Identifizierung der Bindungsproteine kleiner Liganden mit der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA)

Zusammenfassung

Der Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) kann verwendet werden, um kleine ligandenbindende Proteine eines Organismus unter Verwendung einer ORFeome-Bibliothek zu identifizieren.

Zusammenfassung

In den letzten zehn Jahren gab es enorme Fortschritte beim Verständnis kleiner Signalmoleküle in der bakteriellen Physiologie. Insbesondere die Zielproteine mehrerer nukleotid-abgeleiteter Sekundärbotenstoffe (NSMs) wurden systematisch identifiziert und in Modellorganismen untersucht. Diese Erfolge sind hauptsächlich auf die Entwicklung mehrerer neuer Techniken zurückzuführen, darunter die Capture-Compound-Technik und die differentielle radiale Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA), mit denen Zielproteine dieser kleinen Moleküle systematisch identifiziert wurden. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung der NSMs, Guanosinpenta- und Tetraphosphate (p)ppGpp, als Beispiel und Videodemonstration der DRaCALA-Technik. Unter Verwendung von DRaCALA wurden 9 von 20 bekannten und 12 neuen Zielproteinen von (p)ppGpp im Modellorganismus Escherichia coli K-12 identifiziert, was die Leistungsfähigkeit dieses Assays demonstriert. Prinzipiell könnte DRaCALA zur Untersuchung kleiner Liganden verwendet werden, die durch radioaktive Isotope oder Fluoreszenzfarbstoffe markiert werden können. Die kritischen Schritte, Vor- und Nachteile von DRaCALA werden hier für die weitere Anwendung dieser Technik diskutiert.

Einleitung

Bakterien verwenden mehrere kleine Signalmoleküle, um sich an sich ständig ändernde Umgebungen anzupassen^1,2. Zum Beispiel vermitteln die Autoinduzierer, N-Acylhomoserinlactone und ihre modifizierten Oligopeptide, die interzelluläre Kommunikation zwischen Bakterien, um das Populationsverhalten zu koordinieren, ein Phänomen, das als Quorum Sensing bekannt^{ist 2}. Eine weitere Gruppe kleiner Signalmoleküle sind die NSMs, darunter das umfassend untersuchte zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP), cyclisches Di-AMP, cyclisches Di-Guanosinmonophosphat (cyclisches Di-GMP) und Guanosin-P....

Protokoll

1. Herstellung von Ganzzelllysaten

1. Impfen Sie die E. coli K-12 ASKA ORFeome Collection Stämme¹⁵ in 1,5 ml Lysogeny Brühe (LB) mit 25 μg/ml Chloramphenicol in 96-Well-Tiefbrunnenplatten. Über Nacht (O/N) für 18 h bei 30 °C mit Schütteln bei 160 U/min wachsen. Am nächsten Tag isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) (letzte 0,5 mM) in die O/N-Kulturen geben, um die Proteinexpression bei 30 °C für 6 h zu induzieren.
2. Pelletzellen bei 500 x g für 10 min. Die Pellets bis zum Gebrauch bei -80 °C einfrieren. Um die Zellen zu lysieren, fügen Sie 150 μL Lysepuffer L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM_MgCl....

Ergebnisse

Das Befolgen des oben beschriebenen Protokolls führt in der Regel zu zwei Arten von Ergebnissen (Abbildung 3).

Abbildung 3A zeigt eine Platte mit relativ geringen Hintergrundbindungssignalen (Bindungsfraktionen < 0,025) aus der Mehrzahl der Vertiefungen. Das positive Bindungssignal der Bohrung H3 ergibt einen Bindungsanteil von ~0,35, der viel höher ist als der, der für die anderen Vertiefungen beobachtet wurde. Selbst ohne Quantif.......

