lampe. Die Kupferseite glänzt und erscheint metallisch, während die Carbonseite eine triste, braune Farbe hat (Abbildung 1C,D). Bei geclippten Gittern sollte die Carbonseite zur flachen Fläche des Cliprings zeigen.
  3. Legen Sie den Objektträger mit Gittern in die Glühentladungskammer. Glow entlädt die Deckseite für ca. 30 s mit der negativen Einstellung bei 15 pA. Bewahren Sie die Gitter auf dem Deckobjektträger in einer mit Filterpapier ausgelegten Glas-Petrischale auf, bevor Sie die Probe in die Gitter geben.

3. Auftragen der Probe auf Gitter durch Erzeugen eines homogenen feinen Pulvers (Methode 1)

  1. Entfernen Sie ein glimmentladenes TEM-Gitter mit einer Pinzette von der abgedeckten Petrischale. Legen Sie das Gitter mit der Kohleseite nach oben auf ein kreisförmiges Filterpapier.
  2. Entfernen Sie mit einem kleinen Spatel einen sehr kleinen Messlöffel Pulver (ca. 0,1 mg) und legen Sie ihn auf ein kleines, quadratisches Glasdeckglas direkt neben dem TEM-Gitter auf dem Filterpapier. Legen Sie einen weiteren kleinen quadratischen Glasschieber oder Deckglas auf das Pulver.
  3. Reiben Sie die beiden Glasobjektträger vorsichtig mit den Fingern aneinander, um ein feines Pulver herzustellen.
  4. Winkeln Sie die Deckgläser an und positionieren Sie sie knapp über dem TEM-Gitter auf dem Filterpapier und reiben Sie die Deckgläser nur wenige cm über dem glimmentladenen TEM-Gitter weiter aneinander (Abbildung 1).
  5. Beobachte, ob das Pulver in Richtung des Gitters fällt. Decken Sie das fein gemahlene Pulver auf, indem Sie eines der beiden Glasdeckgläser entfernen. Bürsten Sie das feine Pulver vorsichtig mit einem Stück Filterpapier vom Deckglas auf das TEM-Gitter (Abbildung 1).

4. Auftragen der Probe auf Gitter durch Anwendung der "Schüttel"-Methode (Methode 2)

  1. Nehmen Sie mit einer Pinzette ein Gitter und lassen Sie es in das Fläschchen oder die Tube mit der Pulverprobe fallen. Verschließen Sie die Durchstechflasche mit der Plastikkappe, um sicherzustellen, dass beim Schütteln kein Material austritt.
  2. Nehmen Sie die Durchstechflasche in die Hand und schütteln Sie die Durchstechflasche so, dass sich sowohl das Pulver als auch das Gitter für ca. 10 - 30 s bewegen.
  3. Entleeren Sie den Inhalt der Durchstechflasche auf ein kreisförmiges Filterpapier. Fassen Sie das Gitter an einer Kante und klopfen Sie vorsichtig auf die Gitterkante des Filterpapiers, um überschüssiges Material vom Gitter zu entfernen.
    HINWEIS: Abhängig von der Art der Durchstechflasche und der Größe kann man auch eine Pinzette verwenden, um das TEM-Gitter zu entfernen, ohne den Inhalt zu entleeren.

5. Aufbringen der Probe auf Gitter mit der Verdampfungsmethode (Methode 3)

  1. Legen Sie ein Gitter (abgeschnitten oder nicht) mit der Kohleseite nach oben und der Kupferseite nach unten auf die Mitte eines kreisförmigen Stücks Filterpapier.
  2. Tragen Sie mit einer gasdichten 10-μl-Spritze einen kleinen Tropfen (ca. 1 - 3 μl) der gelösten Verbindung auf die Kohlenstoffseite des Gitters auf.
  3. Bewegen Sie das Filterpapier mit den Gittern vorsichtig in eine Vakuumtrocknungskammer. Decken Sie die Kammer ab und schalten Sie den Staubsauger ein. Lassen Sie die Gitter bis zu einem Tag unter Vakuum trocknen.
  4. Schalten Sie das Vakuum aus und lassen Sie die Kammer 5 Minuten lang entlüften. Durch das Entlüften der Kammer wird verhindert, dass sich die Gitter bewegen oder wegfliegen, wenn sie nicht abgedeckt wird.