Diskussion

Einer der kritischen Schritte bei der Durchführung eines DRaCALA-Screenings besteht darin, gute Lysate ganzer Zellen zu erhalten. Zunächst sollten die getesteten Proteine in großen Mengen und in löslichen Formen hergestellt werden. Zweitens sollte die Lyse der Zellen vollständig sein und die Viskosität des Lysats muss minimal sein. Die Einbeziehung von Lysozym und die Verwendung von drei Gefrier-Tau-Zyklen reichen oft aus, um Zellen vollständig zu lysieren. Die freigesetzte chromosomale DNA macht das Lysat jedoch viskos .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
32P-α-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 x Stiftwerkzeug	V& P Scientific	VP 404	96 Bolzenreplikator, auf 9 mm Zentren, 4,2 mm Bolzendurchmesser, 24 mm lange
96-Well-Mikrotiterplatte mit V-Boden	Sterilin	MIC9004	Sterilin Microplate V Well 611V96
Agar	OXOID - Thermo Fisher	LP0011	Agar Nr. 1
ASKA Sammelstamm	NBRP, SHIGEN, JAPAN		Ref: DNA Research, Band 12, Ausgabe 5, 2005, Seiten 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonase	SIGMA	E1014-25KU	gentechnisch veränderte Endonuklease aus Serratia marcescens
Bradford Protein Assay Farbstoff	Bio-Rad	5000006	Reagenzkonzentrat
DMSO	SIGMA	D8418	≥ 99,9%
DNase 1	SIGMA	DN25-1G
Gelfiltration 10x300 Säule	GE Healthcare	28990944	enthält 20% Ethanol als Konservierungsmittel
Glycerin	PanReac AppliChem	122329.1214	Glycerin 87% für die Analyse
Hyperkassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
Imidazol	SIGMA	56750	puriss. ≥ 99,5% (GC)
IP Speicher Phosphor Sieb	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20x 40
cm Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG)	SIGMA	I6758	Isopropyl β-D-Thiogalactosid
Lysogene Bouillon (LB)	Invitrogen - Thermo Fisher	12795027	Miller's LB Bouillon Base
Lysozym	SIGMA	L4949	aus Hühnereiweiß; BioUltra, lyophilisiertes Pulver, ≥ 98%
MgCl2 (Magnesiumchlorid)	SIGMA	208337
MilliQ Wasser			Reinstwasser
Mehrkanalpipette	Thermo Scientific	4661110	F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x Kanäle
NaCl	VWR Chemicals	27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30230
Nitrocellulose Blotting Membran	Amersham Protran	10600003	Premium 0,45 um 300 mm x 4 m
PBS	OXOID - Thermo Fisher	BR0014G	Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (Dulbecco A), Tabletten
PEG3350 (Polyethylenglykol 3350)	SIGMA	202444
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)	SIGMA	93482	Phenylmethansulfonylfluoridlösung - 0,1 M in Ethanol (T)
Phosphor-Imager	GE Healthcare	28955809	Typhoon FLA-7000 Phosphor-Imager
Pipettenspitzen, gefiltert	Thermo Scientific	94410040	ClipTip 12,5 μ l unsterile
Poly-Prep Chromatographie-Säule	Bio-Rad	7311550	Polypropylen-Chromatographie-Säule
Protease-Inhibitor Mini	Pierce	A32955	Tabletten, EDTA-freies
Schraubverschluss-Röhrchen	Thermo Scientific	3488	Mikrozentifugenröhrchen, 2,0 ml mit Schraubverschluss, unsterile
SLS 96-Deep Well Platten	Greiner	780285	MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Boden,
natürliche Spin-Säule	Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0,5 ml Zentrifugalfilter
	Thermomixer Eppendorf	5382000015	Thermomixer C
DC-Platte (PEI-Zellulose F DC-Platten)	Merck Millipore	105579	DC PEI-Zellulose F (20 x 20 cm)
Tris	SIGMA	BP152	Tris Base für Molekularbiologie
Tween 20	SIGMA	P1379	viskoses nichtionisches Waschmittel
β-Mercaptoethanol	SIGMA	M3148	99% (GC/Titration)