6. Einfrieren und Laden von Gittern in das TEM

  1. Fassen Sie den Rand des TEM-Gitters mit einer Pinzette und achten Sie darauf, dass die Spitzen keines der Gitterquadrate durchstechen. Heben Sie das Gitter 1 - 2 cm über das Filterpapier an und winkeln Sie das Gitter im 90°-Winkel zum darunter liegenden Papier an. Klopfen Sie vorsichtig auf die Pinzette, während Sie das Gitter fest zupfen, um loses Puder zu entfernen.
  2. Frieren Sie das Gitter ein, indem Sie die Spitze der Pinzette mit dem Gitter von Hand direkt in einen Behälter für flüssigen Stickstoff bewegen. Dieser Behälter ist in der Regel die Gitterladestation für das TEM, kann aber auch jeder sichere Behälter, wie z. B. eine sichere Thermoskanne mit flüssigem Stickstoff, für den Transfer oder die Lagerung geeignet sein. Flüssiger Stickstoff hat -196 °C.
  3. Warten Sie, bis das Gitter und die Pinzette aufhören zu kochen, bevor Sie weitere Manipulationen vornehmen.
  4. Legen Sie das Gitter unter flüssigem Stickstoff oder in Stickstoffdämpfen so in den Probenhalter, dass die Kohlenstoffseite so ausgerichtet ist, dass die Probe vor der Kohlenstoffträgerfolie vom Strahl getroffen wird.
  5. Legen Sie den Probenhalter in das TEM und stellen Sie sicher, dass das Gitter jederzeit auf Flüssigstickstofftemperatur gehalten wird.
    1. Legen Sie bei Autoloader-Systemen die abgeschnittenen Gitter in eine Kassette in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Behälter. Diese Kassette wird in einen Transportbehälter überführt, der es der Autoloader-Robotik ermöglicht, die Kassette aufzunehmen, während die Proben sicher für den Transport zwischen dem Autoloader und der Säule aufbewahrt werden.
    2. Befestigen Sie das Gitter bei TEM-Setups mit seitlichem Eingang an einem handelsüblichen TEM-Halter mit seitlichem Eingang. Diese Halter verfügen über einen Probenvorbereitungsbehälter, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist, um eine Übertragung des Gitters auf den Halter zu ermöglichen, ohne die Probe zu erwärmen. Der Side-Entry-Halter wird direkt in das TEM eingeführt, wobei die Probe am Ende gesichert ist.

7. Sammeln von MicroED-Daten

  1. Lokalisieren und Screening von Nanokristallen
    1. Öffnen Sie die TEM-Säulenventile. Stellen Sie die Vergrößerung mit den Handpulten auf die geringstmögliche Vergrößerung ein. Finden Sie den Strahl, indem Sie den Intensitätsregler an den Handpulten so einstellen, dass ein runder, heller Bereich auf dem fluoreszierenden Bildschirm sichtbar ist.
    2. Nehmen Sie einen Rasteratlas mit geringer Vergrößerung (50 - 300x) mit geeigneter Software14, 15 und 16 auf (Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop sowohl für die Bildgebung mit niedriger als auch für die hohe Vergrößerung gut ausgerichtet ist, bevor Sie hochauflösende MicroED-Daten erfassen.
    3. Identifizieren Sie Gitterquadrate ohne gebrochenen Kohlenstoff und ein sichtbares schwarzes oder dunkles Material/Körner auf der Folie (Abbildung 2). Navigieren Sie durch das Gitter, entweder physisch mit dem Joystick auf den Handfeldern oder virtuell auf dem gesammelten Atlas, um nach Gitterquadraten zu suchen, die nicht zerbrochen sind und Mikrokristalle enthalten.
    4. Fügen Sie den Mittelpunkt jedes dieser Quadrate zu einer Liste von Rasterpositionen hinzu, die untersucht werden sollen. Diese Positionen können zu einem Notebook, in der Mikroskop-Benutzeroberfläche oder in der Mikroskop-Automatisierungssoftware hinzugefügt werden.
    5. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf 500-1.300x und passen Sie die euzentrische Höhe an jeder gespeicherten Rasterposition an und aktualisieren Sie den gespeicherten Z-Wert auf die in 7.1.4 angegebenen Positionen.
    6. Suchen Sie entweder auf dem fluoreszierenden Bildschirm oder auf einer schnellen Kamera mit dieser höheren Vergrößerung nach kleinen schwarzen Flecken/Körnern auf dem Raster. Eine gute Probe mit oft scharfen Kanten bei hoher Vergrößerung, die auf kristalline Ordnung hindeuten.
    7. Bewegen Sie einen lokalisierten Potentialkristall in die Mitte des Bildschirms und erhöhen Sie die Vergrößerung so, dass das TEM in den Modus mit hoher Vergrößerung wechselt.
      HINWEIS: Dies wird bei verschiedenen Instrumenten entweder als Modus mit hoher Vergrößerung, Zoom2 oder SA bezeichnet und entspricht in der Regel Vergrößerungen von 3.000x oder höher.
    8. Fügen Sie eine ausgewählte Bereichsblende ein. Ändern Sie die Blende auf eine größere oder kleinere Größe, um sicherzustellen, dass der ausgewählte Bereich gerade größer als der Kristall ist (Abbildung 3).
    9. Wechseln Sie in den Beugungsmodus, indem Sie die Beugungstaste an den TEM-Handpaneelen drücken und sicherstellen, dass der Fluoreszenzschirm eingesetzt ist. Stellen Sie die Kameralänge mit dem Vergrößerungsknopf so ein, dass der Rand mindestens 1 Å Auflösung hat.
      HINWEIS: Die Kalibrierung der Beugungslängen sollte von einem Servicetechniker unter Verwendung eines Goldwaffelgitters oder einer bekannten Probe durchgeführt werden, bevor MicroED-Experimente durchgeführt werden.
    10. Stellen Sie den Beugungsfokus so ein, dass der zentrale Punkt so scharf und klein wie möglich ist. Bewegen Sie den zentralen Strahl mit den Beugungsverschiebungsknöpfen in die Mitte des Fluoreszenzschirms
    11. Setzen Sie den Balkenanschlag ein und stellen Sie sicher, dass sich der Balken dahinter befindet. Heben Sie den fluoreszierenden Bildschirm an. Nehmen Sie eine kurze Belichtungszeit (ca. 1 s) mit der Kamera auf (Abbildung 4).
    12. Prüfen Sie das entsprechende Beugungsmuster. Ein guter Kandidat für die Erfassung eines vollständigen Datensatzes hat scharfe Punkte, die regelmäßig in Spalten und Zeilen angeordnet sind, und die Beugung erstreckt sich über 2 Å, vorzugsweise mindestens auf 1 Å (Abbildung 4). Speichern Sie die Kristallkoordinaten entweder in der TEM-Benutzeroberfläche oder indem Sie sie aufschreiben.
    13. Wiederholen Sie das Beugungsscreening für alle potenziellen Kristalle, die auf dem aktuellen Gitterquadrat von Interesse sind.
  2. Datensammlung
    1. Zentrieren Sie einen abgeschirmten Kristall mit einer hohen Vergrößerung (> 1.000-fach) auf dem Bildschirm. Stellen Sie die euzentrische Höhe des Kristalls entweder mit einer automatischen Routine oder von Hand ein.
    2. Setzen Sie die gewählte Bereichsöffnung ein, die am besten zu der in 7.1.8 ermittelten Kristallgröße und -form passt (Abbildung 3). Kippen Sie den Tisch in die negative und positive Richtung, bis das Bild von den Rasterbalken verdeckt wird (Abbildung 3). Beachten Sie diese Winkel für die Datenerfassung.
    3. Bestimmen Sie die Anzahl der Frames, die erforderlich sind, um den gesamten Winkelkeil des Datasets zu überspannen. Typisch ist die Verwendung von 0,5 - 1,0° Keilen für jedes Bild, wobei die Bilder je nach Empfindlichkeit der Kamera alle 1 bis 5 Sekunden ausgelesen werden. Zum Beispiel würde ein Keil mit einer Spannweite von -30° bis +30°, der sich mit einer konstanten Geschwindigkeit von 1° s-1 dreht und ein Frame alle 1s ausgelesen wird, insgesamt 60 Frames erfordern.
    4. Unter Berücksichtigung des maximalen Gesamtneigungsbereichs von -72° bis +72° beginnen Sie mit der Drehung des Tisches mit einer konstanten Rate von 1° s-1 und beginnen Sie dann alle 1 Sekunde mit dem Auslesen der Daten auf einer modernen Kamera mit Rolling-Shutter-Auslesemodus (Film 1). Dieser Prozess kann manuell oder mit Hilfe von TEM-spezifischer Software durchgeführt werden.
      1. Stellen Sie die Rotationsrate ein, indem Sie den Prozentsatz der maximalen Neigungsgeschwindigkeit und den Zeitpunkt des Stopps in der Benutzeroberfläche des Mikroskops oder in einer speziellen Software angeben. In dieser Untersuchung wurde dieser Wert mit 0,3° s-1 pro % der maximalen Geschwindigkeit gemessen, muss aber für jedes Mikroskop unabhängig überprüft werden.
        HINWEIS: Die Neigungs- und Kameradatenerfassung werden hier unabhängig voneinander eingerichtet, aber Softwareprogramme14 können dies koordinieren, um den Vorgang zu vereinfachen.
      2. Verwerfen Sie in den meisten Fällen ca. 1° auf jeder Seite des angegebenen Keils als Totzeit, wenn der Tisch entweder hochfährt oder auf die gewünschte Drehzahl verlangsamt wird.
    5. Speichern Sie Daten in einer Vielzahl von Formaten, entweder als einzelne Bilder oder als Stapel von Bildern (Film 1).
    6. Konvertieren Sie diese Beugungsbilder in ein typisches kristallographisches Format mit MicroED-Werkzeugen - verfügbar hier (https://cryoem.ucla.edu). Beugungsbilder, die im SMV-Format gespeichert sind, können mit dokumentierter kristallographischer Software17,18 verarbeitet werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroED ist eine Kryo-EM-Methode, die die starken Wechselwirkungen zwischen Elektronen und Materie nutzt, was die Untersuchung verschwindend kleiner Kristalle ermöglicht12,13. Nach diesen Schritten wird erwartet, dass ein Beugungsfilm im kristallographischen Format aus Mikrokristallen gesammelt wird (Film 1). Hier wird die Technik anhand von Carbamazepin12 demonstriert. Die Ergebnisse zeigen einen MicroED-Datensatz mit kon...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Probenvorbereitung ist in der Regel ein iterativer Prozess, bei dem nach Screening- und Datenerfassungssitzungen Optimierungen vorgenommen werden. Bei niedermolekularen Proben ist es oft ratsam, zunächst eine Gitterpräparation zu versuchen, ohne die Gitter zu entladen, da viele Arzneimittel dazu neigen, hydrophobzu sein 10,11. Wenn die Gitter zu wenige nanokristalline Ablagerungen aufweisen, ist es eine gute Idee, es nach der ersten Glimmentladung der Gitter ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Gonen-Labor wird mit Mitteln des Howard Hughes Medical Institute unterstützt. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health P41GM136508 unterstützt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1-1,5 mL Eppendorf RöhrchenFisher Scientific14-282-300Jedes Fläschchen oder Röhrchen ist geeignet.
Autogrid-ClipsThermo-Fisher1036173Clipped-Gitter sind für MicroED nicht erforderlich. Sie sind für Thermo-Fisher TEM erforderlich, die mit einem Autoloader-System ausgestattet sind.
Autogrid C-RingeThermo-Fisher1036171
CarbamazapinSigmaC4024-1Gdiese Experimente reicht jede beliebige Menge aus
CMOS-basierter DetektorThermo-FisherCetaD 16MWir haben einen CetaD 16M verwendet, aber jeder Detektor mit Rolling-Shutter-Modus oder ausreichend schneller Auslesung ist akzeptabel.
Delphi-SoftwareThermo-FisherN/ASoftware auf Thermo-Fisher TEM-Systemen, die eine manuelle Drehung des Probentisches ermöglicht
EPU-D-SoftwareThermo-FisherN/AKommerzielle Software für die Erfassung von MicroED-Daten
Objektträger mit GlasabdeckungHamptonHR3-231
GlühentladungPelcoeasiGlow
HochpräzisionPinzetteEMS78325-ACJede hochpräzise Pinzette ist geeignet
FlüssigstickstoffgefäßSpear LabFD-800Ein Standard-Schaumgefäß für die Handhabung von Proben unter flüssigem Stickstoff - 800mL
SerialEM SoftwareUC BoulderN/AKostenlose Software, vertrieben von D. Mastronarde. Abteilung für Molekular-, Zell- und Entwicklungsbiologie
TEM-GitterQuantifoil/EMSQ310CMAMulti-A 300 Mesh-Gitter wurden hier verwendet, aber alle dünnen Kohlenstoffgitter funktionieren. Für diese kleinen Moleküle empfehlen wir, mit kontinuierlichem Kohlenstoff zu beginnen.
Transmissionselektronenmikroskop (TEM)Thermo-FisherTalos Arctica
Whatman zirkuläres FilterpapierMillipore-SigmaWHA100109090 mm oder größer
Für

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).
  2. Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
  3. Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
  4. Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
  5. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  6. Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109(2020).
  7. Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
  8. Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
  9. Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
  10. Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
  11. Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
  12. Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
  13. Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
  14. de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
  15. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  16. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  17. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  18. Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
  19. de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
  20. Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
  21. Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600(2014).
  22. Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microcrystal Electron DiffractionSmall Molecule StructureMicroED ProtocolElectron Cryo MicroscopyTEM Grid PreparationHigh Resolution StructureDiffraction Data CollectionCrystallographic SoftwareSample PreparationAtomic Resolution

Related Articles